Received 2001-12-17  Accepted 2002-01-29

  *Corresponding author. Tel: +86-351-4135117;  Fax: +86-351-4083014; E-mail: zhzhizhi@sina.com.cn

生理学报, Aug. 2002, 54  (4): 317～320

Acta Physiologica Sinica  

研究论文

肾血管性高血压大鼠发病过程中心血管AT1-受体自身抗体的变化

支建明,  赵录英,  焦向英,  赵荣瑞

山西医科大学心血管生理研究室,  太原 030001

 

摘 要:   实验观察了肾血管性高血压(RVH)大鼠血浆中抗AT1-受体自身抗体在发病过程中的作用及其变化规律。采用两肾一夹Goldblatt RVH模型,  以合成的大鼠AT1-受体细胞外第二环165-191位氨基酸序列作为特异性抗原,  用SA-ELISA 法检测大鼠血清中抗AT1-受体自身抗体。结果表明,  RVH模型组术后2周时大鼠血清中抗AT1-受体自身抗体的阳性率和平均滴度与术前相比明显增高,  较高的阳性率和平均滴度持续几周后逐渐下降,  12周时下降到正常水平。结果提示, 自身免疫机制参与了高血压的形成,  抗AT1-受体自身抗体可能与心肌肥厚有关。

 

关键词: 肾血管性高血压; 血管紧张素Ⅱ;   受体; 自身抗体

学科分类号: Q463

 

Changes in autoantibody against cardiovascular AT1-receptor during development of renovascular hypertension in rats

ZHI Jian-Ming*,  ZHAO Lu-Ying,  JIAO Xiang-Ying,  ZHAO Rong-Rui

Department of Physiology,  Shanxi Medical University,  Taiyuan 030001

 

Abstract:   The aim of this study was to observe the change in angiotensinⅡ receptor subtype 1 (AT1) autoantibody during the development of renovascular hypertension (RVH). The Goldblatt renovascular hypertension model was established by the two-kidney one-clip method,  and a synthetic peptide corresponding to amino acid sequence 165-191 of the second extracellular loop of the AT1-receptor was used as the antigen. Sera AT1-receptor autoantibody was detected by  SA-ELISA. It was shown that two weeks after operation both the frequency of occurrence and the titre of autoantibodies to AT1-receptor were significantly increased as compared with the pre-treatment control. The increase in autoantibodies lasted  several weeks and then decreased gradually to the pre-clipping level at 12 weeks. It is suggested that autoimmune mechanisms are involved in the pathogenesis of renovascular hypertension and the AT1 autoantibodies  may  be one of the mechanisms leading to cardiac hypertrophy.

 

Key words: renovascular hypertension;  angiotensin-Ⅱ;   receptor;  autoantibody

 

两肾一夹型肾血管性高血压(renovascular hypertension,  RVH)大鼠的发病机制主要是与肾素-血管紧张素系统(RAS)的活性增强密切相关[1],  而且心脏局部的RAS的活性也有增强[2]。RAS中主要发挥作用的血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ),  通过自分泌和旁分泌方式,  作用于与AngⅡ 具有高度高亲和力的AT1受体[3],  可引起心肌丝裂素活化蛋白激酶活性增加,  从而导致心肌细胞增生与肥厚[4, 5]。Fu[6]和Warllukat[7]分别发现, 在恶性高血压病人和先兆子痫病人血清中抗AT1-受体自身抗体明显升高,  通过蛋白激酶C介导可产生具有受体激动剂样活性。那么,  在RVH的发病过程中是否有抗AT1-受体自身抗体产生?  若有,  其规律又如何？有关这方面的观察尚未见报道。本工作通过建立大鼠两肾一夹型RVH模型,  观察了在RVH发病过程中不同时期大鼠血清中抗AT1-受体自身抗体的生成及变化规律,  探讨了抗AT1-受体自身抗体是如何参与RVH形成的。

 

