Received 2001-06-08Accepted 2001-11-29

*Corresponding author. Tel:    62232765;  E-mail: lxzhang@371.net

生理学报, Feb. 2002, 54  (1): 65～7065

Acta Physiologica Sinica

 

研究论文

褪黑素对大鼠空间学习记忆的影响及其机制研究

冯寅1,   张烈雄2,   晁东满3

1复旦大学医学院神经生物学教研室，上海 200032; 2华东师范大学生命科学学院生理学教研室，上海 200062; 3复旦大学医学院生理学教研室，上海 200032

 

摘要:  本研究运用Morris水迷宫和电生理学方法，以逃避潜伏期、穿环系数和海马CA1区突触长时程增强（long-term potentiation, LTP）为指标，研究褪黑素对大鼠空间学习记忆能力的影响。实验结果显示：（1）在Morris水迷宫6 d训练中，对照组大鼠后4 d平均逃避潜伏期为18.44±2.7 s，褪黑素组为30.02±3.6 s，两者有显著差异（P<0.01）；训练６ d后，褪黑素组穿环系数为25.68±2.32%，明显小于对照组的43.33±2.85%（P<0.01）。　（2）采用微量注射法给予海马CA1区褪黑素，强直后60 min，fEPSP斜率为基准值的114.28±1.80%，显著低于对照组的169.71±6.48%（P<0.01）。　（3）  预先给予东莨菪碱，不影响褪黑素对海马CA1区LTP的抑制，强直后60 min fEPSP斜率为基准值的113.70±5.55%。　（4）提前给予荷包牡丹碱后给予褪黑素，强直后60 min fEPSP斜率为基准值的162.29±10.52%，明显大于褪黑素组（P<0.01），而与对照组无显著差异（P>0.05）。上述结果表明，褪黑素对大鼠的空间学习记忆能力及海马CA1区LTP均有明显的抑制作用，两者相关；东莨菪碱不能阻断褪黑素对海马CA1区LTP的抑制作用，而荷包牡丹碱可以阻断褪黑素对LTP的抑制，提示褪黑素的作用可能不是由胆碱能系统所介导，而是通过GABA能系统介导。

 

关键词: 褪黑素;  空间学习记忆;  长时程增强;  东莨菪碱;  荷包牡丹碱

学科分类号: Q427

 

Role of melatonin in spatial learning and memory in rats and its mechanism

FENG Yin１, ZHANG Lie-Xiong２，, CHAO Dong-Man３

1Department of Neurobiology, Medical Center of Fudan University, Shanghai 200032; 2School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200062; 3Department of Physiology, Medical Center of Fudan University, Shanghai 200032

 

Abstract:  It has been suggested that melatonin is involved in learning and memory. In the present study, we investigated the effects of melatonin on spatial learning and memory in rats, using Morris water maze and electrophysiological methods.The results are as follows.  (1)  During a six-day water maze training, the mean escape latency of melatonin group in the last 4 days was 30.02±3.6 s, and that of control group was 18.44±2.7 s (P<0.01). The crossing annulus coefficient of melatonin group was 25.68±2.32%, and that of control group was 43.33±2.85% (P<0.01).  (2)  Microinjection of melatonin into CA1 area inhibited long-term potentiation (LTP). Sixty  minutes after tetanus, the field excitory postsynaptic potentials      (fEPSP) slope of group C (n=7，  0.5 μl saline) was 169.71±6.48% of the baseline, and that of group M2 (n=6, 2 μg melatonin)   was 114.28±1.80% of the baseline. The difference is significant (P<0.01).   (3)  We also investigated the effects of melatonin on LTP after administration of scopolamine. Sixty  minutes after tetanus, the fEPSP slope of group SM (n=6, 2 μg scopolamine before 2  μg melatonin) was 113.70±5.55% of the baseline.  It showed a significant decrease compared withgroup C (P<0.01). However, there was no difference between groups SM and  M2 (P>0.05,

  i.v.).  The results   obtained by applying melatonin after bicuculline were different from those after scopolamine.   Sixty minutes after tetanus, the fEPSP slope of group BM (n=7, 1 μg bicuculline before 2  μg melatonin) was 162.29±10.52% of the baseline. Compared with group C, there is no significant difference (P>0.05); but compared with group M2, the difference is significant (P<0.01).

Our results showed that application of melatonin in rats significantly inhibited not only spatial learning and memory, but also LTP in CA1 area. Furthermore, the results indicates that the inhibition of LTP by melatonin may not be mediated by cholinergic system, but may be through the modulation of GABAergic system.

