Received 2002-03-15 Accepted 2002-08-05
This work was supported by the National Basic Research Program (G1999054000) of China.
*Corresponding author. Tel: +86-21-25070308; Fax: +86-21-25072297;
E-mail: SanKang2000@yahoo.com
生理学报, Dec. 2002, 54 (6): 473-478
Acta Physiologica Sinica
研究论文
大鼠海马神经元内11β-HSD1和GR的共存及其意义
万顺伦, 廖茂瑶, 郝如松, 李召峰, 孙 刚*
第二军医大学生理学教研室, 上海 200433
摘 要: 本研究旨在探讨糖皮质激素代谢酶11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型(11β-HSD1)和糖皮质激素受体(GR)在大鼠海马神经元内的共同分布及其意义。用免疫细胞化学方法研究显示, 海马神经元内不仅存在11β-HSD1免疫反应物质, 还存在GR免疫反应物质, 而且11β-HSD1与GR共存于同一个海马神经元内。用Western印迹杂交和薄层层析(TLC)方法研究表明, 地塞米松(DEX)可以促进11β-HSD1蛋白表达及其酶的活性。利用11β-HSD1基因启动子区序列构建的以CAT酶为报告基因的pBLCAT6质粒转染PC12细胞, 证实DEX能够促进CAT酶的表达。以上糖皮质激素的作用均可为GR受体阻断剂RU38486所阻断。结果提示: 糖皮质激素(GC)与GR结合后, 可以作用于与其共存的11β-HSD1基因启动子区, 使11β-HSD1表达增加, 从而使更多的GC代谢产物转化为有活性的GC。此机制可能与保证GC在海马神经元内与亲和力较低的GR结合有关。
关键词: 11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型; 糖皮质激素受体; 海马神经元
中图分类号: Q459
Colocalization of
11β-hydroxysteroid dehydrogenase typeⅠand glucocorticoid receptor and its
significance in rat hippocampus
WAN Shun-Lun, LIAO Mao-Yao, HAO Ru-Song, LI Zhao-Feng, SUN Gang*
Department of Physiology, The Second Military Medical University, Shanghai 200433
Abstract: This paper was designed to observe the colocalization of 11β-HSD1 and GR, and its significance in the rat hippocampus. Immunocytochemical dual-staining showed that not only 11β-HSD1 but also GR immunoreactive substances were present in the cultured rat hippocampal neurons. Moreover, they were colocalized in the same hippocampal neuron. Synthetic glucocorticoid dexamethasone (DEX) up-regulated the protein expression and activity of 11β-HSD1 in the cultured hippocampal neurons, as determined by Western blot and thin layer chromatography (TLC) respectively. The transfection of PC12 cells with the plasmid containing promoter sequence of 11β-HSD1 gene and the reporter gene of CAT enzyme was conducted. DEX up-regulated the reporter gene expression in the system described above. The up-regulation of 11β-HSD1 and reporter gene expression induced by DEX were both blocked by GR antagonist RU38486. Our study suggests that the colocalization of 11β-HSD1 and GR in the hippocampus may be implicated in the up-regulation of 11β-HSD1 expression by glucocorticoids combining to its promoter region, which in turn produces more biologically active glucocorticoids necessary for the binding of low affinity of GR.