1 材料和方法

1.1  动物及模型制备  30只健康Wistar雄性大鼠(185-198 g),  由山西医科大学动物实验中心提供,  随机分为假手术对照组和狭窄肾动脉组,  每组15只。术前禁食过夜,  自由饮水,  用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg/kg), 仰卧固定,  术野剪毛,  常规消毒皮肤。沿腹正中线作手术切口,  分离左肾动脉,  用一间隙为0.25 mm的U型银夹使左肾动脉部分狭窄,  右肾及动脉不触及(2K1C Goldblatt 高血压)。同龄对照大鼠施假手术。所有大鼠饲以常规固体食料及瓶装饮用水,  在术前及术后不同时点测量空腹体重及清醒状态心率和尾动脉血压。术后4周时收缩压大于150 mmHg者视为已形成高血压。术前及术后不同时点,  采用断尾取血法采血2 ml,  分离血清,  置于-70℃冰箱保存,  待测。

1.2  心功能及心指数测定  最后一次采血后,  动物用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后进行左侧颈总动脉插管,  用MS2000生理多功能分析仪记录心率和平均动脉压(MBP),  之后插管至左心室,  测定左心室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)及左室最大收缩速率(+dp/dtmax)和左室最大舒张速率(－dp/dtmax)。  然后开胸取心脏,  剪开心腔,  以预冷的生理盐水洗去血液,  滤纸吸干水分,  用电子天平准确称量左心室(包括室间隔)重量,  计算心脏重量指数即左心室与体重的比值(LVW/BW)。

1.3  血清中受体自身抗体的检测

1．3．1  抗原多肽合成  按照大鼠AT1-受体细胞外第二环表位肽段人工合成抗原多肽[8]。合成多肽为AT1-受体165-191位氨基酸残基片段(氨基酸序列为(I-H-R-N-V-Y-F-I-E-N-T-N-I-T-V-C-A-F-H-Y-E-S-R-N-S-T -L)。由华中科技大学心血管免疫实验室人工合成。

1．3．2  抗AT1-受体自身抗体的检测  采用链霉亲合-素酶联免疫吸附法(SA- ELISA)检测血清抗AT1-受体自身抗体[9],  操作程序为: (1) 将合成的AT1抗原肽段溶解于100 mmol/L的碳酸钠(pH  11.0)溶液中,  配成10 μg/ml (预实验确定的最佳浓度)的抗原溶液,  包被96孔反应板,  过夜;  (2) 加PMT溶液(PBS液中加入1%小牛血清、0.1% Tween 20、0.1%硫柳汞),  37℃水浴1 h,  封闭反应板; (3) 加入不同稀释倍数血清,  37℃水浴1 h;  (4) 加入1:1000生物素化羊抗鼠IgG单克隆抗体(SAH-IgG/Bio,  中山试剂公司),  37℃水浴1 h; (5) 加入1:800标记有辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲合素(SA-HRP),  37℃温浴1 h;  (6) 将底物ABTS以2 mmol/L的浓度溶解于pH 5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液,  临用前加H2O2 (2.5 mmol/L),  37℃避光30 min;  (7) 加入2 mol/L硫酸终止反应;  (8) 在酶标仪上以450 nm波长测定光密度(OD)值。以上每步加样 50 μl,  每步终了时用PBS-T(含0.1%Tween-20)洗涤3次,  每次5 min。阴性血清制备: 对照组大鼠血清经标准抗原包被测定,  取抗AT1-受体自身抗体阴性的血清13份混合,  分装并保存于－20℃备用。

1．3．3  结果判定  抗体阳性、阴性判定[9]: 以P/N≥2.1为阳性,  P/N≤2.1为阴性。P/N=(标本OD值－空白对照OD值)/(阴性对照OD值－空白对照OD值); 抗体效价判定: 将血清从1:20起连续倍比稀释,  以出现P/N≥2.1的最高稀释度作为该标本的效价。

1．3．4 统计学分析  抗AT1-受体自身抗体滴度用几何均数±标准差,  其他数据采用mean±SD表示,  两组间的差异用t 检验或 χ2检验,  以P<0.05为差异有显著性。

 

