Received 2001-12-10  Accepted 2002-01-24

  This work was supported by the National Natural  Science Foundation of China  (No.39970381).

  *Corresponding author. Tel: +86-571-87217139; E-mail:  Lijc@mail.hz.zj.cn

生理学报, Aug. 2002, 54  (4): 333～336

Acta Physiologica Sinica 

研究论文

一氧化氮对大鼠胸膜淋巴孔调控及淋巴吸收的影响

李燕园,    李继承*

浙江大学医学院细胞生物学与组织工程学研究所淋巴学研究室,  杭州 310031

 

摘 要:   实验研究了一氧化氮 (nitric oxide, NO)对大鼠胸膜淋巴孔的调控和胸膜腔淋巴吸收的影响。NO供体和NOS (nitric oxide synthase)抑制剂分别经腹腔给药, 示踪剂 (台盼蓝)胸膜腔内注射后, 处死大鼠, 测定血清NO和台盼蓝浓度; 在扫描电镜下观察各组胸膜淋巴孔, 用计算机图像处理, 统计学分析。结果显示, NO供体组血清NO浓度为49.34±18.47 μmol/L, 淋巴孔的面积和密度分别为6.80±1.13 μm2和170.24±66.60 /0.1 mm2 ; NOS抑制剂组血清NO浓度为17.72±6.58 μmol/L, 淋巴孔的面积和密度分别为5.72±1.54  μm2和61.71±12.73/0.1 mm2。血清NO浓度与淋巴孔开放的面积和密度成正相关 (P<0.05)。在胸膜腔给示踪剂后, NO供体组血清台盼蓝的浓度为74.68±33.67 mg/L, 与对照组比较有显著差异 (P<0.05)。 提示, NO可以调控胸膜淋巴孔, 促进胸膜腔淋巴吸收。

 

关键词: 胸膜; 淋巴孔; 淋巴吸收; 一氧化氮

学科分类号: Q954.2; R561

 

Effects of nitric oxide on pleural lymphatic stomata and   lymphatic drainage in the rat

LI Yan-Yuan,  LI Ji-Cheng*

Department of Lymphology, Institute of Cell Biology and Tissue Engineering, Zhejiang University  School of Medicine,     Hangzhou 310031

 

Abstract:   To investigate the effects of nitric oxide (NO) on the pleural lymphatic stomata and lymph absorption from the pleural cavity, the NOS (nitric oxide synthase) inhibitor Nω-nitro-L-arginine-methyl-ester     (L-NAME) and the NO donor isosorbide dinitrate  (ISDN)  were injected into the peritoneal cavity of the rats respectively.  Trypan blue was used as a tracer.  Then the concentrations of NO and trypan blue in the blood serum were measured, and the ultrastructural changes in pleural lymphatic stomata were observed under a scanning electron microscope (SEM) and studied by a computer image processing system attached to SEM.  It turned out that the concentration of NO in the serum was 49.34±18.47 μmol/L, and the area and density of the pleural lymphatic stomata were 6.80±1.13  μm2 and 170.24±66.60 /0.1 mm2 respectively in the NO donor group.  The concentration of NO reduced to 17.72±6.58 μmol/L, and the area and  density of the pleural lymphatic stomata were 5.72±1.54  μm2 and 61.71±12.73/0.1 mm2 in the NOS inhibitor group.  We found that the area and density of the pleural lymphatic stomata were positively correlated with the NO quantity.  After the tracer was injected into the pleural cavity, the NO donor group exhibited a higher trypan blue concentration than the control group.  The ability of the pleura to absorb trypan blue was enhanced because of the large opening of the stomata.  It is suggested that NO can increase lymph absorption of the pleura by relaxing pleural lymphatic stomata.