Key words: 11β-hydroxysteroid dehydrogenase typeⅠ; glucocorticoid receptor; hippocampus
海马是糖皮质激素(GC)作用的敏感部位。海马内具有丰富的糖皮质激素受体(GR)和盐皮质激素受体(MR), GC与MR、GR的亲和力不同, GC对MR的亲和力是GR的10倍。GC无论在基础水平还是昼夜节律高峰时, GC与MR的结合基本饱和(＞80%), 而与GR的结合则随GC浓度的高低呈现很大的变化(10%-90%)。这意味着海马内GC的浓度主要影响它与GR的结合状态[1]。海马内的糖皮质激素代谢酶11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ (11β-HSD1)主要具有还原酶特性, 能使无活性的11-脱氢皮质酮/可的松(A)转化为有活性的皮质酮/醇(B), 从而提高组织局部的GC浓度[2], 有利于维持海马内较高浓度的有活性的GC[3], 这样海马内11β-HSD1可以影响GC与GR的结合程度, 但11β-HSD1与GR是否共存于同一个神经元内并不清楚。GC可以促进海马神经元11β-HSD1的表达[4], 此作用是否与GR介导的基因机制有关, 目前也不清楚。本实验研究了海马11β-HSD1和GR的分布特点以及GC对11β-HSD1表达的调节机制。
1 材料和方法
1.1 海马神经元的原代培养及加药方法
取新生24 h大鼠12只, 断头取脑, 分离海马, 作原代海马神经元培养。海马神经元的原代培养方法参见Banker和Cowan[5]。简述如下: 分离得到的海马剪碎后, 用0.125%的胰蛋白酶(Gibco) 37℃消化20 min。加培养液终止消化10 min。培养液由80%DMEM(Gibco)、10%胎牛血清、10%的马血清(Gibco)组成。终止消化后将海马组织移到含2 ml培养液的离心管内, 用抛光的玻璃滴管反复吹打, 静置10 min, 将细胞混悬液移到另一个离心管内, 计数, 按1×106细胞/孔接种于预先涂有多聚赖氨酸(Sigma)的6孔培养板内或按1×105细胞/孔接种于预先涂有多聚赖氨酸的1 cm×1 cm的盖玻片上, 后者用作免疫细胞化学染色。细胞在37℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后吸出培养液, 换用B27培养基以抑制胶质细胞的生长和促进神经元的生长。B27培养基由谷氨酰氨(0.5 mmol/L)、B27添加剂(Gibco)和神经细胞培养基(NeurobasalTM Medium, Gibco)组成。海马神经元继续在B27内培养, 每3天半量换液一次, 直到实验需要的时间。
在观察地塞米松(DEX)对11β-HSD1调节的实验中, 海马神经元培养到第2天时, 在换用B27培养液的同时加入终浓度为0.1 μmol/L的DEX或1 μmol/L糖皮质激素受体阻断剂RU38486或 DEX (0.1 μmol/L)＋RU38486 (1 μmol/L)。继续培养海马神经元到第5天时, 部分细胞加入终浓度为1 μmol/L的11β-HSD1底物脱氢皮质酮(含有 3H-脱氢皮质酮105 cpm), 继续孵育24 h, 收集培养液, 用作11β-HSD1酶活性的测定; 部分细胞(未加底物)收集后提取蛋白质, 用Western印迹杂交的方法检测海马神经元11β-HSD1蛋白。上述每种处理均为2孔。共重复实验8次。
1.2 11β-HSD1酶活性的测定
以上收集的培养液用乙酸乙酯提取后, 用薄层层析法(TLC)分离提取液内的脱氢皮质酮和皮质酮。TLC的方法参见Moisan等[6]。简述如下: 用乙酸乙酯将细胞培养液内的脱氢皮质酮和皮质酮提取后, 吹干, 重溶于100 μl乙酸乙脂内。取25 μl点样于硅胶薄层层析板上, 放于含展开溶剂(氯仿95%, 无水乙醇5%)的密闭层析缸内, 溶剂上升到层析板的4/5时取出薄层板, 在紫外灯下可见清晰分开的两条带, 分别为脱氢皮质酮和皮质酮。刮下条带, 分别放入闪烁杯内, 加入闪烁液, 在Wallac1409 DSA液闪烁仪上测定cpm值, 根据cpm值计算脱氢皮质酮转化为皮质酮的转化率, 并以此表示11β-HSD1的活性。
1.3 海马11β-HSD1和GR的免疫细胞化学染色
