Received 2001-05-21Accepted 2001-07-19

*Corresponding author. Tel: +86-29-3374521, +86-29-3374574;

E-mail: mz_zhu@fmmu.edu.cn

生理学报, Feb. 2002, 54 (1): 7～11

Acta Physiologica Sinica

研究论文

血管钠肽对中度低氧诱导的心肌细胞蛋白合成有抑制作用

吕顺艳*, 朱妙章, 郭海涛, 于军, 魏启明

第四军医大学基础部生理学教研室, 西安 710032

摘要: 实验探讨了心房钠尿肽家族新成员血管钠肽 (vasonatrin peptide, VNP) 对中度低氧诱导的心肌细胞蛋白合成的影响。在培养的新生大鼠心肌细胞上,用四唑盐 (MTT) 比色实验、总蛋白含量测定和3H-亮氨酸掺入实验等方法观察细胞数和蛋白合成情况,并用放免法测定VNP对细胞内环鸟苷酸(cGMP)和环腺苷酸(cAMP)以及培养上清液中内皮素含量的影响,探讨VNP的作用机制。结果显示, 重度低氧24 h,心肌细胞数和蛋白合成均降低,而中度低氧显著增加蛋白的合成,具有促心肌细胞肥大的作用。VNP浓度依赖性地抑制中度低氧诱导的心肌细胞蛋白合成增加,并且升高细胞内cGMP水平,降低低氧诱导的培养上清液中内皮素的含量。结果提示: VNP抑制中度低氧诱导的新生大鼠心肌细胞蛋白合成增加,该作用与其升高细胞内cGMP浓度、降低低氧诱导的内皮素合成和/或释放增加有关。

关键词: 血管钠肽 (VNP); 低氧; 蛋白合成; 环腺苷酸; 环鸟苷酸; 内皮素; 心肌细胞

学科分类号: Q463; R364.4

Inhibition of moderate hypoxia-induced protein synthesis by vasonatrin

peptide in cultured neonatal rat cardiomyocytes

LU Shun-Yan*, ZHU Miao-Zhang, GUO Hai-Tao, YU Jun, WEI Qi-Ming

Department of Physiology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032

Abstract: The present work was to investigate the effects of vasonatrin peptide (VNP) on cardiomyocyte protein synthesis induced by moderate hypoxia. In cultured neonatal rat cardiomyocytes, MTT methods, total protein measurement and 3H-leucine incorporation were used to calculate the cell number and measure the protein synthesis of cardiomyocytes. Furthermore, radioimmunoassay was undertaken to observe the effects of VNP on the intracellular levels of cAMP, cGMP and the concentration of endothelin (ET) in the culture medium. The results showed that both the cell number and protein synthesis decreased with severe hypoxia for 24 h. In contrast, under moderate hypoxia, cardiomyocyte hypertrophy developed; the protein synthesis as evidenced by total protein content and 3H-eucine incorporation increased significantly. VNP reduced cardiomyocyte protein synthesis induced by moderate hypoxia in a dose-dependent manner. Furthermore, VNP increased the intracellular level of cGMP and decreased the concentration of ET in the culture medium under moderate hypoxia, but had no effect on the level of cAMP. These results suggest that VNP inhibits moderate hypoxia-induced protein synthesis in cultured neonatal rat cardiac myocytes. This effect is mediated, at least in part, by an increase in intracellular cGMP, a reduction in synthesis, and/or a release in ET of cardiomyocytes.

Key words: vasonatrin peptide (VNP)； hypoxia； protein synthesis； adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate (cAMP)； guanosine 3′,5′-cyclic monophosphate (cGMP)；endothelin； cardiomyocytes

