Received 2002-01-03 Accepted 2002-01-30
State Major Basic Research Development Program supported this work (No.G2000056905).
*Corresponding author. Tel: +86-10-66176255; Fax: +86-10-66176255. E-mail: tangchaoshu@263.net
生理学报, Aug. 2002, 54 (4): 337～341
Acta Physiologica Sinica
研究论文
左旋硝基精氨酸诱导的高血压大鼠心肌和血管的肾上腺髓质素与受体活性修饰蛋白2表达的变化
齐永芬1,２， 石彦荣1, 卜定方1, 蒋宏峰2, 高 霖2, 庞永正1, 唐朝枢1,2,*
1北京大学第一医院心血管病研究所, 北京 100034;
2 北京大学医学部生理系, 北京 100083
摘 要: 探讨高血压大鼠心肌和血管的肾上腺髓质素 (adrenomedullin, ADM)与受体活性修饰蛋白2 (receptor activity-modifying protein 2, RAMP2) mRNA的变化。用一氧化氮合酶 (NOS)竞争性抑制剂左旋硝基精氨酸 (L-NNA)阻断NOS制备大鼠高血压模型。用放射免疫分析方法测定血浆、心肌和血管ADM含量, 及竞争性定量RT-PCR方法测定心肌和血管ADM mRNA与RAMP2 mRNA含量。结果表明, NOS阻断剂L-NNA应用4周后动物血压明显升高、心肌肥厚。心重 (mg)/ 体重 (g)比值增加35.5% (P<0.01)。血浆、心肌和血管的ADM-ir较对照组分别增加80%、72%和57% (均P<0.01)。高血压大鼠心肌和血管ADM mRNA含量显著增加, 分别较正常大鼠高50 % (P<0.05)和 102.9 % (P<0.0 5)。高血压大鼠心肌和血管的RAMP2 mRNA含量均显著增加, 分别较正常大鼠高 132% (P<0.01)和 87% (P<0.01 )。高血压大鼠心肌和血管ADM的升高与RAMP2的升高程度呈明显的正相关, 其相关系数分别为0.741和0.885。上述观察结果表明, 高血压时血浆、心肌和血管ADM水平升高, 心肌和血管ADM与RAMP2基因表达上调, 提示ADM/RAMP2系统在高血压发病中可能具有重要作用。
关键词: 高血压大鼠; 肾上腺髓质素; 受体活性修饰蛋白2; mRNA
学科分类号: Q57; Q291; R544.1
Changes in adrenomedullin and receptor
activity-modifying protein 2 mRNA in myocardium and vessels during L-NNA-induced hypertension in
rats
QI Yong-Fen1,２, SHI Yan-Rong1, BU Ding-Fang1, JIANG Hong-Feng2, GAO Lin2,
PANG Yong-Zheng1, TANG Chao-Shu1,2,*
1Institute of Cardiovascular Research, the First Hospital, Peking University, Beijing 100034; 2Department of Physiology, Health Science Center, Peking University, Beijing 100083
Abstract: To explore the changes in adrenomedullin (ADM) and receptor activity-modifying protein 2 (RAMP2) mRNA in myocardium and vessels in hypertension, a hypertensive rat model was prepared by administering L-NNA. Contents of ADM in plasma, myocardium and vessels were measured by radioimmunoassay (RIA). The levels of pro-ADM mRNA of myocardium and vessels were determined by competitive quantitative RT-PCR. The results showed that L-NNA induced hypertension and cardiomegaly. The ratio of heart to body weight increased by 35.5% (P<0.01). In hypertensive rats the ir-ADM in plasma, myocardium and vessels was increased by 80%, 72% and 57% (P<0.01), respectively compared with the control. The amounts of ADM mRNA in myocardium and vessels were increased by 50% and 109.2% (P<0.05), respectively, and the amounts of RAMP2 mRNA was increased by 132% and 87% (P<0.01), respectively, compared with control. The levels of ADM in myocardium and vessels were positively correlated with RAMP2 mRNA, the correlation coenficients were 0.741 and 0.885 (P<0.01), respectively. The results obtained indicate that in hypertensive rats, ADM is elevated in plasma, myocardium and ves- myocardium and vessel, and ADM and RAMP2 mRNA are up-regulated in myocardium and vessel. The
ADM/RAMP2 system may play an important role in the pathogenesis of hypertension.