2 结果

2.1  狭窄肾动脉高血压组与手术对照组一般情况

用0.25 mm的银夹使左侧肾动脉部分狭窄后,  从第3天起动脉血压急剧升高,  心率也随之加快,  10 d后血压上升缓慢,  21 d时收缩压平均值由术前的112.7上升到165.3 mmHg,  比手术前高53.2 mmHg,  心率也由360次/min 上升到398次/min,  比术前增加了30多次,  28 d后动脉收缩压和心率趋于稳定,  而假手术对照组动脉收缩压和心率在整个实验过程中变化不大(表1)。2．2  心指数及心功能指标

从表1可见,  两组大鼠处死后,  体重(BW)差别不大。而狭窄肾动脉组与对照组相比,  在术后16周时,  无论是全心重(HW),  左心室重(LVW),  还是全心重/体重(HW/BW)都显著增加。RVH组LVW/BW指数为假手术对照组的1.49倍。模型组大鼠LVSP和LVEDP均明显升高,  分别为171.2±8.8和9.27±1.81 mmHg; +dp/dtmax和－dp/dtmax明显降低,  分别为对照组的76.3%和74.8% (表1)。2．3  抗AT1-受体自身抗体滴度及阳性率的变化

术前,  少数正常大鼠血清中也有抗AT1-受体自身抗体存在,  但滴度较低。术后2周,  高血压组大鼠血清中自身抗体滴度水平和阳性率分别为 1:136.4 ±1.9和40.0％均较术前有显著升高 (P<0.05)。以表 1.术后16周时两组大鼠体重、 左心室重、 平均动脉压和心功能

  Table 1. Body weight (BW),  left ventricular weight (LVW),   mean blood pressure (MBP) and  cardiac function of control group and RVH group    16 weeks after operation (mean±SD, n=15)

 

Body (g)

LVW/BW (mg/g) 

 MBP (mmHg)

 LVSP (mmHg)

 LVEDP (mmHg)

 +dp/dt

(mmHg/s)

 -dp/dt

(mmHg/s)

 RVH

421±21 

2.63±0.32* 

132.6±3.5*

171.2±8.8* 

9.27±1.81*

3466±305*

3016±332*

Control

454±28 

 1.76±0.23

 94.6±3.7  

117.7±4.2 

 4.62±1.60 

4543±312

4033±342

*P<0.05 vs control.RVH, renovascular hypertension.

 

表 2.实验组大鼠血清中抗AT1受体自身抗体阳性率和滴度、 心率和收缩压的变化

 Table 2. Changes in frequency and titre of AT1 receptor autoantibodies in serum,   heart rate (HR) and systolic blood pressure (SBP, mmHg) of rats

Time

(week)

2 K1C  group (n=15)

Control   group (n=12)

Frequency (%)

Titre

HR

SBP

Frequency (%)

Titre

HR

SBP

0

6.67(1/15)

1:40.0±0.0

354±27

108±6

6.67(1/15)

1:40.0±0.0

358±29

108±6

1

26.67(4/15)*

1:107.3±1.5*

372±31 

 141±7*

6.67(1/15)

1:40.0±0.0

362±30 

109±7

2 

53.33(8/15)*

1:136.4±1.9*

396±33*

162±12*

6.67(1/15)

1:40.0±0.0

366±38 

108±7

4

73.33(11/15)*

1:154.6±3.4*

398±32*

164±14* 

13.33(2/15)

1:32.6±1.2

348±36

109±7

6

80.00(12/15)*

1:162.7±2.7*

396±28*

162±12*

6.67(1/15)

1:38.7±1.4

360±30

110±8

8

46.66(7/15)*

1:132.6±2.5*

387±36* 

160±11*

13.33(2/15)

1:40.0±0.0

362±30

109±7

10

33.33(5/15)*

1: 98.7±2.5*

403±34*

163±12*

13.33(2/15)

1:45.4±1.5

363±33

105±6

12

26.67(4/15)

1: 62.7±2.5

408±26* 

167±14*

6.67(1/15) 

1:40.0±0.0

352±32  

107±8

14

20.00(3/12)

1: 71.4±2.3

389±30*

165±12* 

6.67(1/15)

1:40.0±0.0

366±34

108±7

16

13.33(2/15)

1: 63.5±2.1

388±35*

166±15*

6.67(1/15)

1:40.0±0.0

364±32  

110±9

  Values are expressed as geometric mean±SD or mean±SD.*P<0.05  vs pre-clipping.

