Received 2002-03-20 Accepted 2002-08-13
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.39600171, 39730190)
*Corresponding author. Tel: +86-023-68752340-8205;
E-mail: liuliu@mail.tmmu.com.cn
生理学报, Dec. 2002, 54 (6): 485-489
Acta Physiologica Sinica
研究论文
ATP浓度和缺氧暴露对大鼠脑线粒体RNA和
蛋白质体外合成的影响
柳君泽*, 高文祥, 蔡明春, 曹利飞, 孙秉庸
第三军医大学高原军事医学系病理生理学与高原生理学教研室,
全军高原生理与高原病重点实验室, 重庆 400038
摘 要: 本文探讨介质中ATP浓度和急、慢性缺氧暴露对大鼠脑线粒体内RNA和蛋白质合成的影响。用差速离心法分离正常和低压舱模拟4000 m高原急性连续缺氧暴露3 d和慢性连续缺氧暴露40 d大鼠脑线粒体, 用体外无细胞(cell-free in vitro) 3H-UTP和3H-Leucine掺入法分别测定线粒体RNA和蛋白质合成活性。结果显示, 大鼠急性缺氧暴露后大脑皮质线粒体RNA体外合成活性降低40%, 蛋白质合成活性降低60%; 慢性缺氧暴露后线粒体RNA和蛋白质合成活性分别为对照的72%和76%; ATP对正常大鼠脑线粒体RNA以及蛋白质的体外合成活性的影响均呈双相性, 大于或小于1 mmol/L均可产生不同程度的抑制效应。结果提示, 缺氧可在转录和翻译两个水平上影响脑线粒体mtDNA的表达, 而慢性缺氧暴露时, 线粒体半自主性功能的改善可能是机体对缺氧适应的细胞机制之一; ATP对脑线粒体内转录和翻译活性的调节是一种经济有效的反馈调节方式。
关键词: 线粒体; 缺氧; ATP; 线粒体RNA合成; 线粒体蛋白质合成
中图分类号: Q591.2; R364.4; R329.24
Effects of ATP
concentration and hypoxic exposure on RNA and protein synthesis activity in
isolated mitochondria from rat brain
LIU Jun-Ze*, GAO Wen-Xiang, CAI Ming-Chun, CAO Li-Fei, SUN Bing-Yong
Department of Pathophysiology, College of High Altitude Military Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038
Abstract: To explore the effects of ATP concentration in the medium and hypoxia exposure on mitochondrial DNA expression at transcriptional and translational level, rats were exposed to hypoxia in a hypobaric chamber simulating 4000 m above sea level for 3 d (acute hypoxia) or 40 d (chronic hypoxia). Cerebral cortex mitochondria were isolated from control and hypoxia-exposed rats by centrifugation program. The activities of intramitochondrial RNA and protein synthesis were measured respectively by the methods of incorporation of 3H-UTP or 3H-Leucine in a cell-free system in vitro in isolated organelle. The effect of different ATP concentrations in medium on incorporation activity of mitochondria from control rat brains was observed. The results showed that there was a 40% reduction in RNA synthesis and a 60% inhibition in protein synthesis in isolated mitochondria in vitro in acute hypoxia exposure compared to control. But in chronic hypoxic exposure, the inhibition of both RNA synthesis and protein synthesis was alleviated, being 72% and 76% of the normoxic control, respectively. Furthermore, the effect of ATP concentration in medium on mitochondrial RNA and protein synthesis in vitro showed two phases. The mitochondrial RNA and protein synthesis were inhibited when ATP concentration was either above or below 1 mmol/L in the incubation medium. These results indicate that hypoxia exposure affects the expression of mtDNA at both transcription and translation levels. It also suggests that the improvement of mitochondrial semi-automation during chronic hypoxic exposure may be at least one of the cellular mechanisms of body adaptation to hypoxia. The regulation of ATP in mitochondrial RNA and protein synthesis is therefore an economic and effective mode of regulation.
