Received 2001-04-11Accepted 2001-06-20

*Corresponding author. Tel: 0311-6044121-5601; E-mail: liusucai@163.net

生理学报, Feb. 2002, 54 (1): 33～37

Acta Physiologica Sinica

研究论文

高浓度地塞米松通过下调LMP-1表达抑制大鼠成骨细胞的分化

刘素彩1, 张志勇2, 李恩1,

1河北医科大学生物化学教研室, 石家庄 050017; 2石家庄市第四医院, 石家庄 050011

摘要: 为探讨地塞米松(dexamethasone, DEX)抑制成骨细胞分化的机制, 观察了不同浓度DEX对体外培养大鼠成骨细胞的碱性磷酸酶活性、骨钙素(osteocalcin, OC)合成、 Ⅰ型胶原蛋白表达的影响, 并用RT-PCR方法检测了成骨细胞中LIM矿化蛋白1 mRNA的表达量。结果显示: 低浓度(10－９ mol/L)的DEX能增强碱性磷酸酶的活性、 OC的分泌和Ⅰ型胶原蛋白的表达; 而高浓度(10－７ mol/L)的DEX对它们则起抑制作用, 并下调成骨细胞正调节因子LMP-1 mRNA的表达。上述结果表明, 低浓度的DEX促进成骨细胞的分化; 高浓度的DEX则抑制成骨细胞的分化, 其抑制作用可能是通过下调LMP-1 mRNA的表达而实现的。

关键词: 地塞米松; LIM矿化蛋白1表达; 成骨细胞分化

学科分类号: Q493.2

Dexamethasone inhibits osteoblastic differentiation by down-regulation of LIM mineralization protein 1

LIU Su-Cai1, ZHANG Zhi-Yong2, LI En1,

1Department of Biochemistry, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017; 2The Fourth Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011

Abstract: To investigate the mechanisms of the inhibition of osteoblastic differentiation by dexamethasone (DEX), the effects of different doses of DEX on the activity of alkaline phosphatase (ALP), the synthesis of osteocalcin (OC) and the expression of colaggen type Ⅰ were observed in the cultured rat osteoblasts. The LIM mineralization protein-1 (LMP-1) mRNA, a positive regulator of osteoblasts, was semi-quantified by RT-PCR. The results showed that a lower dose (10－９ mol/L) of DEX could enhance the activity of ALP, the synthesis of OC and the expression of collagen type Ⅰ. However, a higher dose (10－７ mol/L) of DEX inhibited them and down-regulated the expression of LMP-1 mRNA in osteoblasts. It is suggested that DEX stimulates osteoblast differentiation at lower dose, while at higher dose it inhibits osteoblast differentiation. The inhibitory action of DEX on osteoblast differentiation might be mediated by the down-regulation of LMP-1 mRNA.

Key words: dexamethasone; LIM mineralization protein 1 expression; osteoblastic differentiation

糖皮质激素(GCs)广泛应用于临床, 但流行病学调查发现, 长期大量使用GCs会对人体造成包括骨质疏松在内的许多副作用。GCs诱发的骨质疏松是最常见的继发性骨质疏松, 其骨折的发生率高达30%～50%, 已成为临床上亟待解决的问题。有研究表明, GCs可通过其受体直接作用于成骨细胞, 从而调节骨代谢。低浓度的地塞米松(dexamethasone, DEX)对成骨细胞的分化有促进作用, 而高浓度的DEX则抑制成骨细胞的分化[1～8]; 但其调节成骨细胞分化的机制尚未阐明。近来, Scott等[9]发现, LIM 矿化蛋白1(LMP-1)是成骨细胞分化的正调节因子,能促进骨基质的矿化,且低浓度(10－９ mol/L)的DEX可增强LMP-1的表达。然而, LMP-1是否参与高浓度DEX抑制成骨细胞分化的过程, 目前还未见报道。本实验在明确不同浓度DEX对培养大鼠成骨细胞分化作用的基础上, 进一步观察了高浓度DEX对成骨细胞LMP-1表达的影响, 以探讨其在DEX抑制成骨细胞分化中的作用。