 

Key words: pleural; lymphatic stomata; lymph absorption; nitric oxide

 

   1975年Wang[1]首次报道了小鼠胸膜淋巴孔, 李继承[2]等亦发现了人体膈胸膜淋巴孔, 认为胸膜淋巴孔系胸膜下毛细淋巴管的开口, 是胸膜间皮上的恒定结构, 与胸膜腔的物质吸收有关;  并指出, 胸膜淋巴孔参与了胸膜腔内的病理生理过程, 可能在胸腔积液的转归、 炎症的播散、 肿瘤的转移, 以及矽肺的形成中有重要作用。近年来的研究亦证实胸膜淋巴孔可以引流胸膜内的积液、 颗粒样物质和细胞成分等进入胸膜下淋巴管, 最终汇入脉管系[3-5]。然而, 在生理状态下, 胸膜淋巴孔的开放数量和分布密度均较少, 故淋巴孔的开放和淋巴引流无疑受到某些因素的调控。Tsilibary[6]等认为, 呼吸引起的膈肌舒张和收缩可影响腹膜淋巴孔的开合; 李继承[7]等的实验结果表明, 高浓度NO可通过舒张腹膜淋巴孔, 使腹透液吸收增加, 且与腹膜透析失超滤有关。但目前尚无对胸膜淋巴孔和淋巴引流调控机制的报道。由于胸膜和腹膜在结构和功能上的相似性, 我们应用NO供体和NOS抑制剂, 研究NO对胸膜淋巴孔的调控作用, 并使用示踪剂观察NO对胸膜腔淋巴吸收的影响。

 

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组  普通级SD大鼠24只, 体重200-250 g, 雌雄不拘, 由浙江医学科学院实验动物中心提供。随机分为对照组 (8只)、  NO供体组 (8只)、  NOS抑制剂组 (8只)。

1.2 实验方法  NO供体组: 二硝基异山梨醇 (isosorbide dinitrate, ISDN) (Sigma公司)10 mg/kg腹腔注射; NOS抑制剂组: Nω-硝基-L-精氨酸甲酯 (Nω-nitro-L-arginine-methyl-ester, L-NAME) (Sigma公司) 200 mg/kg腹腔注射; 对照组: 等量生理盐水腹腔注射。每组注射2次/日, 连续8 d。第8 d, 在3组大鼠分别腹腔注射ISDN、 L-NAME和生理盐水后30 min, 胸膜腔注射2%台盼蓝0.4 ml, 20 min后断头取血, 分离血清, 置于－20℃冰箱备用; 同时取胸廓, 经PBS缓冲液充分漂洗后, 固定于4℃, 2.5%戊二醛 (pH 7.4)液中。

1.3 NO浓度测定  按文献[8]方法, 取上清液50 μl, 加入等量Griess试剂, 混匀, 室温放置10 min, 于CliniBio 128c全自动酶标仪570 nm处测定光密度 (A)值, 以NO－2的量表示NO含量, 并以NaNO2为标准品绘制标准曲线, 将A值换算为μmol／L。

1.4 台盼蓝浓度测定  用CliniBio 128c全自动酶标仪在620 nm处测定吸光度 (A)值, 并以正常大鼠血清配置台盼蓝标准品, 绘制标准曲线, 将A值换算为mg/L。

1.5 扫描电镜制样与观察  取大鼠肋间部组织切成5 mm×5 mm, 用2.5%戊二醛和1%锇酸双固定, 2%单宁酸导电处理, 梯度乙醇脱水, 醋酸异戊酯置换。用日立Eiko HCP-2型临界点干燥仪干燥, 日立Eiko IB-5型离子溅射仪镀金, 日立Stereoscan 260扫描电镜观察, 加速电压为20 kV。

1.6 计算机图像处理  电镜图像视频信号经图像采样卡 (FlyVideo 98, 台湾)采样, 主要技术指标: (1) 图像分辨率为640×480×8 bits (黑白)和640×480×24 bits (彩色); (2) 图像采集时间为30帧/s; (3)显示图像为真色彩 (2563种色彩)。然后用Elescope 1.0图像处理软件进行分析处理。该软件根据图像的灰度值, 可对采样后的数字图像进行自动和半自动分析, 自动生成待测淋巴孔周长、 面积以及密度等多项指标的数值。

1.7 统计分析  实验数据以mean±SD表示,组间差异用方差分析 (t检验), 并作Pearson相关分析。

 