Key words: mitochondria; hypoxia; ATP; mitochondrial RNA synthesis; mitochondrial protein synthesis
线粒体是消耗氧和产生ATP的主要场所。线粒体的氧化磷酸化是依靠内膜上的呼吸链酶复合体和ATP合成酶来完成的, 这些多酶复合体的部分亚基是由线粒体DNA(mtDNA)编码并在线粒体内表达, 线粒体有一套独立的转录和翻译体系, 是半自主性细胞器[1]。因此, mtDNA及其编码基因的表达状况直接影响线粒体呼吸和ATP合成。有关机体在各种生理、病理情况下各组织mtDNA表达与氧化磷酸化缺陷的关系已有不少报道。缺氧是常见的病理过程, 可影响线粒体氧化磷酸化和能量生成[2-4]。但有关机体缺氧(尤其是高原缺氧)暴露过程中mtDNA表达、线粒体内RNA与蛋白质的合成活性及其调节特性等未见报道。脑组织具有耗氧量大、氧和ATP储备少等特点, 因而对缺氧最敏感。为揭示缺氧对线粒体基因表达的影响, 实验在探讨了ATP对线粒体半自主性调节的基础上, 观察了模拟高原低压缺氧不同时间大鼠脑线粒体的体外RNA和蛋白质的生物合成功能变化, 以期揭示缺氧过程中线粒体能量代谢改变的分子机制。
1 材料和方法
1.1 材料
雄性Wistar系大鼠(二级, 本校实验动物中心提供), 实验进行时为11-13周龄, 体重160-280 g; ATP、ADP、丙酮酸(Sigma); 20种天然L-α-氨基酸(上海伯奥生物科技有限公司进口分装);3H-UTP 0.444 TBq/(mmol·L－１ )、3H-亮氨酸 0.296 TBq/(mmol·L－１ )(中国原子能科学研究院同位素研究所); 其它试剂均为分析纯。
1.2 实验分组与缺氧条件
大鼠随机分为对照(未缺氧)组、急性缺氧组和慢性缺氧组。缺氧组动物于低压舱内模拟海拔4000 m高原(大气压为61.6 kPa, 舱内温度18-23℃)连续缺氧暴露3 d (急性缺氧组)和40 d (慢性缺氧组), 每天缺氧23.5 h (返回平原30 min以清扫、喂食), 12 h日光灯照明。对照组动物于相同条件下饲养在平原(海拔308 m, 大气压97.7 Pa, 室温18-23℃), 不经低压缺氧暴露。所有动物喂以标准颗粒合成饲料(由本校动物中心提供), 自由饮水。
1.3 实验方法
1.3.1 大鼠脑线粒体的分离提取与活性鉴定
大鼠分别在平原(对照组)和模拟4000 m高原低压舱内(缺氧组)断头处死, 快速取大脑皮质, 置于0-4℃生理盐水中洗涤数次, 立即埋入带冰碴的分离介质(0.25 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.5 mmol/L K+-EDTA)中。以上操作在30 s内完成。经Teflon-玻璃匀浆器制成匀浆液, 按文献报道的方法[4, 5]分离并纯化线粒体。匀浆液经2000 g离心3 min, 取上清液重复一次, 收集上清液于12500 g离心8 min, 沉淀的线粒体用3% Ficoll溶解后铺于6% Ficoll界面上, 11050 g离心30 min, 纯化的线粒体沉淀用分离介质洗涤2次, 按10 mg蛋白/ml悬浮于分离介质中制成线粒体悬液。按Lowry法测定线粒体蛋白质浓度, 以牛血清白蛋白为标准。以上操作均在0-4℃, 2 h内完成, 每次实验均需新鲜制备。
按Clark氧电极法[4,5]测定线粒体氧化呼吸活性和偶联程度, 分别测定state 3 (加入ADP时)和state 4 (ADP耗尽后)呼吸氧耗量(ST3和ST4), 计算呼吸控制率(respiration control rate, RCR= ST3/ ST4)。测得纯化的大鼠脑线粒体state 3呼吸平均氧耗量为51.28±13.48 natoms O (纳原子氧)/(min·mg) protein, RCR为4.85±0.44 (n=10)。证明线粒体氧化呼吸活性和氧化磷酸化偶联程度较高, 可用于线粒体的体外RNA和蛋白质合成分析。
