Received
2001-02-05Accepted 2001-09-25
This work was
supported by the National Natural
Science Foundation of China (No.39970717)
*Corresponding
author. Tel: +86-10-66935272; Fax: +86-10-68131451； E-mail: yan301@263.net
生理学报, Feb. 2002,
54 (1): 28～32
Acta
Physiologica Sinica
研究论文
肠缺血/再灌注损伤后白介素1-β水平与磷脂酶A2激活的关系
颜光涛*, 郝秀华, 薛辉, 王录焕, 李英丽, 石丽萍
解放军总医院基础医学研究所生物化学研究室，北京 100853
摘要: 为了探讨肠缺血/再灌注损伤后IL-1β基因表达和蛋白含量变化与磷脂酶A2抑制之间的关系，采用大鼠肠缺血/再灌注损伤模型,
在对照组、损伤组和磷脂酶A2抑制剂处理组动物中收集血清、肺灌洗液、腹腔灌洗液及全身重要脏器组织样品, 采用放射免疫法测定IL-1β含量, 并用RT-PCR法测定肺组织中IL-1β和Ⅱ型PLA2基因表达。结果表明,
损伤后6 h血清中IL-1β含量明显高于对照组；损伤后1和3 h, 腹腔液中IL-1β也明显高于对照组；损伤后肝组织中IL-1β水平有明显增加，而肺、肾、肠组织中IL-1β没有明显变化。损伤后肺灌洗液中IL-1β也明显高于对照组水平,
肺组织中IL-1β mRNA表达增加, 而Ⅱ型PLA2 mRNA在损伤后表达反而有所下降。采用磷脂酶A2抑制剂氯喹、环氧化物酶抑制剂消炎痛、血小板活化因子受体阻断剂SR27417后,
IL-1β蛋白和基因表达有不同的改变。提示肠缺血/再灌注损伤后一定时间内, 肝内IL-1β mRNA表达和血中IL-1β水平明显增高, 但是否与磷脂酶A2激活或其代谢产物的释放有关尚需进一步证明。
关键词: 肠缺血/再灌注损伤;
白介素-1β; 磷脂酶A2
学科分类号: Q593; R392.32
Interleukin-1β
expression and phospholipase A2 activation after intestinal ischemia/reperfusion injury
YAN Guang-Tao,
HAO Xiu-Hua, XUE Hui, WANG Lu-Huan, LI Ying-Li, SHI Li-Ping
Laboratory of
Biochemistry, Basic Medicine Institute, General Hospital of PLA, Beijing 100853
Abstract: The experiments were carried out to
explore the interactions between IL-1 beta gene expression, protein level and
phospholipase A2 （PLA2） inhibition after intestinal ischemia/reperfusion
injury. Using a rat intestinal ischemia/reperfusion injury model, after
collecting the serum, lung lavage, abdomen cavity lavage and important organ
tissue samples from control, injury and PLA2 inhibitor treated groups, IL-1
beta level was measured by radioimmunoassay, and the mRNA expression of IL-1 beta and type Ⅱ PLA2 was
determined by RT-PCR. After 6 h of injury, the IL-1 beta level in serum was significantly higher than that in the control group; an
increase in IL-1 beta was also observed in abdomen cavity lavage 1 or 3 h after injury. IL-1 beta was significantly
increased in liver tissue after injury, but was not changed obviously in the
lung, kidney and intestinal tissues. IL-1 beta in the lung lavage was
significantly higher than that of control group. The mRNA expression of IL-1
beta in lung tissue was increased after injury, but type Ⅱ PLA2 mRNA expression
was decreased. There were different changes in IL-1 beta level and gene
expression after treatment with PLA2 inhibitor chloroquine, cyclo-oxidase
inhibitor indomethacin, or PAF receptor antagonist SR27417
respectively after injury. All
these results indicate that after intestinal ischemia/reperfusion injury, the
IL-1 beta level and mRNA gene expression are significantly increased, however,
the relationship among IL-1 beta, PLA2 activation and its metabolite
release remains to be further elucidated.