 

Key words: melatonin;    spatial   learning and memory;  long-term potentiation;   scopolamine;  bicuculline

 

褪黑素（melatonin）是主要由松果腺合成和分泌的一种吲哚类神经激素，对生物体多种生理活动均有调节作用。近来研究表明，褪黑素对学习记忆功能也有影响，但迄今尚无定论。有人报道褪黑素对持续光照或药物引起的学习记忆障碍有改善作用[1,2]。Argyrou等观察褪黑素可缩短大鼠嗅觉群体记忆的识别时间，据此认为褪黑素对学习记忆有增强作用[3]。但也有人认为外源性褪黑素对人或动物学习记忆有抑制作用[4]。有报道表明，褪黑素能阻断大鼠海马齿状回[5]及CA1区[6]的突触长时程增强（long-term potentiation, LTP）。

那么，褪黑素对学习记忆的作用究竟是增强还是抑制？它影响学习记忆的作用机制是什么？面对褪黑素越来越多地用于多种中枢神经系统疾病的临床治疗试验，在理论上阐明褪黑素对学习记忆功能的影响，已显得非常必要。本课题采用行为分析和电生理学方法，结合脑内微量注射等技术，探讨褪黑素对大鼠空间学习记忆的作用，以期为阐明褪黑素的学习记忆功能提供进一步的证据。

 

1材料和方法

1.1 动物与药品选用健康成年SD大鼠（180～200 g,  购自复旦大学医学院实验动物部），雌雄兼用，饲养于约25℃的暗室内，每日8∶00 ～20∶00给予光照。

实验药品：褪黑素、东莨菪碱（scopolamine）、甲碘荷包牡丹碱（bicuculline methiodide），均为Sigma公司产品。褪黑素需少量乙醇助溶，以生理盐水配制成所需浓度，终溶液中乙醇量<5%。

1.2 空间学习记忆的测试空间学习记忆的训练与测试参照Morris[7]水迷宫法进行。水迷宫为一直径1 m，高0.5 m的圆形水池，池内水深0.2  m。水池按方位平均分为四个象限，在一个象限内置一直径0.07 m、 高0.16   m的平台，平台没于水面下0.04 m。训练时，水温保持在20℃左右，平台、水、池壁均染成黑色以隐蔽平台。实验过程中水池及周围环境保持不变。每天上午8：30开始训练，共训练6 d。每只大鼠每天训练4次，每次60 s，两次训练之间间隔30 s。每天训练前半小时腹腔注射褪黑素或生理盐水。训练时，将大鼠放入水中，用秒表记录大鼠的逃避潜伏期（即从大鼠入水到找到水下隐蔽平台并立于其上所需时间），若大鼠在60 s内未找到平台，则以60 s计。最后一次训练撤去平台，用摄像机拍摄大鼠游泳轨迹，计算穿环系数。

1.3 海马CA1区LTP的诱导海马CA1区LTP的诱导参照Xu等[8] 的报道。记录电极与刺激电极均用直径75 μm的绝缘镍铬丝制成，尖端裸露。动物麻醉（20%乌拉坦，5 ml /kg,  i.p.）后固定于立体定位仪上，单极记录电极垂直插入海马CA1区锥体细胞树突丛（P3.4，L2.5，V2.0±0.1）；置双极刺激电极于记录电极同侧，与垂直方向成15度夹角，斜向前方插入大鼠海马CA3区Schaffer侧枝（P4.9，L3.7，V3.1±0.1）。调整记录电极及刺激电极深度，至记录到最大的场兴奋性突触后电位（field excitory postsynaptic potentials, fEPSP）为止。

以波宽0.2 ms、频率0.5 Hz的测试刺激，作用于大鼠海马CA3区Schaffer侧枝，诱导海马CA1区锥体细胞树突丛fEPSP。以fEPSP最大斜率2/3时对应的电流强度作为最适刺激强度。诱导LTP的刺激为160 Hz，3串，串间隔30 s，每串1 s的高频刺激，强直后记录90 min。记录信号经FZG-81直流前置放大器放大后，分两路输出。一路至示波器监视，另一路通过SMUP生物信号处理系统至计算机，用AVERAGE软件进行采样，迭加5次记录后保存。