Key words: hypertensive rat; adrenomedullin; receptor activity-modifying protein 2; mRNA
肾上腺髓质素 (adrenomedullin, ADM)是Kitamura等1993年从嗜铬细胞瘤中分离出的血管活性肽, 由52个氨基酸组成, 属于降钙素基因相关肽
(calcitonin gene related peptide,CGRP)家系。心脏和血管组织高表达ADM及其受体, 通过第二信使cAMP产生扩张血管、利钠利尿等广泛的生物学效应[1]。高血压时机体ADM水平代偿性增加,
而转ADM基因对实验性高血压有较好的防治效果[2]。但ADM效应的细胞机制仍远未阐明。最近发现的G蛋白偶联的孤儿受体-降钙素受体样受体 (calcitonin
receptor-like receptor, CRLR)可以ADM作为其配体, 活化腺苷酸环化酶[3]。CRLR的表型取决于膜上特殊的受体活性修饰蛋白
(receptor activity modifying protein, RAMPs)。迄今发现有三种RAMP异构体, 不同的RAMP与CRLR 结合使CRLR表现为不同的受体表型[4]。这种受体-配体-RAMP相互作用的新模式的生理及病理生理意义目前尚不清楚。本工作在一氧化氮合酶
(NOS)竞争性抑制剂左旋硝基精氨酸 (L-NNA)诱导的大鼠高血压模型上观察心血管组织ADM含量及ADM mRNA和RAMP2 mRNA水平的变化, 试图阐明RAMP2在高血压发病中的意义。
1
材料和方法
1.1 动物和材料 Wistar大鼠由北京大学实验动物部提供。ADM放免药盒购于美国Pheonix Pharmaceuticals INC。 左旋硝基精氨酸 (L-NNA)购于Sigma公司。Trizol 购自GIBICO公司, dNTP购自Clontech公司, MMLV逆转录酶、Taq酶、RNAsin, Oligo (dT)15 Primer 为Promega公司产品。9个PCR引物由赛百盛公司合成。 ADM-S: 5'-CTCGACACTTCCTCGCAGTT-3'; ADM-A: 5'-GCTGGAGCTGAGTGTGTCTG-3'(序列根据Gene Bank, NM-012715设计); ADM-T: 5'-AGTGTGTCTGCCTTGAGGGCTGATCTTGTT-3'; RAMP-S: 5'-TGA GGA CAG CCT TCT GTC AA-3'; RAMP-A: 5'-CAT CGC CGT CTT TAC TCC TC-3' (序列根据EMBL: AF181551设计)。 RAMP-T: 5'-CGT CTT TAC TCG ATC ATG GCC AGA AGC ACA T-3'; β-actin引物 S: 5'-ATC TGG CAC CAC ACC TTC-3'; A: 5'- AGC CAG GTC CAG ACG CA-3'; T: 5'-GGT CCA GCA GAC AAT GCC AGT GGT ACG C-3'。
1.2 高血压模型的制备[5] 10周龄雄性Wistar大鼠12只 (150-170 g), 每天分两次腹腔注射NOS抑制剂L-NNA (15 mg/kg), 连续注射28 d, 造成大鼠高血压。对照组注射同等容积生理盐水 (2 ml/kg), 喂养期间动物自由饮食。停止注射后12 h清醒状态下, 用大鼠血压仪 (Model RBP-1)检测大鼠尾动脉压, 20%乌拉坦 (5 ml/kg, i.p.)麻醉。腹主动脉穿刺取血, 加入抑肽酶和EDTA, 离心分离血浆, －70℃保存待测ADM放免活性。动物开胸迅速摘取心脏, 称取心脏重量。取胸腹主动脉, 剥离去外膜。一半动物 (每组6只)取心肌和血管组织加入 1 mol/L醋酸, 沸水浴10 min,Polytron匀浆、 离心, 取上清, 冷冻干燥, －70℃保存。待测ADM放免活性。各组另一半动物 (每组6只)的心肌和血管用于提取RNA。
1.3 心肌、血管总RNA的提取和定量PCR的ADM竞争性内标准的制备 提取正常大鼠肾上腺的总RNA, 逆转录合成cDNA作为模板, 用ADM-S及ADM-A引物作PCR, 放大一段446 bp的ADM cDNA。用ADM-T及ADM-A然后用ADM-S-及ADM-A作为引物, 两次作PCR得到376 bp的DNA片段, 它的序列和上述446 bp片段的序列相同, 但在ADM-S引物序列的下游缺失70 bp,方法见文献[6]。此即为用于ADM mRNA RT-PCR定量的竞争性内标准。为便于保存和定量, 将这两个片段的DNA分别克隆至pBluescript (SK+)的EcoR V位点中, 质粒经扩增、纯化、BamH I酶切线形化和紫外分光光度法定量后备用。用Trizol试剂提取心脏和血管的总RNA, 紫外分光光度计 (SDU-68型)定量。