Key words:
intestinal ischemia/reperfusion injury; interleukin-1 beta; phospholipase A2
肠缺血/再灌注损伤(I/R)是多种严重创伤后继发的一种病理变化, 它对多器官功能障碍综合症的发生与发展有重要的促进作用。以前的研究工作表明，I/R损伤后产生的内毒素和氧自由基对脏器血管内皮细胞和炎症反应白细胞的相互作用有重要影响[1]。我们还证明,
I/R损伤过程中磷脂酶A2（PLA2）活化及其代谢产物的释放诱导了炎症反应细胞凋亡和坏死的失平衡[2]。同时, 最近的国外文献报告, 炎症和损伤过程中PLA2活化可直接促进中性粒细胞等释放多种细胞因子[3]。细胞因子在炎症和损伤过程中发挥一种动态平衡作用，IL-1、IL-6、IL-8等炎症因子引发扩大炎症反应的瀑布效应，而IL-1Ra、IL-4和IL-10等则能对抗炎症反应细胞的过度激活[4]。PLA2抑制剂对重症创伤的保护作用已有较多报告，并同抑制胞内核转录因子NF-kappa
B相关[5]。但是否抑制或促进相应的细胞因子基因表达和释放尚未见有文献报道。我们在原有工作基础上, 进一步探讨了I/R损伤后IL-1β基因表达、 蛋白质水平和阻断PLA2活性及代谢产物释放的关系,
期望能进一步阐明PLA2在创伤后多器官障碍发生过程中的作用机制。
1材料和方法
1.1 主要试剂和动物Wistar大鼠购于中国科学院动物中心，氯喹（chloroqine）、消炎痛（indomethacin）购于Sigma，SR27417 由法国Herbert JM教授提供。IL-1β购于北京医科大学免疫中心。其它试剂均是国产分析纯级。
1.2 动物模型[6] Wistar大鼠(250
g), 雌雄不限。 随机分为损伤组(A)、假手术对照组(B)、氯喹治疗组(C)、消炎痛治疗组(D)和SR27417治疗组(E)。各组动物在实验前1天空腹, 经腹腔注射1.5
ml 1%戊巴比妥钠麻醉, 无菌条件下开腹并分离肠系膜前动脉并夹闭60 min, 去夹再灌注时给药, 均为1 mg/(ml·kg)体重。 对照和损伤组给生理盐水,
持续6 h处死动物取样品。
1.3 肠夹闭率的测定采用碘标记的BSA 2×105万 cpm，经尾静脉注入肠血循环, 设立夹闭肠系膜前动脉组和假手术对照组, 每组5只, 分别在10和60
min后处理动物, 取十二指肠测定组织碘标记BSA放射性, 计算肠缺血率。
1.4 样品收集再灌注6 h后经心脏取血, 经抑肽酶, PMSF和EDTA抗凝和抑制蛋白酶水解作用, 分离血浆, 贮存于-20℃。动物处死后立即取200
mg湿重的肝、肺、肾、肠加入2 ml组织匀浆液(0.1 mol/L
PBS, 1 mmol PMSF, 500 U抑肽酶)经高速组织分散器匀浆(4℃
2×104 r/min, 2 min), 离心后保留上清, 贮存于-20℃待测。
1.5 白介素-1β的放射免疫分析[7] 用纯化的重组IL-1β免疫大耳白兔, 获取高效价IL-1β抗体。将标准IL-1β (0.06、0.12、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0
ng/ml)和待测样品(血清、肺、肠灌洗液，组织匀浆上清液100 μl
， 125 I标记的IL-1β(20000 cpm)以及1∶5000的IL-1β抗体100 μl, 混匀后于4℃, 经3500 r/min离心15 min, 弃上清液,
测定沉淀放射性, 计算机处理绘制标准曲线，给出样品浓度。
1.6 肺组织总RNA提取及mRNA基因表达取100 mg湿肺组织加1 ml变性液(博大公司总RNA提取试剂盒)后用匀浆器充分匀浆, 提取总RNA,
逆转录为cDNA保存待测。合成大鼠IL-1β基因上下游引物：5′CCA GGA TGA GGA CCC AAG CA-3′, 5′TCC CGA CCA
TTG CTG TTT CC3′, 扩增反应条件为预变性94℃ 5 min, 变性95℃ 60 s, 延伸70℃ 60 s, 退火65℃ 60 s, 32个循环[8]。大鼠Ⅱ型PLA2上下游引物5′GAG
TTT GGG CAA ATG AT3′, 和5′GC TTT ATC GCA CTG GCA; 扩增条件为预变性94℃ 5 min , 变性94℃ 35
s, 延伸72℃ 60 s, 退火55℃ 50 s[9]。内源性参照为β-actin, 引物为5′CTA TCG GCA ATG AGC GGT TC 3′,5′CTT
AGG AGT TGG GGG TGG CT 3′。反应时引物加入25 pmol/ 管, 样品为3 μl/管, IL-1β扩增片段为519 bp, Ⅱ型PLA2为272
bp， β-actin为762 bp, 经1%琼脂糖凝胶电泳后用GeL-Pro
analyzer凝胶成像仪分析处理。
2结果
2.1 肠系膜前动脉夹闭率