海马神经元培养到第8天时用4%的多聚甲醛固定10 min, 然后做免疫细胞化学的双重染色。双重染色试剂盒购于Boster公司。步骤简述如下: 用0.1 mol/L TBS洗涤固定的细胞5 min×3次后, 加第一种兔来源的11β-HSD1抗体(加拿大西安大略大学杨开平教授惠赠, 滴度1∶600), 4℃孵育过夜, 用TBS洗涤5 min×3次, 加入生物素标记的羊抗兔IgG抗体(1∶1000), 孵育1 h (37℃), 用0.1 mol/L TBS洗涤5 min×3次, 再加入链酶亲合素-生物素-碱性磷酸酶复合物(SABC-AP), 孵育1 h后, 用0.1 mol/L TBS洗涤5 min×4次, 加入碱性磷酸酶显色剂(BCIP/NBT)显色, 反应产物为蓝紫色。在进行第二次标记前, 用双标阻断剂(Boster公司)孵育40 min, 以阻断第二次染色与第一染色之间的可能的交叉反应。然后加第二种小鼠来源的抗GR的单克隆抗体[7,8](由美国阿肯色大学医学中心Robert Harrison博士惠赠; 滴度1∶600), 4℃孵育过夜后用0.1 mol/L TBS洗涤, 加入生物素标记的抗小鼠IgG抗体 (1∶1000), 37℃孵育1 h; 用0.1 mol/L TBS洗涤后, 加入链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC-POD), 再37℃孵育1 h; 用0.1 mol/L TBS洗涤5 min×4次, 最后加入过氧化物酶显色剂(AEC)显色, 反应产物为红色。单标中的阴性对照染色以正常兔血清代替11β-HSD1抗体或小鼠血清代替GR抗体进行染色, 其他的染色步骤相同, 结果无染色; 而双重染色的阴性对照不加第二种一抗(抗GR的单克隆抗体), 染色结果中仅有蓝紫色, 无红色出现。
上述的11β-HSD1抗体是利用人工合成的11β-HSD1第278-289位氨基酸残基序列免疫兔产生的, 并经亲和柱层析纯化。用此抗体进行Western印迹杂交, 发现转染有11β-HSD1 cDNA的中国仓鼠卵巢细胞所表达的蛋白中, 存在分子量为34 kD的11β-HSD1单个条带[9]。
1.4 Western印迹法检测11β-HSD1蛋白
用DEX处理的海马神经元弃去培养液后, 用预冷的0.01 mol/L PBS洗涤细胞3次, 吸尽PBS后置于冰上。 每孔加上样缓冲液80 μl (62.5 mmol/L Tris-HCI pH 6.8、2% SDS、10%甘油、50 mmol/L β-巯基乙醇、0.1%溴酚蓝), 刮下细胞后移于Eppendorf管内, 用KS-600细胞超声粉碎机(宁波科生仪器厂)碎裂细胞后, 迅速在100℃变性10 min, 12000 r/min离心10 min, 吸取上清, 测定蛋白含量并放置－20℃保存, 用于Western印迹杂交实验。其方法简述如下: 样本(50 μg)用12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 用电转膜仪(Bio-Rad)转印蛋白到硝酸纤维素膜(Amersham)上, 用10%的脱脂奶粉溶液室温封闭2 h后, 加入用TBST (TBS缓冲液内含0.1% Tween 20)新鲜配制的兔来源的11β-HSD1抗体, 滴度为1∶1000, 室温孵育1-2 h。用TBST洗涤3次×5 min, 加入羊抗兔IgG抗体(华美公司), 抗体滴度为1∶1000, 室温孵育1 h后, 用TBST洗涤3次×5 min, 在膜上加增强化学发光剂(Perfect公司), 在暗室内压X线片。同一Western杂交膜显示11β-HSD1条带后, 用洗脱缓冲液(50℃)洗涤硝酸纤维素膜30 min, 然后用同样的方法显示β-actin条带, 以此作为加样的内参照。β-actin单克隆抗体购于Sigma公司。X线片上的条带用图像分析系统(上海复日科技有限公司)读其密度值, 并进行定量分析。以11β-HSD1条带密度值/β-actin条带密度值来纠正上样量的偏差。用密度比值的高低表示11β-HSD1蛋白量的多少。
1.5 11β-HSD1基因1.2 kb启动子区的克隆与报告基因的构建
根据已克隆的11β-HSD1基因序列, 针对要克隆的11β-HSD1基因转录起始位点上游的1.2 kb序列设计PCR引物, 使PCR产物两端带有限制性内切酶XhoⅠ和PstⅠ的作用位点。PCR引物的序列为: 上游即5'端引物为GGCTGCAGTTTTTCCCCGCTCTACTGATAACT, 下游即3'端引物为TTC TCGAGCCGACAGGGAGCTGGCCTGAAGACT。 凝胶电泳显示PCR产物的长度为1.2 kb。将PCR产物用上述两种限制性内切酶酶切后, 将其插入含有氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的pBLCAT6质粒。经质粒扩增、抽提后, 用限制性内切酶XhoⅠ和PstⅠ进行酶切鉴定, 琼脂糖电泳结果显示有1.2 kb的片断插入。经测序, 结果与11β-HSD1基因转录起始位点上游的1.2 kb序列完全吻合。