 2 结果

在扫描电镜下, 可观察到覆盖在大鼠肋胸膜上的两种形态的间皮细胞, 即扁平形间皮细胞 (flattened mesothelial cells)和立方形间皮细胞 (cuboidal mesothelial cells)。前者细胞体积较大, 细胞表面有长而密集的微绒毛, 相邻细胞互相连续, 细胞轮廓不清, 见图1A。后者细胞体积较小, 细胞表面微绒毛短而稀疏, 细胞明显凸向胸膜腔。胸膜淋巴孔仅位于相邻立方形间皮细胞之间, 多呈簇状分布, 其形态呈圆形或椭圆形。淋巴孔由立方形间皮细胞的突起和胞体共同围成, 见图1B、 C、 D。

  与对照组比较, NO供体组大鼠胸膜淋巴孔分布密度显著增加 (P<0.05), 而NOS抑制剂组明显

 

表 1. NO对大鼠胸膜淋巴孔的影响

Table 1. Effect of NO on the pleural lymphatic stomata of the rat (mean±SD)

Groups	Average area  (μm2)	Average density  (/0.1 mm2)
Control	6.36±1.81	91.61±20.27
NO donor	6.80±1.13#△	170.24±66.60*
NOS inhibitor	5.72±1.54△	61.71±12.73*

  *P<0.05 compared with control group; #P<0.01 compared with NOS inhibitor group; △P>0.05 compared with control group.

 图 1. 大鼠肋胸膜表面间皮细胞扫描电镜图

Fig. 1. Scanning electron micrographs of the mesothelial cells in the rat costal pleural.  A:  Flattened mesothelial cells   (FM)  without  interstitial  lymphatic stomata.  ↑,  microvilli.  B:   Cuboidal  mesothelial cells  (CM) and  lymphatic stomata (S) of the control group.    C:   Cuboidal  mesothelial cells  (CM) and  lymphatic stomata (S) of the NOS inhibitor group.  D: Cuboidal mesothelial cells  (CM) and  lymphatic stomata (S) of the NO donor group. S,  lymphatic stomata;  ▲,  particles of trypan blue;  ↑,  microvilli. 

 

减少 (P<0.05)。虽然NOS抑制剂组和NO供体组较对照组淋巴孔面积的差异没有统计学意义 (P>0.05), 但NO供体组淋巴孔面积明显大于NOS抑制剂组 (P<0.01) (表1, 图1B、 C、 D)。 在扫描电镜下观察,  胸膜腔注入台盼蓝后, 见台盼蓝颗粒被吸收进入淋巴孔内。NO供体组淋巴孔内的台盼蓝颗粒显著多于其余两组, 这一结果与血清台盼蓝浓度相一致 (表2, 图1B、 C、 D), 表明NO促进了淋巴孔开放, 导致淋巴孔对胸膜腔内的物质吸收增加。

  在腹腔内分别给予ISDN和L-NAME后, NO供体组大鼠血清NO浓度明显高于对照组 (P<0.05), 而NOS抑制剂组则低于对照组 (P<0.05)。相关性分析显示, 大鼠血清ＮＯ浓度和胸膜淋巴孔开放的面积 (r=0.47, P<0.05)、 密度 (r=0.57, P<0.05)呈正相关。当胸膜腔注射台盼蓝后, NO供体组血清台盼蓝的浓度明显高于对照组 (P<0.05), 而NOS抑制剂组血清台盼蓝的浓度虽然低于对照组, 但两者间的差异无统计学意义 (P>0.05, 表2)。同时, 胸膜淋巴孔分布面积 (r=0.50, P<0.05)、 密度 (r=0.67, P<0.01)与血清台盼蓝的浓度亦成正相关。

 

表 2. 大鼠血清中NO及台盼蓝含量

Table 2. Quantity of NO and the trypan blue in the rat blood serum (mean±SD)

Groups	NO (μmol/L)	Trypan blue(mg/L)
Control	27.67±9.84	38.94±13.95
NO donor	49.34±18.47*	74.68±33.67*
NOS inhibitor	17.72±6.58*	25.13±15.17△

*P<0.05 compared with control group; △P>0.05 compared with control group.