1材料和方法

1.1　材料和试剂SD乳大鼠由河北省实验动物中心提供。其他包括DMEM、胰蛋白酶(GIBCO公司), 小牛血清(FCS)为自制, 噻唑蓝、胶原酶、 DEX、 β磷酸甘油、琼脂糖(Sigma公司), Ⅰ 型胶原抗体、山羊抗兔IgG、 SABC、 DAB(博士德公司), 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)试剂盒(石家庄试剂公司)。骨钙素(osteocalcin, OC)放射免疫法测定试剂盒为中国医学科学技术中心生产。异硫氢酸胍(Serva), Randon Primer、 dNTPS(北京鼎国生物工程公司), TagDNA聚合酶、 RNasin、反转录酶(Promega), PCR引物由上海生物工程公司合成。葡萄糖醛酸脱氢酶（GAPDH）引物上游5′CCCACGGCAAGTTCAACGGCA3′下游5′ TGGCAGGTTTCTCCAGGCGGC 3′此引物可扩增出605 bp的片段。LMP-1引物上游5′CCACGTATGAGCACCTCCTC 3′下游 5′CACAGCTACATACAGGTTTATTG 3′ 此引物可扩增出260 bp的片段。还有CO2 培养箱、全自动酶标仪(奥地利生产)和倒置显微镜(重庆光学仪器厂)， ZL2000型细胞参数分析系统由河北医科大学华行医疗器械厂提供。PCR循环仪由美国PE生产。

1.2 大鼠成骨细胞的分离和培养无菌条件下取48 h新生大鼠颅盖骨, 用无血清DMEM冲洗, 再用0.25% 胰酶消化, 清除脂肪和软组织, 剪成1～3 mm3的小块, 用0.1%胶原酶消化45 min, 置于20% FCS DMEM中贴壁培养。所有实验用传至4代细胞, 先用0.25%胰酶消化贴壁细胞, 再用含10% FCS的 DMEM调至以下检测所需细胞浓度。

1.3大鼠成骨细胞增殖的分析及ALP活性的测定用含10% FCS的 DMEM调细胞浓度为4×105个/ml, 接种于96孔培养板上0.2 ml/孔, 待成骨细胞贴壁后弃去含血清培养基, 在相应的培养孔内分别加入无血清DMEM(作为对照)、 DEX(终浓度为10－９、 10－８、 10－７ mol/L), 分别培养24、 48、 72 h, 每一浓度的每一时间点为8孔, 到时弃去培养基, 换用无血清DMEM冲洗培养板3次, 采用MTT法分析细胞增殖。把调至4×105个/ml的细胞液接种于24孔培养板, 每孔加入0.4 ml, 以上述方法加入无血清DMEM和不同浓度DEX进行培养, 每一浓度每一时间点有8孔, 待培养到时后进行ALP活性的测定。即弃去培养基, 用PBS冲洗培养板3次, 加入0.5 ml 0.1% Triton X100裂解细胞, 收集每孔裂解液, 按试剂盒说明书测ALP活性, 用Lawry法测蛋白含量。结果以ALP活性/每克蛋白表示。

1.4 Ⅰ 型胶原蛋白表达及骨钙素分析将细胞接种于6孔培养板(板内预先放置盖玻片), 每孔为105个细胞, 当细胞80%融合时, 选出18个孔, 其中6个孔为对照, 其余12个孔加入DEX(终浓度为10－７ mol/L), 分别进行12、 48 h培养, 取出盖玻片, 用PBS冲洗, 多聚甲醛固定20 min, 3% H2O2灭活内源性酶, 再用0.01 mol/L PBS稀释一抗100倍, 加入一抗4℃过夜, 滴加山羊抗兔IgG 37℃ 20 min, 再滴加SABC 37℃ 20 min, 用DAB显色5 min, 行脱水、透明、封片。用免疫组化方法分析Ⅰ 型胶原蛋白表达。免疫组化结果用ZL2000型细胞参数分析系统测量其光密度。另选出12个孔, 换为10%　FBS 5 mmol/L β磷酸甘油 DMEM, 在6个孔内加入10－７ mol/L DEX, 其余6孔为对照, 培养7 d, 收集培养基, 用于骨钙素的测定, 测定方法按放射免疫法试剂盒操作进行。

1.5 RT-PCR检测LMP-1 mRNA的表达第四代细胞80%融合时换为无血清DMEM, 加入DEX(终浓度为10－７ mol/L), 继续培养12、 24、 48 h, 不加DEX者作为对照。用异硫氢酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞中的总RNA, OD260/OD280鉴定纯度, 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性。在反转录体系中加入如下试剂和样品: 5×buffer、 10 mmol/L dNTP、 RNasin、 AMV、随机引物、样品RNA等, 混匀, 42℃水浴30 min, 95℃ 5 min, 以灭活反转录酶。加下列试剂进行PCR反应: 反转录产物、 10×buffer、 primer1、 primer2、 TagDNA聚合酶等, 对GAPDH和LMP-1进行同管扩增。PCR条件为: 首次循环: 95℃变性3 min, 58℃退火30 s、 72℃延伸 45 s; 后续循环: 94℃变性30 s, 58℃退火30 s、 72℃延长45 s; 末次循环: 94℃变性30 s, 58℃退火30 s、 72℃延长6 min。循环30次。PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳之后进行光密度和面积扫描, 结果以每一样品和其内参光密度的比值表示。