1.3.2 线粒体RNA的体外合成测定
参照Fernandez-Silva等报道[6]的细胞器体外3H-UTP掺入法。掺入反应总体积200 μl, 含10%甘油、35 mmol/L Tris-HCl, pH 7.8, 10 mmol/L MgCl2、1 mg牛血清白蛋白、20 mmol/L琥珀酸钠、1 mmol/L Na2HPO4, 标准反应中ATP浓度为1 mmol/L, 每个反应中3H-UTP 为0.37 MBq/ml。加入10 μl线粒体悬液后于37℃水浴振荡1 h, 用10%三氯醋酸终止反应, 反应液抽滤于玻璃纤维滤膜上, 经三氯醋酸、乙醇反复洗膜, 烘干后加闪烁液(PPO∶POPOP=50∶1, 二甲苯溶液)作液闪计数。计数效率为20%-25%, 结果以3H-UTP掺入mtRNA的cpm/mg pro表示。所用器皿均经高压灭菌处理, 溶液(除Tris外)经0.2%二已基焦碳酸盐(DEPC)和高压灭菌处理, Tris用DEPC处理的灭菌水配制后再经高压消毒。
1.3.3 线粒体内蛋白质的体外合成测定
参照Kwast[7]和Mckee[8]等报道的细胞器体外3H-Leucine掺入法并加以改进。线粒体蛋白翻译反应混合液100 μl, 含500 mmol/L 蔗糖、125 mmol/L KCl、20 mmol/L HEPES, pH 7.5, 10 mmol/L KH2PO4、8 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、0.1 mg/ml放线菌酮、0.5%牛血清白蛋白, 19种天然L-α-氨基酸(除亮氨酸外)各0.3 mmol/L,3H-Leucine为0.74 MBq/ml, 标准反应中含10 mmol/L琥珀酸钠和2 mmol/L ADP。加入线粒体悬液使最终浓度为1 mg/ml, 于30℃水浴震荡1 h, 10%三氯醋酸终止反应, 抽滤、洗膜、液闪计数同上所述。结果以3H-Leucine掺入线粒体蛋白的cpm/mg pro表示。
1.4 统计处理
实验设计为随机、有重复的成组设计,设对照组,除处理因素不同外其它均一致,结果以mean±SD表示。采用单因素方差分析,各组间均值的多重比较采用FLSD法,以P<0.05为相差显著,P<0.01为相差非常显著。
2 结果
2.1 ATP对线粒体RNA和蛋白质体外合成的影响
ATP可影响线粒体基因的表达, 表现在转录和翻译两个环节上。当体外RNA合成系统处于不同ATP浓度的反应介质中时, 线粒体内RNA合成随外源ATP浓度的改变而表现出特征性变化, 当ATP浓度为1 mmol/L时, 线粒体内RNA合成活性最高, 出现一特征性的活性增高峰, 大于或小于1 mmol/L, 合成活性均递减(图1)。而当外源ATP浓度为0 mmol/L时, 线粒体的RNA合成活性并未完全终止, 但仅为最大活性的21%。
在以琥珀酸为氧化底物的线粒体体外蛋白翻译合成体系中, 介质中外源ATP为1 mmol/L时,3H-Leucine掺入活性最高, 大于1 mmol/L时, 则随ATP浓度升高而表现出递减。在不含氧化底物(琥珀酸)和ADP的反应体系中,3H-Leucine随外源ATP浓度的掺入曲线与含有氧化底物时相似(图2)。无论介质中有或无氧化底物存在, 当外源ATP为零时, 线粒体的蛋白质翻译合成活性仍分别有最大活性的85%和53%。
图 1. ATP对离体线粒体转录活性的影响
Fig. 1. Effect of ATP concentration in medium on mitochondrial transcription activity in vitro. Data come from at least three independent mitochondria preparations.
图 2. ATP对离体线粒体翻译活性的影响
Fig. 2.