肠I/R损伤夹动脉后60 min肠段血流量明显较假手术对照组下降, 125I-BSA测定每克湿组织放射性为18050±12338
cpm/min, 而未夹对照组为66799±16002 cpm/min, 提示该动物模型能造成显著的肠缺血损伤。
2.2 肠I/R损伤后血清和肺灌洗液中IL-1β含量的变化
肠I/R损伤后6 h, 血清中IL-1β含量和肺灌洗液中IL-1β含量比对照水平明显升高, 而且肺灌洗液中IL-1β上升较血液中更多。磷脂酶A2抑制剂氯喹和血小板活化因子受体阻断剂SR27417对血液和肺局部灌洗液中IL-1β并没有明显影响,
但环氧化物酶抑制剂消炎痛可显著降低血清中IL-1β的水平(表1)。
2.3 肠I/R损伤后腹腔液中细胞因子IL-1β的变化
在肠I/R损伤后不同时间点, 腹腔液中IL-1β在松夹再灌注1 h后即明显高于对照水平和自身正常水平(即夹闭前)。 同样, 仅有消炎痛治疗能降低损伤后
表1. 肠I/R损伤后血清中及肺灌洗液中IL-1β水平的变化
Table 1.
Changes in IL-1β level in
serum and lung lavage after intestinal I/R injury (ng/ml)
[]n[]Serum[]Lung
lavageControl[]10[]0.87±0.21[]0.99±0.54I/R injury[]12[]1.41±0.51*[]4.71±2.56**Chloroquine[]11[]1.40±0.50*[]3.32±2.63**Indomethacin[]11[]0.95±0.30#[]4.74±2.91**SR27417[]13[]1.61±0.58*[]4.72±3.1***P<0.01, t=2.961， vs control. **P<0.001, t=5.876, vs
control.# P<0.05, t=－2.343 vs I/R injury.
表2. 肠I/R损伤后腹腔液中IL-1β 水平的变化
Table 2.
Changes in IL-1β level of
abdomen cavity solution after intestinal ischemia and reperfu-sion
injury (ng/ml)
[]n[]Normal[]0
h[]1 h[]3 h[]6 hControl[]10[]0.16±0.66[]0.21±0.12[]0.19±0.09[]0.17±0.09[]0.17±0.07I/R
injury[]12[]0.14±0.04[]0.17±0.08[]0.29±0.19*[]0.28±0.16*[]0.24±0.12Chloroquine[]11[]0.13±0.11[]0.20±0.10[]0.25±0.11*[]0.25±0.12*[]0.20±0.07Indomethacin[]11[]0.15±0.08[]0.17±0.05[]0.19±0.06#[]0.15±0.15#[]0.16±0.04SR27417[]13[]0.19±0.10[]0.22±0.13[]0.29±0.15*[]0.33±0.18*[]0.23±0.19*P<0.05, the level of IL-1 beta in each treated
group vs that in the normal abdomen cavity solution before
artery nipping and that at the
corresponding time points
of the control. # P<0.05,
indomethacin group vs I/R injury
group at the corresponding
time points.
相应时间点IL-1β的水平, 而氯喹和SR27417对损伤造成的IL-1β增高没有影响(表2)。2.4 肠I/R损伤后重要脏器组织中细胞因子的变化
肠I/R损伤后6 h, 肺、肝、肾和肠组织匀浆后上清中IL-1β水平，按湿组织重量计算以肠道组织为最高，肺组织为最低。但仅肝组织中IL-1β损伤后比对照组增高，使用消炎痛和氯喹后肝脏IL-1β能恢复到对照水平, 而其它脏器组织损伤前后IL-1β没有变化(表3)。
2.5 肠I/R损伤6 h后肺组织Ⅱ型PLA2和IL-1β
mRNA 基因表达的变化
肠I/R损伤后6 h, 肺组织中Ⅱ型PLA2 mRNA表达有所降低,
而用消炎痛和氯喹处理后有所恢复, 但三氟拉嗪、SR27417和愈创木酸等却能明显抑制ⅡPLA2 mRNA在肺组织中的表达。同时, 损伤后肺组织IL-1β
mRNA表达增加, 使用消炎痛、氯喹、三氟拉嗪和愈创木酸还能促进局部IL-1β的mRNA表达, 但SR27417能显著抑制IL-1β的基因表达(图1)。
表3. 肠I/R损伤后6 h重要脏器匀浆上清中IL-1β水平的变化
Table 3.