1.6 统计学分析所有实验重复三次。数据用mean±SD表示, 方差检验后, 组间采用非配对t检验。

2结果

2.1 DEX对大鼠成骨细胞增殖的影响

用10－９、 10－８、 10－７ mol/L DEX在培养24、 48、 72 h后, 对大鼠成骨细胞增殖无明显的作用(P>0.05, 实验数据未显示)。

2.2 DEX对大鼠成骨细胞ALP活性的影响

10－９ mol/L DEX能提高ALP的活性(P<0.01), 但随培养时间延长, 此作用消失(P>0.05)。10－８ mol/L DEX, 在培养24和48 h后, 与对照比较无明显的作用(P>0.05), 但当培养至72 h时抑制ALP的活性(P<0.05)。10－７ mol/L DEX开始就表现出对ALP活性的抑制(P<0.05), 并随时间延长其抑制作用增强(P<0.01)(表1)。

表1. DEX对大鼠成骨细胞ALP活性的影响

Table 1. Activity of ALP of rat osteoblasts treated by DEX (mean±SD)

Group []Activity of ALP (U/L) 24 [] 48 [] 　72 (h)Control []0.177±0.069[]0.160±0.058[]0.174±0.031 DEX 10－９ mol/L[]0.549±0.226** []0.203±0.064 []0.149±0.035 DEX 10－８ mol/L []0.329±0.202 []0.135±0.084 []0.109±0.057* DEX 10－７ mol/L []0.115±0.018* []0.099±0.030* []0.087±0.035** *P<0.05, **P<0.01 compared with control group.

2.3 DEX对大鼠成骨细胞骨钙素的影响

与对照组比较, 10－９ mol/L DEX组的OC明显增高(P<0.01), 说明10－９ mol/L DEX可促进OC的合成和分泌。而10－７ mol/L DEX的 OC则显著低于对照组(P<0.05), 表明10－７ mol/L DEX 可抑制OC的合成与分泌(表2)。

表2. DEX对大鼠成骨细胞骨钙素的影响

Table 2. Influence of DEX on the synthesis of OC

(mean±SD)

Group [] n[] OC　(ng/ml) Control[] 11 [] 4.857±2.349 DEX 10－９ mol/L [] 11[]7.359±1.279** DEX 10－７ mol/L [] 11 [] 3.058±1.081* *P<0.05, **P<0.01 compared with control group.

2.4 DEX对成骨细胞Ⅰ 型胶原蛋白表达的影响

图1显示, 10－７ mol/L DEX处理后的成骨细胞Ⅰ 型胶原蛋白免疫反应明显降低。进而我们用ZL2000型细胞参数分析系统分析Ⅰ 型胶原蛋白的表达。用10－７ mol/L DEX处理的细胞, 无论培养24 h还是培养48 h, 其免疫组化反应的OD值都明显降低, 光密度的平均值小于对照的平均值减2个标准差, 说明10－７ mol/L DEX能明显抑制成骨细胞Ⅰ 型胶原蛋白的表达(表3)。

2.5 DEX对LMP-1 mRNA表达的影响

循环参数的选择: GAPDH mRNA的表达在PCR 35个循环前呈指数增长, LMP-1 mRNA的表达在PCR 40次循环前呈指数增长,所以都选择处于

图1.成骨细胞Ⅰ 型胶原蛋白的免疫组织化学

Fig. 1.Immunohistochemistry for collagen type Ⅰ protein. A: Control group (10×10). B: 10-7 mol/L DEX group (10×10).

指数增长阶段的30次循环, 将GAGDH和LMP-1进行同管扩增(图2A,B)。LMP-1 mRNA的表达: PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳后,对电泳带作光密度测定。对照组的光密度与内参光密度的比值为0.966。10－７ mol/L DEX培养12、24和48 h后的条带光密度与内参光密度比值分别为0.445, 0.295

表3. DEX对Ⅰ 型胶原蛋白表达的影响

Table 3. Effect of DEX on the expression of collagen type Ⅰ (mean±SD)

Group [] n [] Ⅰ collagen/ODControl [] 12 [] 0.030±0.005 DEX 10－７ mol/L (24 h) []12[]0.016±0.004* DEX 10－７ mol/L (48 h) []12 [] 0.017±0.005**The average of DEX group less than that of control group minus 2 SD.