1.6 PC12细胞的转染和CAT酶活性的测定
PC12细胞具有神经元的特性, 还有GR受体[10], 而且我们的蛋白印迹结果发现PC12能够表达11β-HSD1蛋白, 这些特性均与海马神经元相似。因此, 我们以此细胞株作为转染对象。复苏后的PC12 细胞, 用DMEM培养基(含12.5%灭活的马血清和2.5%灭活的胎牛血清)培养。按2×105细胞/孔接种于预先涂有多聚赖氨酸的24孔板内, 待细胞覆盖培养板底面积的90%时, 按1 μg/孔加入构建的含报告基因的质粒进行转染。
将含有11β-HSD1基因启动子区1.2 kb序列的pBLCAT6质粒和含有β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-gal)基因的质粒, 用脂质体(LF2000 , Gibco)方法共同转染PC12细胞株, 以后者作为转染效率的内参照, 阳性对照采用带有tk启动子的pBLCAT5质粒转染PC12细胞。转染8 h后, 换液, 加DEX 1、0.1、0.01 μmol/L; DEX (0.1 μmol/L)＋RU38486 (1 μmol/L), 孵育24 h后, 弃去培养液, 用PBS冲洗PC12细胞, 刮取细胞并离心取细胞沉淀, 然后加入细胞裂解液(0.5% Triton-X100、0.25 mol/L Tris-HCl, pH 7.8), 充分裂解。将细胞裂解液分为3份, 分别测定CAT酶活性、β-半乳糖苷酶活性[11]和蛋白含量(Bio-Rad assay)。
CAT酶活性的测定: 取30 μl细胞裂解液, 置于65℃水浴 10 min灭活内源性去乙酰基酶, 然后加入CAT酶的底物(1.25 mmol/L氯霉素、0.35 μmol/L 3H-乙酰辅酶A和1 mol/L Tris-HCI, pH 7.8), 于37℃水浴孵育30-60 min, 用乙酸乙酯抽提2次, CAT酶产物3H-乙酰氯霉素被抽提进入乙酸乙酯有机相, 向抽提液内加入闪烁液, 用液体闪烁计数仪测定抽提的3H-乙酰氯霉素的CMP值, 并以此作为衡量CAT酶活性的指标。转染带有tk启动子的pBLCAT5质粒的对照组细胞, 以同样方式测定其CAT酶的活性。
β-半乳糖苷酶活性的测定: 取30 μl细胞裂解液, 加入β-半乳糖苷酶的底物氯酚红-β-D-吡喃半乳糖糖苷(CPRG)和0.1 mol/L磷酸钠、1 mmol/L氯化镁、0.05 mol/L β-巯基乙醇及8 mmol/L Tris-HCI溶液, 37℃水浴30 min, 用1 mol/L Na2CO3终止反应, 在575 nm波长处读取其光密度值, 并以此作为衡量β-半乳糖苷酶活性的指标。阳性对照采用大肠杆菌的β-半乳糖苷酶, 阴性对照采用无细胞的单纯裂解液。
DEX及RU38486对CAT报告基因表达的影响, 以CAT酶活性除以同一样本β-半乳糖苷酶活性和蛋白含量, 以纠正由转染效率和细胞密度不同所带来的误差。
1.7 统计学处理
本文所有数据均以mean±SE表示。不同处理组间的差别用ANOVA检验。P<0.05为相差具有统计学意义。
图 1. 海马神经元内11β-HSD1与GR的免疫细胞化学染色
Fig. 1. Distribution of 11β-HSD1 and GR immunoreactivities in the hippocampal neurons stained by immunocytochemistry. Scale bar, 2.5 μm. A: Distribution of GR (red) immunoreactivities in the hippocampal neurons. B: Distribution of 11β-HSD1 (blue) immunoreactivities in the hippocampal neurons. C: Co-localization of 11β-HSD1 and GR (black-brown) in the same hippocampal neuron.