1.4 ADM mRNA的定量[7] 取1 μg心脏和血管的总RNA, 用MMLV逆转录酶及Oligo (dT)15 primer逆转录成单链cDNA。PCR反应体积为25 μl: cDNA 3 μl, 0.76 fmol/L竞争性内标准质粒1, 5 pmol/L ADM-S及ADM-A引物1 μl, 2.5 mmol/L dNTP 1 μl,含15 mmol/L MgCl2的10×PCR缓冲液2.5 μl, Taq DNA聚合酶1.25单位。 反应条件: 95℃变性5 min, 然后以94℃ 30 s、 61℃ 30 s、 72℃ 40 s 热循环30次。取6 μl PCR产物以1.5%琼脂糖电泳分离和溴乙锭染色后, 用凝胶成像及定量扫描仪测得446和376 bp两条带的光密度之比。参照文献[8]以系列稀释446 bp ADM cDNA质粒代替上述PCR体系中的cDNA, 其它PCR及定量条件均不变, 绘出标准曲线。从标准曲线中求得mRNA的含量。取2 μl PCR产物, 以β-actin引物作PCR, 20个热循环后, PCR产物经琼脂糖电泳, 凝胶成像及定量扫描仪定量, 由β-actin定量的标准曲线中求得标本中β-actin的相对含量, 以校正定量PCR时的加样误差。
1.5 制备定量PCR的RAMP2竞争性内标准 提取正常大鼠肾上腺的总RNA, 逆转录合成cDNA作为模板, 用RAMP2-S及RAMP2-A和RAMP2-T引物按上述制备ADM 竞争性内标准的方法制备RAMP2竞争性内标准。其内标准长度为304 bp的DNA片段, 样本PCR产物的长度为371 bp的DNA片段。为便于保存和定量, 将这两个片段的DNA分别克隆至pBluescript (SK+)的EcoR V位点中, 质粒经扩增、纯化、BamH I酶切线形化和紫外分光光度法定量后备用。
1.6 RAMP2 mRNA的定量 按上述方法逆转录合成单链cDNA和RAMP2 mRNA定量。但用于RAMP2定量PCR的反应体积为25 μl: cDNA 3 μl, 0.35 fmol/L竞争性内标准质粒1 μl, 5 pmol/L RAMP-S及RAMP-A引物1 μl, 2.5 mmol/L dNTP 1 μl,含15 mmol/L MgCl2的10×PCR缓冲液2.5 μl, Taq DNA聚合酶1.25单位, 反应条件: 95℃变性5 min, 然后以94℃ 30 s、 55℃ 30 s、 72℃ 30 s 热循环30次。
1.7 ADM的放射免疫 (RIA)测定[9] 血浆、心肌和血管提取物过Sep-Pak C18柱, 乙氰和三氟乙酸洗脱后用100 μl RIA缓冲液复溶。按ADM放免药盒说明书操作测定ADM含量。其IC50为13-47 pg/tube与大鼠ADM交叉反应性为100%, 与大鼠肾上腺髓质素N端20肽 (PAMP), Amylin 和endothelin的交叉反应性均为0。
1.8 统计学处理 实验结果以mean±SD表示。用Student' t test 做统计学处理。P<0.05为差异具有显著性。
2 结果
2.1 L-NNA处理大鼠的动脉血压、心系数的变化
NOS阻断剂L-NNA应用4周后动物血压明显升高, 较对照组动物高45% (136.32± 3.61 vs 93.95± 4.21 mmHg, P<0.01)。L-NNA组大鼠心肌肥厚, 心重(mg)/体重(g)比值增加 (3.1± 0.2 vs 4.2± 0.36, P<0.01)。
2.2 L-NNA处理大鼠的血浆、心肌和血管组织中ADM含量的变化
高血压大鼠血浆、心肌和血管ADM-ir较对照组分别增加80%、72%和57% (均P<0.01)。结果见表1。
表 1. L-NNA诱导高血压大鼠心脏、血管和血浆ADM含量
Table 1. Contents of ADM in plasma, myocardium and vessel of hypertensive rat induced by L-NNA (mean±SD, n=6)
|
|
Heart (fmol/mg pro) |
Vessels (fmol/mg pro) |
Plasma (fmol/ml) |
|
Control |
0.57±0.11 |
0.46±0.095 |
0.84±0.11 |
|
L-NNA |
0.98±0.17** |
0.72±0.13** |
1.51±0.23** |
**P<0.01, compared with control.
图 1. 高血压大鼠心肌和血管ADM mRNA含量
Fig. 1. Amount of ADM mRNA in myocardium and vessels of the hypertensive rat. Mean±SD, n=4. *P<0.05, **P<0.01 compared with control.