低氧性心室肥厚常见于慢性缺血性心脏病, 虽然初期心肌肥厚是一种有益的代偿反应, 但持续性心肌肥厚最终可导致扩张性心肌病、心衰和猝死。关于低氧性心肌肥厚形成机制的研究, 以往主要集中于血流动力学负荷, 交感神经兴奋等间接因素。研究表明, 低氧能够通过调节生长因子、酶、应激蛋白等的基因表达, 调节细胞的生长和分化[1], 因此推测低氧在心肌细胞肥大的形成过程中可能存在直接作用。心房钠尿肽家族是由具有利钠、利尿和舒血管效应的一组多肽组成, 近年来该家族成员对心肌肥厚的负调控作用及其临床应用前景受到关注[2]。血管钠肽 (vasonatrin peptide, VNP) 是人工合成的心房钠尿肽家族新成员[3]。研究表明: VNP能防治低氧条件下大鼠肺动脉高压的形成和肺动脉平滑肌细胞的增殖, 降低肺动脉高压大鼠右心室重量 (反映右心室肥厚的指标)[4, 5]。VNP降低右室肥厚的作用, 除了通过降低后负荷的间接机制外, 是否有抑制心肌细胞生长的直接作用参与, 目前尚未见报道。因此, 本工作在培养的新生大鼠心肌细胞上, 排除机械负荷和神经体液等其它影响因素, 观察了中度和重度低氧对心肌细胞蛋白合成的直接作用, 并探讨了VNP抑制中度低氧诱导的心肌细胞蛋白合成的作用及机制。

1材料和方法

1.1 材料和试剂 SD乳鼠(1 ~ 2 d)由本校实验动物中心提供。胰蛋白酶、胶原酶、EDTA、DMEM干粉培养基和小牛血清购自Gibco公司；VNP由中国科学院上海生物化学研究所提供； 3H-TdR, 3H-亮氨酸购自中国科学院上海核技术开发公司；考马斯亮蓝G-250是华美生物工程公司产品；cAMP和cGMP放免检测试剂盒购自上海中医药大学；内皮素测定试剂盒购自301医院；DU600型可见光分光光度计和LS-6500液体闪烁计数器为美国Beckman公司产品。

1．2 心肌细胞培养1.3 低氧培养1.4 四唑盐(MTT)比色实验1.5 总蛋白含量测定1.6 3H-亮氨酸掺入量实验1.7 细胞内cAMP和cGMP水平测定1.8 培养上清中内皮素含量的测定1.9 统计学处理

2结果

2.1 不同程度低氧对培养新生大鼠细胞数及蛋白质合成的影响

重度低氧培养24 h后, 与对照组相比, 心肌细胞数、总蛋白含量、蛋白合成速率均显著降低, 心肌细胞MTT OD值降低22% , 总蛋白含量降低31.7% , 3H-亮氨酸掺入量降低29.8% 。而中度低氧培养, 24 h后蛋白合成显著增加, 与对照组相比, 总蛋白含量增加31.7% , 3H-亮氨酸掺入量增加26% , 但反映细胞数量变化的MTT OD值无显著改变(图1)。

2.2 VNP对中度低氧诱导的蛋白合成增加的抑制作用

图1.重度和中度低氧对培养新生大鼠心肌细胞MTT光吸收值、总蛋白含量和3H-亮氨酸掺入量的影响

Fig. 1.Effects of severe hypoxia (SH) and moderate hypoxia (MH) on MTT OD value, total protein and 3H-leucine (3H-leu) incorporation in cultured neonatal rat cardiomyocytes (n = 8).Con, control; SH, severe hypoxia for 24 h; MH, moderate hypoxia for 24 h. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group.

图2. VNP对中度低氧诱导的总蛋白含量和3H-亮氨酸掺入量的影响

Fig. 2.Effects of VNP on total protein and 3H-leucine (3H-leu) incorporation induced by moderate hypoxia in cultured neonatal rat cardiomyocytes (n= 8).*P<0.05 , **P<0.01 vs 0 concentration of VNP.

2.3 VNP对心肌细胞内cAMP、 cGMP水平的影响

图3.VNP对培养新生大鼠心肌细胞内cAMP和cGMP水平的影响

Fig. 3. Effects of VNP on intracellular cAMP and cGMP formation in cultured neonatal rat cardiomyocytes (n= 10). *Ｐ<0.05 , **P<0.01 vs 0 concentration of VNP.2.4 VNP对低氧诱导的心肌细胞培养上清液内皮素 (ET) 含量的影响

图4. VNP对中度低氧诱导的心肌细胞培养上清液中ET含量的影响

Fig. 4.Effects of VNP (10－７ mol/L) on endothelin contents induced by moderate hypoxia in the culture media of neonatal rat cardiomyocytes (n= 5). Con, control; MH, moderate hypoxia; MH + VNP, moderate hypoxia in the presence of 10－７ mol/L VNP. *P<0.05, **P<0.01 vs control group. ##P<0.01 vs MH group.