Effect of ATP concentration in medium on mitochondrial translation activity in vitro. Data come from at least three independent mitochondria preparations.
表 1. 缺氧时大鼠大脑皮层线粒体RNA和蛋白质体外合成活性的变化
Table 1. Changes in mitochondrial RNA and protein synthesis activities in vitro in cerebral cortex of rats during hypoxic exposure (mean±SD)
|
Groups |
Mitochondrial RNA synthesis |
Mitochondrial protein synthesis |
||||
|
Number of animals |
3H-UTP incorporation cpm×10－3/mg pro |
Percent of control |
Number of animals |
3H-Leucine incorporation cpm×10－3/mg pro |
Percent of control |
|
|
Control |
9 |
21.59±3.48 |
100 |
8 |
5.61±1.31 |
100 |
|
Acute hypoxia (3 d) |
9 |
13.06±2.05* |
60.5 |
6 |
2.22±1.10* |
39.8 |
|
Chronic hypoxia (40 d) |
9 |
15.56±1.42* |
72.2 |
8 |
4.29±2.20 |
76.5 |
|
F value |
28.19517 |
7.221607 |
||||
|
P value |
5.01E－07 |
0.004648 |
||||
*P<0.01 compared with control; P<0.05,P<0.01 compared with acute hypoxia.
2.2 缺氧对线粒体RNA和蛋白质的体外合成活性的影响
缺氧对脑组织mtDNA编码基因表达的影响表现在RNA转录和蛋白翻译两个水平上, 且与动物缺氧暴露时间有关(表1)。急性缺氧可分别抑制线粒体3H-UTP和3H-Leucine掺入活性的40%和60%(P<0.01); 而慢性缺氧时其活性均比急性缺氧组升高(P<0.01和 P<0.05), 但反映RNA合成的3H-UTP掺入活性仍低于对照组(P<0.01), 而反映蛋白质合成的3H-Leucine掺入活性虽也低于对照组(为对照的76%), 但差异无统计学意义(P>0.05)。
3 讨论
人和哺乳动物mtDNA全长16.5 kb, 其遗传信息的复制、转录和翻译均在线粒体内独立进行, 由转录生成的2个rRNA和22个tRNA参与线粒体内的蛋白质生物合成, 而mRNA则在线粒体内做为翻译的模板合成蛋白质, 直接构成氧化呼吸链酶(复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ)和磷酸化过程的ATP合成酶(复合体Ⅴ)的部分组分[1]。因此, 线粒体DNA遗传信息的表达与线粒体氧化磷酸化功能的发挥有直接关系。应用分子杂交或免疫杂交等技术, 可以检测mtDNA编码氧化磷酸化基因的mRNA或蛋白质量(state level), 但不能确切反映合成过程。无细胞(cell-free)线粒体体外转录和翻译模型是研究线粒体RNA和蛋白质合成及其调节的较好方法。
3.1 缺氧与线粒体基因表达
缺氧可影响线粒体的氧化呼吸功能。低压舱模拟4300 m高原间断缺氧21 d小鼠脑线粒体ST3呼吸氧耗降低47%, 同时呼吸链NADH-COQ还原酶(复合体Ⅰ)和细胞色素c氧化酶(复合体Ⅳ)活性显著降低[2, 3]。我们以往研究发现, 低压缺氧不同时间的大鼠脑线粒体氧化呼吸速率、ATP合成速率以及ATP合成酶(复合体Ⅴ)活性均发生改变[4]。无疑, 线粒体氧化磷酸化功能改变是缺氧导致脑能量代谢障碍的细胞学基础。