 

后抗体滴度和阳性率继续升高,  第6周时达到峰值,  分别为1:162.7±2.7和80%; 从第8周起; 抗体滴度开始下降,  术后12周,  基本回到术前水平。而假手术组大鼠血清中抗体滴度及阳性率与术前相比,  均无明显变化(表2)。

 

3 讨论

本实验通过建立两肾一夹型高血压模型,  利用SA-ELISA法检测模型大鼠不同时期血清中抗AT1-受体自身抗体的产生及存在情况。  结果发现,  在术后2周时血压即已升高,  同时血清中也可检测到抗AT1-受体自身抗体的存在,  其滴度和阳性率显著高于处理前,  6周时滴度和阳性率达到高峰,  而后逐渐下降。该结果表明,  在RVH发生过程中,  血清中确实有抗AT1-受体自身抗体存在,  其血清中的滴度水平出现先升高后降低的变化。

在本实验中,  手术处理前的动物及假手术对照组大鼠的血清中也出现了抗AT1-受体自身抗体,  但滴度和阳性率较低。这是因为机体免疫系统的调节是一种多因子、多环节的极其复杂的功能,  在生理状态下,  随时可能有正常-异常-正常的动态过程,  在这个过程中,  免疫系统就可能针对自身抗原产生相应的自身抗体。目前认为, 正常人的血清中可以有针对自身抗原的自身抗体,  但效价很低,  其作用是清除体内衰老蜕变的细胞,  称为生理性抗体[10]。而在本实验中,  实验组大鼠血清中的抗AT1-受体自身抗体滴度和阳性率明显高于术前和对照组,  说明狭窄肾动脉可以导致机体免疫功能紊乱,  从而产生自身抗体。狭窄肾动脉后,  由于肾脏缺血可导致肾脏内肾素合成和分泌增多,  进而增高血液中Ang Ⅱ 水平。Ang Ⅱ  作用于AT1受体可产生多种作用,  可以使全身微动脉平滑肌收缩,  血压升高; 也可使静脉收缩,  回心血量增加,  从而使心脏的前、后负荷均增加; Ang Ⅱ 也可直接作用于心肌与血管的各种成分,  使心肌细胞肥大,  间质纤维化,  发生心肌肥厚,  形成重构,  从而使心室重量增加[3]。

Nawata等[11]人发现,  用AT1-受体细胞外第二环肽165-191位氨基酸肽段免疫兔所产生的抗体,  可使新生鼠心肌细胞产生类似血管紧张素 Ⅱ 的AT1-受体激动剂样作用,  其效应表现为增加心肌细胞的收缩频率且并不随时间而失敏感。 进一步研究证实, 抗AT1-受体自身抗体可与AT1-受体特异性结合,  产生与血管紧张素 Ⅱ 相似的受体激动剂样活性[8];  并且具有促进体外培养的大鼠心脏组织的心肌细胞和非心肌细胞的增生作用[8]。Dechend[12]等人发现, 在先兆子痫病人血清中存在抗AT1-受体自身抗体,  从血清中提纯的AT1-受体自身抗体的IgG,  作用于血管平滑肌细胞和中华仓鼠卵巢细胞可产生组织因子,  这种组织因子与Ang  Ⅱ 作用于AT1-受体所产生的组织因子完全相同。

因此可以认为, 狭窄肾动脉这一处理因素可引起血浆中血管紧张素 Ⅱ 升高及AT1-受体自身抗体产生增多,  两者共同作用于AT1-受体,  从而产生诸多生物学效应。大鼠在肾动脉狭窄术后8周左右即已形成明显的左心室肥厚[13],  而AT1-受体自身抗体在术后6周时达到高峰,  抗AT1-受体自身抗体是否与Ang  Ⅱ 一起参与了心脏肥厚的发生,  有待于进一步研究。

 

参 考 文 献

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