 

3 讨论

NO是NOS作用于底物L-Arg所产生的, 作为一种新型的细胞信使分子, 广泛参与机体心血管、 免疫和神经系统的生理和病理调节。最近, Choe[9]和Soini[10]的实验表明, 病理状态下胸膜间皮细胞可以被诱导产生大量NO, 这些NO可能与石棉纤维引起的肺损害、  胸膜间皮瘤和胸膜转移性腺癌的发生有关。Doboszynska[11]等还证实, 猪的子宫阔韧带淋巴孔聚集区立方型间皮细胞有NOS活性, 并推测NO对淋巴孔可能有调节作用。

为证实NO对淋巴孔的调控作用, 本实验分别应用ISDN和L-NAME作为NO供体和NOS抑制剂。前者属于硝酸酯类药物, 通过体内代谢后产生NO, 作用较持久; 后者与L-Arg结构相似, 当L-NAME过多时, 可以竞争抑制L-Arg生成NO的过程。实验结果发现, ISDN和L-NAME分别使大鼠血清NO浓度升高和降低, 表明这两种药物腹腔内应用, 可以稳定地改变大鼠血清NO浓度。在NO供体组, 随NO浓度的升高, 胸膜淋巴孔的分布密度增加和淋巴孔开放面积的增大, 淋巴孔对台盼蓝的转归能力亦增强。然而, NOS抑制剂组的结果与NO供体组相反。我们的实验结果首次证实, NO具有对胸膜淋巴孔的调控作用, 能促进淋巴孔的开放, 加速胸膜腔内淋巴转归。目前认为, NO对胸膜淋巴孔的调控作用, 可能是通过NO激活鸟苷酸环化酶 (GC), 使环磷酸鸟苷 (cGMP)升高, cGMP的升高则主要作用于cGMP依赖性蛋白激酶 (cGKs)使Ca2+依赖的细胞内传导信号蛋白磷酸化, 细胞内Ca2+减少, 从而抑制Ca2+介导的肌球蛋白轻链磷酸化, 使细胞舒张, 淋巴孔开放。cGMP还可以增加钙ATP酶对Ca2+的摄取或直接作用于收缩蛋白, 使细胞舒张。此外, cGMP还可能通过特异性抑制磷酸二酯酶活性、 阻止cAMP降解, 从而加强cAMP介导的舒张作用。然而迄今为止，对淋巴孔调控的细胞内信号传导, 尚无实验证据, 有待进一步的研究。

 

参 考 文 献

[1] Wang NS. The preformed stomas connecting the pleural cavity and the lymphatics in the parietal pleura. Am Rev Respir Dis, 1975,3:12-20.

[2] Li JC. Ultrastructure study on the pleural stomata in human. Func  Develop Morphol, 1993,3:277-280.

[3] Wang QX, Ohtani O, Saitoh M, Ohtani Y. Distribution and ultrastructure of the stomata connecting the pleural cavity with lymphatics in the rat costal pleura. Acta Anat, 1997,158:255-265.

[4] Wang PM, Lai-Fook SJ. Regional pleural filtration and absorption measured by fluorescent tracers in rabbits. Lung, 1999,177:289-309.

[5] Miura T, Shimada T, Tanaka K, Chujo M, Uchida Y. Lymphatic drainage of carbon particles injected into the pleural cavity of the monkey, as studied by video-assisted thoracoscopy and electron microscopy.  J  Thorac  Cardiovasc  Surg,  2000,120:437-447.

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[9] Choe N, Tanaka S, Kagan E.  Asbestos fibers and interleukin-1 upregulate the formation of reactive nitrogen species in rat pleural mesothelial cells.  Am J Respir Cell Mol Biol, 1998,19:226-236.

[10] Soini Y, Kahlos K, Puhakka A, Lakari E, Saily M, Paakko P, Kinnula V.  Expression of inducible nitric oxide synthase in healthy pleura and in malignant mesothelioma. Br J Cancer, 2000,83:880-886.

[11] Doboszynska T, Andronowska A, Modzelewska B.  Immunohistochemical localization of ET-1 and eNOS in lymphatic stomata of the porcine broad ligament of the uterus.  Folia Histochem Cytobiol, 2001,39:15-22.