Changes in IL-1β level
of supernatant of important
organ tissues after intestinal I/R injury
（pg/mg）
[]n[]Lung[]Liver[]Kidney[]IntestineControl[]11[]1.61±0.52[]1.71±0.83[]5.86±3.01[]20.10±6.7I/R
injury[]12[]1.52±0.51[]2.81±0.93*[]6.81±4.72[]24.10±4.25Indomethacin[]11 []1.43±0.55[]1.90±1.01#[]7.6 ±3.42[]24.50±17.63Chloroquine[]12 []1.45±0.53[]1.91±0.78#[]6.23±3.80[]23.60±17.00SR27417[]17[]1.76±0.42[]2.32±0.75[]6.13±2.56 []24.01±15.66 *P<0.05, t=2.125, vs control. # P<0.05, t=2.343,
2.485, vs I/R injury.
图1. 肠I/R损伤后肺组织中 Ⅱ 型 (磷脂酶A2) PLA2、IL-1β mRNA基因表达的变化
Fig.
1.Changes in Ⅱ type PLA2 and IL-1β mRNA expression in lung tissue after
intestinal I/R injury. A shows Ⅱ type PLA2;
B shows IL-1β.
From the left to right, the
ladder of electrophoresis represents DNA molecular standard, control, I/R
injury, indomethacin, chloroquine, trifluoperazine, SR27417 and
nordihydroguaiaretic acid groups respectively.
3讨论
肠缺血/再灌注损伤是机体遭受严重创伤, 失血性休克并发的一种远隔脏器损伤。除肠道粘膜破坏引起的菌群内移和脓毒症休克外, 继发的肺功能衰竭成为多脏器障碍的首发脏器[2]。已经证实,
肠I/R损伤后PLA2浓度和其代谢产物在血液和肺组织局部有显著的增加, 且抑制PLA2活性和其代谢产物的合成有助于缓解肠I/R损伤后的肺功能障碍[6]。但抑制PLA2活性对肺脏的保护作用的过程仍不清楚。文献提示活化的PLA2能直接促进中性粒细胞释放炎性细胞因子,
而肠I/R损伤后肺部功能的损伤同PLA2介导的中性粒细胞局部聚积密切相关[10]。因此, 我们推测， 在肠损伤早期PLA2活化介导的全身性炎症反应, 可能通过IL-1β的大量释放而将损伤信号传递到远隔脏器肺,
造成白细胞聚积和浸润。 因此，尽量在损伤早期控制IL-1β介导的炎性细胞反应，可能对控制I/R损伤介导的肺功能损害更有效。3.1 肠I/R损伤导致肠严重缺血和肠粘膜破损
我们的结果表明, 经尾静脉注入的 125I-BSA, 在夹闭后1 h进入肠组织的放射性剂量显著低于假手术对照组。 普通病理切片上可见肠道粘膜层有纤毛细胞和柱状上皮细胞肿胀、
炎性细胞浸润增加和充血（结果未显示）。 提示在没有明显粘膜基底膜破坏的情况下, 肠道血屏障通透性增加，这样可能造成肠I/R损伤后细菌内移, 形成内毒素剧烈上升的脓毒性休克。3.2
肠I/R损伤后血和肺局部组织中IL-1β明显增加
IL-1β是一种强烈的炎症细胞因子, 除调节T细胞和B细胞介导的免疫功能外, 还作用于中性粒细胞和巨噬细胞及血管内皮细胞, 并参与膜PLA2激活[11,12]。这种网络关系在体内非常复杂,
其综合作用就是通过有形的细胞成分(如粒细胞、巨噬细胞、T、B细胞、内皮细胞)和无形的生物大分子、小分子介质的相互作用, 将外界损伤信号传入体内, 从受损伤局部传递到远隔脏器。我们曾发现,
兔失血性休克后IL-6在最早再灌注的30 min内下降，而在随后的2、6、24 h达到高峰并明显高于对照水平[13]。此外我们还发现, 失血性休克后30