在LTP记录实验中，在海马CA1区定点微量注射给药。微量注射采用双层不锈钢套管，内管直径0.25 mm，外管直径0.45 mm，注射内管尖端长于外套管0.2 mm。外套管与记录电极（垂直插入海马CA1区锥体细胞树突丛,P3.4，L2.5，V2.0±0.1）紧密粘合，电极尖端比注射外管尖端长0.2 mm。注药时将内管插入外套管，注射量为0.5  μl，1  min匀速注完。实验结束后，于原注射点注入0.2%滂胺天蓝（potamine sky blue）溶液0.5  μl作标记。刺激电极与记录电极通直流电(2 mA，20  min)烧灼。之后，处死动物，取出脑组织，在10% 福尔马林溶液中固定7 d，用冰冻切片机（model CM1900，Leica，Germany）作系列冠状切片，切片厚度为50 μm。切片经中性红染色后，在光学显微镜（Leica，Germany）下参照Paxinos和Watson大鼠脑图谱作组织学切片检查（图1），偏离位置的不予统计。

 

图1.通过海马的大鼠脑组织冠状切片

Fig. 1.Coronal section passing through the hippocampus. Solid arrow, location of the recording and injection site. Open arrow, location of the stimulation site. Scale bar, 1 mm.

 

每次实验先记录5 min  fEPSP（每分钟1次），测出fEPSP斜率，作为基准值（baseline），所有数据均表示为与基准值的百分比。数据表示为mean±SD，用方差检验(ANOVA)进行统计学分析，P<0.05被认为有统计学意义。

 

2结果

2.1  褪黑素对大鼠水迷宫学习记忆的影响

将16只大鼠随机分为2组(每组8只): Cont组, 训练前半小时腹腔注射生理盐水；M组, 训练前半小时腹腔注射褪黑素（2.5 mg/kg bw）。结果发现，大鼠经连续训练6 d后，无论是Cont组还是M组，其逃避潜伏期均呈缩短趋势（图2A），这一现象表明大鼠空间学习记忆能力随训练次数增加而有所增强。训练后，Cont组大鼠后四天平均逃避潜伏期为18.44±2.7 s，M组为30.02±3.6 s （图2B），两者有显著性差异（P<0.01），表明褪黑素明显减弱大鼠的空间学习能力。为进一步观察褪黑素对大鼠学习记忆的影响，我们还检测了大鼠的穿环系数(crossing annulus coefficient)，即大鼠在60 s内游过平台所在位置的次数占其经过四个象限内相应位置总次数的百分比，它反映大鼠对平台所在位置的空间记忆能力。穿环系数越大，说明大鼠空间记忆能力越强。两组大鼠穿环系数分别为：Cont组43.33±2.85%; M组25.68±2.32% (图2C)。M组穿环系数明显小于Cont组（P<0.01），表明褪黑素对大鼠空间记忆有显著的抑制作用。2.2 褪黑素对海马CA1区LTP的影响

有报道表明，表现为LTP形式的海马突触的可塑性与空间学习记忆有关[8,9]。我们的行为学结果表明，褪黑素可抑制大鼠空间学习记忆。为了解褪黑素对海马CA1区LTP的作用，我们又进行了以下工作：将13只大鼠随机分为2组: C 组（n=7），强直前10分钟海马CA1区注射生理盐水（0.5 μl）；M2组(n=6)，强直前10 min海马CA1区注射褪黑素（0.5 μl, 4μg/μl）。

 

图2.褪黑素对大鼠水迷宫行为的影响

Fig.2.Effects of melatonin on behaviour of rats during training in Morris water-maze.  Cont, control group,  1 ml saline (i.p.)  was  applied  at 30 min before training (n=8); M, melatonin group, 1  ml melatonin (2.5 mg/kg body weight, i.p.)   was  applied  at 30 min before training (n=8). **P<0.01 (M vs Cont). A: Escape latency of rats during training in Morris water-maze. B: Mean values of escape latency of rats during last-4-day-training in Morris water-maze. C: Crossing annulus coefficient of rats in Morris water-maze.