2.3 L-NNA处理大鼠心肌和血管组织中proADM mRNA和RAMP2 mRNA含量的变化
采用竞争性定量RTPCR求得标本中ADM 和RAMP2 cDNA和竞争性内标准之比, 通过标准曲线得标本中ADM和RAMP2 mRNA的含量; 以标本中βaction [KG*4]cDNA 相对含量来较正定量 PCR 时标本的加样误差。用限制性内切酶Bgl II对部分的ADM PCR产物 (446 bp)酶切, 得到预期的156和290 bp的两条片段, 证明所得ADM PCR产物正确。所得RAMP2 PCR产物用RAMP2-S引物, 经测序鉴定为371 bp DNA片段, 证明所得RAMP2 PCR产物正确。L-NNA处理组大鼠心肌和血管ADM mRNA含量显著增加, 分别较正常大鼠高50 % (P<0.05)和 102.9 % (P<0.0 5) (图1)。
L-NNA处理组大鼠心肌和血管的RAMP2 mRNA含量均显著增加, 分别较正常大鼠高 132% (P<0.01)和 87% (P<0.01 )。结果见图2所示。高血压大鼠心肌和血管ADM的升高与RAMP2的升高程度呈明显的正相关, 其相关系数分别为0.741 (P<0.01)和0.885 (P<0.01)。
图 2. 高血压大鼠心肌和血管RAMP2 mRNA的含量
Fig. 2. Amount of RAMP2 mRNA in myocardium and vessels of hypertensive rats. Mean±SD, n=4. **P<0.01 compared with control.
3 讨论
肾上腺髓质素及其受体广泛存在于心肌和血管组织 (包括血管内皮细胞和血管平滑肌细胞)。曾有人报道, 与ADM特异结合的受体主要有L-1 孤立受体和RDC-1受体, 均为G蛋白偶联受体,
前者与ADM呈特异结合, 后者对ADM呈高亲和结合而与125I-CGRP呈低特异结合[10]。降钙素受体样受体 (CRLR), 亦为具有7个跨膜结构的G蛋白偶联受体,
体内未发现其天然配体。1998年, Maltchie 等[11]在神经纤维瘤SK-N-MC细胞发现一类特殊的受体活性修饰蛋白RAMP1, 随后又相继发现了RAMP2和RAMP3。RAMP2与CRLR共存时表现为Adm受体表型,
与125I-ADM呈高亲和的特异的结合。RAMP1与CRLR共存时表现为CGRP受体表型。而RAMP1或3可直接与CT受体作用产生Amylin受体表型。PAMP决定CRLR表型的作用可能与RAMP转运CRLR到细胞膜表面和决定CRLR的糖基化状态及改变受体表型有关[12,13]。
内皮舒张因子即一氧化氮 (NO), 是调节循环系统稳态的重要因子。利用一氧化氮合酶 (NOS)竞争性抑制剂左旋硝基精氨酸 (L-NNA)阻断NO生成, 是实验研究高血压的常用模型[5]。本实验L-NNA处理的大鼠呈严重高血压、心肌肥大。大鼠血浆、心肌和血管组织ADM含量均较正常大鼠显著升高,
与文献报道一致[5]。高血压大鼠心肌和血管组织ProADM mRNA含量亦明显增加, 提示ADM基因表达的上调可能是其组织中蛋白增加的主要原因。编码ADM的基因定位在第11位染色体上,
在5'端区含有TATA、 CAAT 和GC box, 具有几个AP-2和cAMP调节的增强子元件的结合位点,提示ADM的基因表达受蛋白激酶C和蛋白激酶A等多种信号途径的调节。其确切的机制还有待进一步研究。在某些疾病状态下,
如发生高血压、心衰、肾衰、糖尿病或休克时, ADM的转录合成亦明显增加[10]。本实验观察到高血压大鼠心脏和血管组织中RAMP2 mRNA的含量亦较正常大鼠明显增加,
其RAMP2基因表达上调, mRNA水平增加与相应ADM基因表达上调呈明显正相关。RAMP2基因位于17号染色体, 由4个外显子和3个内含子组成, 分别被小的内含子
(<400 bp)隔开。RAMP2基因的第一个外显子表达5 'UTR序列和一个信号肽序列。而第四个外显子高度保守, 编码C末端、 跨膜区域以及N末端的64个氨基酸序列[12]。迄今为止,
RAMP家族基因表达调控的机制尚不清楚。高血压时诱导ADM高表达的因素是否参与了RAMP基因的表达调节值得进一步研究。
Oie等[14]发现， 在大鼠缺血性心衰过程中非缺血区和缺血区心肌组织ADM mRNA的表达增加, 心肌组织ADM受体的mRNA表达亦增加, 而且RAMP2 mRNA水平升高, 且与ADM mRNA 和ADM 受体mRNA升高的水平相平行。Ono等[15]报道， 在内毒素休克小鼠肺中CRLR和RAMP2 mRNA表达呈明显降低。本实验发现， 高血压大鼠心脏和血管ADM、 ADM mRNA和RAMP2 mRNA表达明显增加, 而且ADM和RAMP2的基因表达呈明显正相关, 提示ADM/RAMP2信号系统在高血压的发病中可能具有重要作用。
参 考 文 献
[1] Kitamura K, Kangawa K, Kawamoto M, Ichiki Y, Nakamura S, Matsuo H, Eto T. Adrenomedullin: A novel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma. Biochem Biophys Res Commun,1993,192:553-560.