图2.DEX对LMP-1 mRNA 表达的影响

Fig. 2.Effects of dexamethasone on LMP-1 mRNA. A: The choice of GAPDH PCR cycles. M, marker; 1, 30 cycles; 2, 35 cycles; 3, 40 cycles; 4, 45 cycles. B: The choice of LMP-1 PCR cycles. M, marker; 1, 20 cycles; 2, 25 cycles; 3, 30 cycles; 4, 35 cycles; 5, 40 cycles. C: The effects of dexamethasone on LMP-1 mRNA. M, marker; 1, control; 2, treated with DEX for 12 h; 3, treated with DEX for 24 h; 4, treated with DEX for 48 h.

和0.862。 DEX 培养24 h后, 对 LMP-1 mRNA 表达的抑制达到高峰, 48 h 抑制作用有减弱趋势(图2C)。

3讨论

本实验结果显示, 低浓度(10－９ mol/L)DEX可提高大鼠成骨细胞ALP的活性, 较高浓度(10－７ mol/L)DEX则抑制ALP的活性。碱性磷酸酶是一种同源二聚体的糖蛋白, 是识别及估价成骨细胞分化的生化指标, 而且是成骨细胞分化最早的指标[10,11]。研究发现, OC是骨基质中的主要非胶原蛋白, 为骨组织的特异蛋白, 是识别成骨细胞的另一个标志。它和羟磷灰石高度亲和, 和骨基质的矿化有关[10～12]。如果成骨细胞培养环境中缺乏β磷酸甘油, 则不表达OC, 所以本实验是在培养基中加入β磷酸甘油后测OC的含量, 发现10－９ mol/L的DEX可促进成骨细胞合成分泌OC, 而10－７ mol/L的DEX抑制OC的合成。以上结果与其它学者的报道一致[1～8], 进一步说明不同浓度的DEX对成骨细胞分化的不同作用。而且, Stein 等对大鼠OC启动子的研究表明, 有几个糖皮质激素反应元件对OC的转录活性既可起正调节作用又可起负调节作用[13], 为糖皮质激素调控骨钙素的分泌提供了理论依据。本实验结果与此理论相吻合。

大量的流行病学资料显示, 糖皮质激素可诱导骨质疏松症的发生。对此型骨质疏松的防治已成为学者们的研究重点。我们进一步观察到, 较高浓度的(10－７ mol/L)的DEX明显抑制成骨细胞Ⅰ 型胶原蛋白的表达, 减少骨结节的形成。Ⅰ 型胶原占骨有机基质的90%以上, 是成骨细胞分化的又一特征[11], 与细胞的进一步分化有密切关系。本实验中发现, DEX对成骨细胞的增殖并无影响, 说明DEX主要作用在成骨细胞的分化阶段, 在低浓度时促进成骨细胞分化, 高浓度时则抑制成骨细胞分化。

LMP-1是LIM功能域蛋白家族成员之一, 在成年大鼠的骨骼、肾脏、心脏、大脑、肺和骨骼肌都有不同水平的表达, 它参与细胞的增殖与分化。Scott等[9]发现LIM 矿化蛋白1　(LMP-1)是成骨细胞分化的正调节因子, 它可促进OC的分泌及骨结节的形成, 主要在骨的矿化过程中起重要作用。我们发现, 10－７ mol/L DEX对成骨细胞分化具有较强的抑制作用, 能明显抑制LMP-1 mRNA的表达, 提示DEX可能通过抑制LMP-1 mRNA的表达来实现其对成骨细胞分化的抑制。需指出的是, LMP-1是一种非分泌蛋白, 是细胞内的信号传导分子, 在细胞内合成并产生诱导骨形成作用, 因此它的表达可能诱导其它的骨形成因子, 而当这些因子分泌后可影响相邻的细胞, 这样可使LMP-1的作用放大, 所以在转基因动物体内, 并不需要每一个细胞都含有LMP-1 cDNA, 也同样会产生诱导骨形成作用[13]。LMP-1对成骨细胞有正调节作用, 加之可能会启动瀑布效应, 其表达不需持续很久, 这使骨质疏松的转基因治疗成为可能。

综上所述, 较高浓度的DEX可抑制大鼠成骨细胞的分化, 而这一作用可能与高浓度的DEX抑制LMP-1 mRNA的表达有关。

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