 

测定了强直前两组给药前后fEPSP斜率，发现C组给药前后fEPSP斜率为基准值的100±1.24%与100.91±1.09%，M2组则为基准值的100±1.64%与100.54±1.36%。经检验，两组给药前后fEPSP斜率均无显著差异（P>0.05）。可见海马CA1区注射褪黑素对海马CA1区fEPSP斜率无影响。在给药10  min后给予强直刺激诱导LTP，结果如图3、 表1所示。与C组相比，强直后M2组fEPSP斜率明显变小（P30<0.01，P60<0.01），说明海马CA1区注射褪黑素对CA1区LTP有极显著的抑制作用。

2.3 东莨菪碱对褪黑素致海马CA1区LTP抑制的影响

 

图3.褪黑素、 东莨菪碱及荷包牡丹碱对大鼠海马CA1区LTP的影响

Fig. 3.Effects of melatonin, scopolamine, and bicuculline on LTP in hippocampal CA1 area in rats. C, microinjection of 0.5 μl saline into CA1 area (n=7);   M2, microinjectin of 2 μg melatonin into CA1 area (n=6); SM, microinjection of 2 μg scopolamine before 2 μg melatonin into CA1 area (n=6); BM, microinjection of 1 μg bicuculline 10 min before 2 μg melatonin into CA1 area (n=7). A: Representative traces of field EPSP （average of 5 consecutive sweeps）were sampled from the typical experiment at the indicated time points. Horizontal bar,  5 ms; vertical bar,   0.4 mV.   B: Long-term potentiation in hippocampal CA1 area in rats. In each individual, field EPSP slope has been normalized as a percentage of the mean field EPSP slope for the baseline (before tetanus). High-frequency stimulation was applied as described in the text at " 0 "  min. C: Comparison of the fEPSP slope (% of baseline) at 60 min after tetanus. **P<0.01， compared with C; #P<0.05，  compared with M2.

 

褪黑素对大鼠空间学习记忆及海马CA1区LTP具有明显的抑制作用，其机制如何？考虑到海马内胆碱能活动对学习记忆具有一定作用，我们在海马CA1区预先给予了乙酰胆碱 M 受体阻断剂东

 

表1. 褪黑素、 东莨菪碱及荷包牡丹碱对海马CA1区LTP的影响

Table 1.   Effects of melatonin, scopolamine, and bicuculline  on LTP in hippocampal CA1 area in rats

After tetanus

(min)[]Group C

（n=7）(%)[]Group M2

（n=6）(%)[]Group SM

(n=6) (%)[]Group BM

 (n=7) (%) 0.5[]211.32±25.36[]155.25±7.37[]148.20±10.36[]194.90±5.01 30[]187.47±8.77[]121.08±3.29**[]125.94±8.52**[]175.62±11.10 60[]169.71±6.48[]114.28±1.80##[]113.70±5.55##[]162.29±10.52 **P30<0.01； ##P60<0.01, compared with C.

 

莨菪碱，再观察褪黑素对LTP的作用。实验在6只大鼠上进行，称为SM组，先给予东莨菪碱（0.5 μl，4 μg/μl），再给褪黑素（0.5 μl，4 μg/μl），10 min后强直。如图3、 表1所示，强直后，SM组fEPSP斜率已明显低于C组（P30<0.01, P60<0.01），强直后第60分钟其fEPSP斜率百分比已在基准值的130%以下，与单独给予褪黑素组无明显差异（P>0.05）。结果提示,褪黑素对海马CA1区LTP的抑制作用，不受东莨菪碱的影响。

2.4 荷包牡丹碱对褪黑素致海马CA1区LTP抑制的影响

褪黑素对海马CA1区LTP的抑制作用不受东莨菪碱的影响，意味着褪黑素对LTP的抑制作用可能不通过胆碱能系统作用。GABA是中枢神经系统内广泛分布的抑制性递质，有研究表明，褪黑素的作用与GABA及GABA受体有关。为了观察褪黑素对LTP的作用是否是通过GABA系统作用，我们在7只大鼠上进行了以下实验：海马CA1区注射荷包牡丹碱(0.5 μl，2 μg/μl) 10 min后给予褪黑素（0.5 μl，4 μg/μl），10 min后强直。此组称BM组，结果如图3、 表1所示。比较各组强直后60 min的fEPSP斜率发现，BM组可诱导较强的LTP，60 min后其fEPSP斜率与C组已无显著性差异(P60>0.05)， 但与单独给予褪黑素组差异显著（P<0.05）。说明海马CA1区注射1 μg荷包牡丹碱，能阻断褪黑素导致的对海马CA1区LTP的抑制效应。提示褪黑素对LTP的抑制作用，可能通过GABA能系统介导。

 