[2] Dobrzynski E, Wang C, Chao J, Chao L. Adrenomedullin gene delivery attenuates hypertension, cardiac remodling, and renal injury in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Hypertension, 2000,36:995-1001.
[3] Fluhmann B, Muss R, Hunziker W, Fischer JA, Born W. A human orphan calcitonin receptor-like structture. Biochem Biophys Res Commun, 1995,206:341-347.
[4] Qi YF (齐永芬), Tang CS (唐朝枢). Receptor activity modifying protein of calcitonin gene-related peptide family. Pro Physiol Sci (生理科学进展), 2001,32:251-253.
[5] Chang YZ (常英姿), Ye C (叶 赤), Zhou L (周 兰), Chen K (陈 魁), Pang YZ (庞永政), Tang CS (唐朝枢). Changes in myocardial sarcolammal vesicle Na+-Ca2+ exchanger in hypertensive rats induced by L-NNA. J Beijing Med Univ (北京大学学报), 1997,29:32-34 (Chinese, English abstract)
[6] Celi FS, Zenilman ME, Shuldiner AR. A rapid and versatile method to synthesize internal standards for competitive PCR. Nucleic Acids Res, 1993,21:1047.
[7] Siebert PD, Larrick JW. Competitive PCR. Nature, 1992,359:557-558.
[8] Tsai SJ, Wiltbank MC. Standard curve quantitative competitive RT-PCR (SC-QC-RT-PCR): a simple method to quantify absolute concentration of mRNA from limited amounts of sample. In: Siebert PD, Larrick JW eds. Gene cloning and analysis by RT-PCR. Natick MA: Biotechniques Books, 1998,91-101.
[9] Kobayashi H, Yamamoto R, Kitamura Ic, Niina H, Masumoto K, Minami S, Yanagita T, Izumi F, Aunis D, Eto T, Wada A. Cyclic AMP-dependent synthesis and release of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide in cultured bovine adrenal chromaffin cells. Eur J Biochem, 1999,263:702-708.
[10] Hinson JP, Kapas S, Smith DM. Adrenomdullm, a multional regulatory peptide. Endocrin Rev, 2000,21(2):138-167.
[11] Mclatchie LM, Fraser NJ, Main MJ, Wise A, Brown J, Thompson N, Solari R, Lee MG, Foord SM. PAMPs regulate the transport and ligand specifity of the calcitonin receptor-like receptor. Nature, 1998,393:333-339.
[12] Sexton P, Albiston A, Morfis M, Tilakaratne. Receptor activity modifying proteins. Cell signalling, 2001,13:73-83.
[13] Qi YF (齐永芬), Xue L (薛 琳), Chai SB (柴三葆), Shi YR (石彦荣), Pang YZ (庞永岐), Tang CS (唐朝枢). Desensitization of adrenomedullin and calcitonin gene-related peptide receptors in vascular smooth muscle cellsEffects of receptor activity-modifying preotein. Acta Physiol Sin (生理学报), 2001,53:396-400.
[14] Qie E, Vinge LE, Yndestad A, Sandberg C, Grogaard HK, Attramadal H. Induction of a myocardial adrenomedullin signaling system during ischemic heart failure in rats. Circulation, 2000,101:415-422.
[15] Ono Y, Okano I, Kojima M, Okadn K, Kangawa IC. Decreased gene expression of adrenomedullin receptor in mouse tungs during sepsis. Biochem Biophys Res Commun, 2000,271:197-202.-