2 结果
2.1 海马11β-HSD1和GR的免疫细胞化学染色
海马神经元染色显示: 染色呈蓝紫色的11β-HSD1分布于神经元的胞体、树突和轴突; 而细胞核内基本无染色。染色呈红色的GR不仅分布在细胞浆内, 还分布于细胞核内。双重染色显示, 11β-HSD1与GR共存于同一个神经元内(图1), 而且呈现双重染色的海马神经元达95%。
2.2 DEX对11β-HSD1蛋白及其活性的影响
Western 印迹杂交法显示, 海马神经元内存在分子量为34 kD的11β-HSD1蛋白。持续暴露于DEX使海马神经元11β-HSD1蛋白表达明显增加, 与对照组比较差异具有显著性(P<0.01)。而DEX+RU38486组, 11β-HSD1蛋白表达的量则较DEX组有所下降(P<0.05), 几乎接近于对照组(图2)。放射性酶活性测定显示, 用DEX处理的海马细胞11β-HSD1酶活性明显升高, 与对照组比较具有显著性差异, 糖皮质激素受体阻断剂RU38486同样可以阻断DEX对11β-HSD1酶活性的上调作用(图3)。
图 2. DEX、RU38486(RU)对海马神经元11β-HSD1蛋白表达的影响
Fig. 2.
Effect of DEX and RU38486 (RU)on the expression of 11β-HSD1 protein in the hippocampal neurons.
*P<0.01 vs control; #P<0.05 vs DEX. n=6.
图 3. DEX、RU38486(RU)对海马神经元11β-HSD1酶活性的影响
Fig. 3.
Effect of DEX and RU 38486(RU) on the 11β-HSD1 enzyme activities in the hippocampal neurons.
*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs DEX. n=8.
2.3 DEX、RU38486(RU)对PC12 细胞中CAT报告基因表达的影响
不同剂量的DEX (1 、0.1、0.01 μmol/L)作用于转染有11β-HSD1 1.2 kb启动子-CAT报告基因-pBLCAT6质粒的PC12细胞24 h后, PC12细胞CAT酶的活性均明显增加(P<0.05)。将RU38486 (1 μmol/L)与DEX (0.1 μmol/L)共同孵育, 则可阻断DEX对PC12细胞CAT酶活性的诱导作用(图4)。
图 4. DEX、RU38486(RU)对PC12 细胞中报告基因表达的影响
Fig. 4. Effect of DEX and RU 38486 (RU)on the reporter gene expression in the PC12 cells.
*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs DEX. n=7.