3讨论

目前, 关于褪黑素与学习记忆关系尚无定论[1~4]。本实验的行为学研究结果支持褪黑素抑制学习记忆的观点。我们的结果似乎与褪黑素增强记忆的观点并不一致，但这并不矛盾。因为学习记忆有多种类型，涉及的脑区也各不相同，而上述实验采用的记忆测定方法与我们的不同，动物种属也不尽相同，甚至有的实验是在损伤动物的学习记忆功能的动物模型上进行的，因而结果与本实验不一致完全有可能。而且，由于不同实验采用的给予褪黑素的方法、时间以及给药剂量并不相同，也可能造成不同结果。James等曾发现，当血液中内源性褪黑素处于高浓度时，外用褪黑素不起催眠作用；而且，褪黑素的半衰期较短，无法持续地长久作用。结合上述行为学资料中不同观点的实验证据可以推测，褪黑素对学习记忆的影响与给药剂量和时间似乎有一定关系。那么高剂量褪黑素对大鼠空间学习记忆力有何影响？此影响是否与褪黑素的给药时间有关？这些问题都有待今后进一步研究证实。同时，我们在整体动物海马CA1区上记录LTP，结果与Morris水迷宫法结果一致，均表现为抑制效应。褪黑素对LTP的抑制效应与Collins等在大鼠海马脑片上，以及Gonzales等在前穿质-齿状回颗粒细胞通路上的研究结果一致[5,6]。有研究认为，表现为LTP形式的海马突触可塑性与空间学习记忆有关[9,10]。我们的结果表明，褪黑素对大鼠空间学习记忆及海马CA1区LTP具有明显的抑制作用，这一结果为表明海马LTP与水迷宫学习显著相关提供了有力证据，且支持褪黑素抑制学习记忆的观点。

褪黑素如何抑制大鼠空间学习记忆？我们推测可能与褪黑素对海马的抑制作用有关。褪黑素可抑制海马神经元电活动。在脑内，褪黑素是一种抑制性的调节物质，它对中枢神经系统大多数神经元电活动呈抑制效应，对海马神经元也是如此。有人在侧脑室给予大鼠褪黑素或微电泳给予褪黑素，均观察到其对海马单位放电的抑制效应[11,12]。其次，海马内存在着褪黑素受体[13]，这提示褪黑素效应是特异性的。

研究认为，胆碱能至海马和新皮层的输入在学习与记忆中发挥着重要的作用[14]。Bachurin曾报道，大鼠侧脑室注射AF64A（一种胆碱能神经毒素）可抑制其主动回避学习和记忆的保持以及水迷宫行为。而每天给予N-acetylserotonin、褪黑素及其新合成的派生物CA-15 和 CA-18（0.3～3.0 mg/kg，连续12～14 d），可剂量依赖性地反转AF64A的作用[15]。此外有人报道, 在兔视网膜中，褪黑素可能通过直接作用于胆碱能无长突细胞，或间接作用于GABA能神经元，从而抑制ACh的释放[16]。尽管还有人发现褪黑素可影响外周ACh释放[17]，但至今尚未见有资料显示褪黑素和海马ACh的含量有何关系。本实验用胆碱能M受体拮抗剂东莨菪碱，研究其对褪黑素致海马LTP抑制的影响，发现东莨菪碱不能阻断褪黑素致海马CA1区LTP的抑制效应。结果表明, 褪黑素对海马LTP的抑制作用，可能不是通过胆碱能系统介导的。这一结论还有待于神经生化机制研究的进一步证实。

本研究还发现，预先在海马CA1区注射GABAA受体的特异性阻断剂荷包牡丹碱， 褪黑素导致的LTP抑制不再出现， 这一结果目前尚未见报道。有资料表明，褪黑素的作用与GABA及GABA受体有关。GABAA与苯二氮（benzodiazepine）具有很强的亲和作用，这类药物能通过目前还不清楚的途径提高GABA能突触的兴奋性，增加GABA开放Cl-通道的能力。褪黑素具有许多与苯二氮药物相似的药理作用[18]。褪黑素还能增加大鼠下丘脑、小脑、大脑皮层的GABA含量[19]。长期给予褪黑素，则可增强大鼠脑内GABA亲和力， 抑制GABA门控的氯离子通道阻断剂t-[35S]butylbicyclo-phosphorothionategn与氯离子通道的结合[２０]。此外，Stankov还报道了褪黑素及其类似物2-吲哚褪黑素能协同GABA抑制神经元放电。由此可见，褪黑素能够增强GABA能神经传递，引起细胞膜超极化，可通过多种途径增强GABA的中枢抑制作用。我们的研究发现，预先在海马CA1区注射荷包牡丹碱，褪黑素导致的对海马CA1区LTP的抑制效应就不再出现。有理由相信，褪黑素对海马LTP的抑制作用，可能是通过GABA系统介导的。

 

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