3讨论

在缺血性心肌病中, 心肌缺血的一个重要特点是: 缺血一般不是全心性的, 而是某支（或几支）冠脉支配的局部心肌的缺血, 且缺血的程度也不均一, 由于缺血的时间和程度不同, 心肌细胞发生代偿变化肥大或失代偿死亡[7]。由于在体研究中心肌细胞受到神经体液和机械刺激等多因素的作用, 作为心肌缺血后果的低氧本身对心肌细胞的影响还有待阐明。我们选用培养的新生大鼠心肌细胞, 排除了在体实验中多因素的影响。结果表明,中度低氧显著增加心肌细胞蛋白的合成, 重度低氧则产生细胞毒性作用, 使细胞数和蛋白合成均下降, 提示低氧应激本身对心肌细胞具有不依赖于机械负荷的作用。

VNP是心房钠尿肽 (atrial natriuretic peptide, ANP) 和C-型钠尿肽 (C-type natriuretic peptide, CNP) 的嵌合体, 结构上与它们有高度的同源性, 可能具有相似的受体及受体后作用机制[3]。心房钠尿肽家族的受体目前已知有A、B、C三种亚型, 而且都在心肌细胞上得到鉴定[8]。其中A、B受体是鸟苷酸环化酶 (GC) 耦联受体, 与配体结合后引起细胞内cGMP水平升高, 而C受体不与GC耦联。Knowles等的研究表明[9], A受体具有不依赖于压力负荷的直接的抗心肌细胞肥大作用。Kishimoto也在转基因鼠的实验中发现, A受体基因缺失鼠的心肌细胞体积明显增大[10]。VNP是否通过A受体介导其抑制蛋白合成的作用尚需直接的分子生物学研究依据。

实验中, VNP增加心肌细胞内cGMP水平, 而研究表明cGMP可抑制去甲肾上腺素对心肌细胞和心脏成纤维细胞的促生长作用[11]。 Ritchie等的研究亦表明[12], NO、缓激肽等能升高细胞内cGMP 水平的物质, 可抑制血管紧张素Ⅱ (AnⅡ) 诱导的心肌细胞肥大, 提示VNP抑制中度低氧的促心肌细胞肥大的作用可能与其升高细胞内cGMP水平有关。有研究表明, ANP升高细胞内cGMP水平与其激活丝裂原活化蛋白激酶级联反应中的ERK (extracellular signal-regulated protein kinase) 密切相关, 而ERK的激活对ANP抗心肌细胞肥大是必需的[13], 亦支持cGMP是介导心房钠尿肽家族成员抗心肌肥大作用的重要的细胞内第二信使。

局部体液因子在引起和维持心肌肥大中具有重要的作用, 内皮素 (ET) 是一种重要的促心肌肥大的体液因子。研究表明, 培养心肌细胞可合成大量的ET-1前体物质并能释放成熟的ET-1[14], 缺血/低氧可诱导ET-1的生成[15, 16], 提示ET参与低氧对心肌细胞的生物学作用。在心脏成纤维细胞的研究中发现, ANP和BNP可通过升高细胞内cGMP水平抑制AnⅡ等诱导的ET-1的表达[17], 从而抑制AnⅡ促成纤维细胞增殖的作用。为探讨VNP是否影响心肌细胞合成或/和释放ET, 本实验进一步观察了VNP对培养上清液中ET含量的影响, 结果表明， VNP显著降低中度低氧诱导的培养上清液中ET的含量。推测VNP抑制中度低氧诱导的心肌细胞蛋白合成的作用与其降低低氧诱导的培养上清液中ET-1的含量有关。我们还发现, 重度低氧培养的上清液中ET的水平 (结果中未显示) 亦显著升高, 可能由于重度低氧的毒性作用使细胞发生坏死和凋亡, 从而掩盖或抑制了内皮素的促肥大作用, 具体机制尚需进一步研究。综上, 中度低氧可诱导新生大鼠心肌细胞蛋白合成增加, VNP降低中度低氧的作用, 其作用机制与VNP升高心肌细胞内cGMP水平、抑制ET-1的合成和/或分泌有关。

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