3 讨论
海马是边缘系统的重要结构, 是大脑内对GC反应最为敏感的脑区, 其内不仅存在MR、GR, 还有决定GC浓度的酶11β-HSD。GC对MR、GR的亲和力不同, 它对MR的亲和力是GR的10倍。在基础水平GC存在的条件下, GC与MR结合不低于75%, 与GR的结合却极低。在应激或昼夜节律分泌高峰时, GC与MR结合达90%, 与GR的结合也明显增加, 可达10%-90%。也就是说, 体内GC水平的波动主要影响GR的结合率[1]。11β-HSD分为11β-HSD1和11β-HSD2。11β-HSD1是氧化还原酶, 但在完整的细胞内主要表现为还原酶, 能使无活性的11-脱氢皮质酮/可的松(A)转化为有活性的皮质酮/醇(B), 从而提高组织局部的GC浓度, 加强GC的作用。而11β-HSD2是专一氧化酶, 它能够将B氧化为无活性的A, 失活GC的作用[2]。大鼠出生时11β-HSD2仅局限于室旁核等调节水盐平衡的部位; 11β-HSD1则在脑内(包括海马)广泛分布[2]。这样11β-HSD1可将进入脑内的A转化为有活性的B, 提高组织局部的GC浓度。因此, 11β-HSD1的存在可能为GC与更多GR的结合提供了有利条件。但海马11β-HSD1是否伴随GR存在并不清楚。本实验对海马细胞免疫化学染色发现, 海马神经元内不仅存在11β-HSD1免疫反应物质, 还存在GR免疫反应物质, 而且11β-HSD1与GR共存于同一个神经元内。这样在细胞内由11β-HSD1复活的GC就可为更多GR的结合提供足够的浓度, 由此来源的GC无需离开细胞就可以直接结合GR产生作用。
GR的激活无论在胎儿发育, 还是在调节下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴中均具有重要的作用。文献报道, 妊娠晚期到胎儿出生时, 脑内海马11β-HSD2表达急剧下降, 而11β-HSD1的表达则迅速上升[2], 这样可以产生大量的GC, GC可以更多地占据GR, 而GR的活化将促进神经元的发育成熟[12,13]。海马是HPA轴的上一级调节中枢, 其内MR、GR的激活程度决定着HPA轴的活动。MR的激活能够维持海马神经元的兴奋性和抑制HPA轴的活动; GR的兴奋将降低海马神经元的兴奋性和降低MR对HPA的抑制作用[14]。海马内MR、GR激活的不同比例将影响海马神经元的兴奋状态和神经信号的传出和传入, 从而影响海马的功能和HPA轴的活动等[1,14]。在应激的情况下, GR的大量激活使HPA轴的抑制减弱, 有利于HPA在短时间内分泌大量的GC。高浓度的GC作用于下丘脑、垂体的GR则通过负反馈机制使应激及时地恢复到正常状态。本实验结果提示, 海马内与GR 共存的11β-HSD1可能有利于维持海马细胞较高浓度的GC, 从而调节GC对GR的占有率, 影响MR、GR的兴奋比例, 间接地影响海马的功能和HPA轴的活动。
文献[4]及本实验的结果都显示GC可以促进11β-HSD1的表达。本实验的结果表明, DEX的这种作用可被RU38486所阻断, 提示GR参与了 DEX对11β-HSD1表达的上调作用。那么DEX与GR结合后又是在何种水平调控11β-HSD1的表达呢？对克隆的11β-HSD1基因序列分析发现, 在11β-HSD1基因的转录起始位点上游－197-－190碱基对处存在CTGATACAG序列, 此序列类似糖皮质激素作用元件(GRE)结构序列。因此, 我们认为DEX可能通过作用于11β-HSD1基因启动子而实现对其表达的调节作用。针对此种假设, 我们将克隆的11β-HSD1基因1.2 kb启动子区与CAT酶报告基因相连接, 构建pBLCAT6质粒, 并转染PC12细胞株, 发现DEX可以促进转染PC12细胞CAT酶的表达, 此作用也可被RU38486所阻断。此结果进一步提示, DEX可以通过GR作用于11β-HSD1基因的启动子区调节其表达。尽管PC12 细胞不能完全代表海马神经元, 但是通过本实验可以得出DEX能够通过GR作用于11β-HSD1基因的启动子区而调控11β-HSD1表达的结论。所以, GC在细胞内能够通过GR促进11β-HSD1表达, 11β-HSD1反过来又可以将进入细胞内的无活性GC代谢产物还原为有活性的GC, 从而可以结合更多的GR产生生物学效用。
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