线粒体内膜呼吸链酶复合体的部分亚基是由mtDNA编码并在线粒体内转录和翻译而表达, 但对缺氧时mtDNA编码氧化磷酸化基因表达却知之甚少。Sauleda等报道伴有呼吸衰竭的慢性阻塞性肺病（COPD）病人骨骼肌线粒体细胞色素氧化酶(COX, 复合体Ⅳ)活性显著高于健康对照组, 同时发现, mtDNA编码的细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COX-Ⅰ)mRNA无显著变化, 但12 s rRNA则显著升高, 提示酶活性的调节很可能是在翻译水平通过增加核糖体数而实现的[9]。我们利用细胞器体外转录和翻译模型, 直接观察线粒体RNA和蛋白质的合成功能, 发现急性缺氧可使脑线粒体RNA的体外合成活性降低40%, 而蛋白质的体外合成则降低60%; 慢性缺氧时线粒体的体外RNA和蛋白质合成活性均高于急性缺氧组, 但仍分别比对照组降低28%和24%, 揭示缺氧可在转录与翻译两个水平上影响线粒体遗传信息的表达, 而且与机体缺氧暴露的时间有关, 呈时间依赖性。这种急性缺氧对线粒体基因表达的抑制和慢性缺氧时一定程度的恢复, 与缺氧过程中线粒体氧化磷酸化功能改变[4]趋势相似, 这或许是在氧利用环节上机体对慢性缺氧适应的细胞机制之一。
目前对mtDNA转录和翻译过程的确切机制以及调节因素还不甚清楚。缺氧对线粒体RNA转录和蛋白质翻译合成过程的影响机制可能与多种因素有关, 如细胞内pH[10]、氧自由基[11]、Ca2+[12]等。Kwast等利用分离的虾胚线粒体, 在介质中完全无氧的条件下线粒体蛋白合成速度降低79%, 而当介质中pH由7.5降到6.8(相当于虾胚无氧时测到的细胞内pH), 蛋白合成速度进一步降低10%[10]。除此之外, ATP在线粒体遗传信息表达的转录与翻译过程中均起着极其重要的作用。
3.2 ATP在线粒体RNA和蛋白质合成中的调节作用及其意义
ATP是线粒体氧化磷酸化的产物, 反过来又影响呼吸链酶的表达。ATP除了做为RNA合成的必需底物外, 还提供所必需的能量。在细胞器的体外转录与翻译模型中, 所需的ATP既可来自于外界的加入, 又可来自线粒体自身对碳源的氧化而产生。即使脑组织ATP储备少, 在大鼠脑线粒体体外转录体系中, 外源ATP对线粒体RNA合成的影响与报道的HeLa细胞[13]、大鼠肝线粒体[14]所观察的结果一致; 在体外翻译系统中, 不含有可供氧化的碳源(琥珀酸)时, 翻译活性随介质中外源ATP浓度变化的特性与转录过程相似, 而在此基础上加入氧化底物, 反而表现为一定的抑制效应。这些结果说明, 无论是线粒体自身产生还是外界加入, ATP可双相性的影响线粒体生物大分子的合成, 高浓度的ATP则抑制mtDNA的表达。这对于线粒体做为产能器官具有重要意义, 当细胞能量需求增加而ATP不足时, mtDNA的表达增强, 呼吸链酶合成增加, 使氧化磷酸化过程加强, 加速ATP的生成; 当能量过量时, 又可通过抑制mtDNA的表达而减少有关酶的合成, 以防止能量的生成过剩, 是一种经济和积极有效的反馈调节方式。但当无外源ATP加入时, RNA合成和蛋白质合成并未完全停止, 分别为最大活性的21%和85%, 尤其是在翻译体系中不含有碳源时, 体外翻译活性仍有最大活性的53%。这一方面说明线粒体RNA的转录过程比蛋白质合成的翻译过程对ATP的依赖性更大, 另一方面提示ATP除了外界加入和线粒体通过氧化磷酸化产生外, 其它三磷酸核苷可能也起一定的补偿作用。
虽然ATP的调节作用在线粒体生物大分子合成中占有重要地位, 但在体内, 线粒体基质中腺苷酸池浓度要受到线粒体中水分含量、膜上腺苷酸载体等多种因素影响, 因此尚不能确定机体在缺氧暴露时这种调节作用所发挥的程度。但在缺氧过程中, 线粒体内腺苷酸池的含量(并非浓度)无疑是发生了明显的变化[4]。
参 考 文 献
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