min, 血中IL-8水平就明显高于对照, 持续6 h， 24 h后基本恢复正常水平[14]。本结果进一步显示, 在血清和肺灌注液中IL-1β的提高, 可能与肠I/R损伤诱导的肺损伤有关。特别是肺局部IL-1β的显著增高,
提示IL-1β在肺功能改变中具有重要意义。但是, PLA2抑制剂氯喹、环氧化酶抑制剂消炎痛和血小板活化因子（PAF）受体阻断剂SR27417对IL-1β影响不大。仅消炎痛使血清中IL-1β降低有显著差异(P<0.05)。
提示从整体上对PLA2活性抑制及其代谢产物前列腺素和血小板活化因子受体的阻断，均不太可能通过影响IL-1β而产生保护作用。3.3 肠I/R损伤诱导腹腔液中IL-1β显著增加
腹腔液是腹腔内皮细胞的分泌液,
正常状态下IL-1β含量极低。 肠I/R损伤后IL-1β的增高提示肠道除了粘膜通透性改变外, 可能由于白细胞的激活而导致肠粘膜上皮细胞、白细胞分泌IL-1β。这种分泌作用不受氯喹和SR27417的影响,
表明其分泌过程同PLA2活化及PAF的介导关系不大, 但可能同前列腺素类的合成有一定关系。因为消炎痛能明显抑制损伤后IL-1β的增加。内毒素血症引发血清中IL-1β明显上升而诱发高热。但本实验证实，
早期(伤后1～3 h)腹腔液中IL-1β的升高甚至高于血液中的升高，提示局部释放可能是一个主要因素。另外, IL-1β可在数分钟内直接诱导细胞膜PLA2激活，促使脂类递质前列腺素及血小板活化因子大量释放，作用于下丘脑温度调节神经元，
导致体温上升[15]。而据本实验结果, 这种作用并不是逆向的, 提示PLA2介导IL-1β的受体信号传导, 但并不能影响IL-1β的合成和释放。至于抑制前列腺素释放同降低IL-1β的关系,
可能同更复杂的机制有关, 且本结果也不能证明消炎痛是诱导IL-1β下降的原因。3.4 肠I/R损伤可诱导肝组织中的IL-1β增多
本实验观察到， 肠I/R损伤后肺、肾、肠组织中IL-1β没有明显的增多, 仅肝组织中IL-1β有显著升高。 且消炎痛和氯喹能明显降低肝组织中IL-1β的浓度,
使之恢复接近对照组。肝作为损伤后再灌注过程中接受肠道血液的第一个脏器, 对损伤有明显反应。药物有阻断IL-1β升高的作用, 也可能同药物局部浓度升高较多有关。这从侧面说明，损伤后肝组织中IL-1β的增加，可能同再灌注过程中内毒素诱导的PLA2激活有关系。已有工作证实，
PLA2介导失血性休克再灌注损伤时的全身性炎症反应[2]。3.5 肠I/R损伤诱导肺组织IL-1β mRNA表达增加
我们发现， 肠I/R损伤后肺组织IL-1β mRNA表达较对照组增强,
而 Ⅱ 型PLA2 mRNA表达下降。 同样的结果尚未见文献报告。推测IL-1β增强可能同肺局部中性细胞浸润有关,
且同肺灌洗液中IL-1β明显上升的结果一致。 但 Ⅱ 型PLA2 mRNA表达下降机理不明。从使用消炎痛和氯喹后 Ⅱ 型PLA2 mRNA表达有明显恢复看, 该结果提示肺局部PLA2活化和代谢产物的释放，可能对其基因产物形成一种负反馈的调节，是机体避免局部PLA2活化造成肺功能严重损害的一种平衡机制。
至于本结果显示的PLA2抑制剂类药物对IL-1β mRNA的促表达作用, 表明IL-1β是一种对PLA2及其代谢产物有关系的细胞因子, 在局部仍然有接受PLA2及其代谢产物调控的可能。只是IL-1β在血液中的含量受多种因素的影响,
因而没有显著升高。
总之, 本实验结果表明, 肠I/R损伤后血、肺灌洗液及腹腔液中IL-1β有显著上升, 肺组织中IL-1β
mRNA表达增加, 而肝组织中IL-1β水平也增加, 提示IL-1β是一种肠道I/R损伤后早期的反应因子, 可能同肺、肝等功能变化有关, 是通过血液传导肠I/R损伤的信号。而非特异性阻断PLA2活性及其代谢产物血小板活化因子受体并不能明显降低肺组织IL-1β的基因表达和血液中IL-1β的水平，提示肠I/R损伤时IL-1β的表达同PLA2活化的关系尚不明确，仍需大量工作加以证实。
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