Received 2002-02-08    Accepted 2002-09-27

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39770850)

*Corresponding author. Tel: +86-10-66931624;  E-mail: jqzh@yahoo.com

 

生理学报, Dec. 2002, 54  (6): 497-500

Acta Physiologica Sinica    

 

研究论文

美加明和六烃季铵在交感神经元烟碱受体上作用位点的差异

刘  卫2, 郑建全1,*, 刘振伟1, 李立君1, 万  勤1, 刘传缋1

1军事医学科学院毒物药物研究所,  北京 100850;

2济南军区第88医院, 泰安 271000

 

摘  要:    为比较美加明(mecamylamine, MEC)和六烃季铵(hexamethonium, HEX)在交感神经元烟碱受体上作用位点的差异, 实验用膜片钳全细胞记录技术研究了MEC和HEX对交感神经元烟碱诱发电流的抑制作用。在培养的颈上神经节细胞上, MEC和HEX拮抗烟碱作用的IC50分别为0.0012和0.0095 mmol/L, 并且都加速烟碱受体脱敏。在－30、－70和 －110 mV钳制电压下, MEC和HEX抑制烟碱诱发电流的作用有电压依赖性。但在每隔3 min连续给药的情况下, MEC的作用有使用依赖性而HEX没有, 表明MEC和HEX在交感神经元烟碱受体上的作用位点不同。

 

关键词: 烟碱受体; 膜片钳; 交感神经元; 变构调节; 拮抗剂

中图分类号: Q425

 

Difference in action sites between mecamylamine and hexamethonium on nicotinic receptors of sympathetic neurons

LIU Wei2, ZHENG Jian-Quan1,*, LIU Zhen-Wei1, LI Li-Jun1, WAN Qin1, LIU Chuan-Gui1

1Institute of Toxicology and Pharmacology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850;

2 88 Hospital of Jinan Military Region, Taian 271000

 

Abstract:   To compare the difference in action sites between mecamylamine (MEC) and hexamethonium (HEX) on nicotinic receptors of sympathetic neurons,  we investigated the effects of MEC and HEX on  the  nicotine-induced currents in cultured superior cervical ganglion neurons  by whole-cell  patch clamp technique. The IC50 of MEC and HEX for antagonizing the effect of 0.08 mmol/L nicotine   was 0.0012 and 0.0095  mmol/L,  respectively. Both MEC and HEX accelerated the desensitization of nicotinic receptors.  Furthermore, by comparing their  effects at holding potentials －30,－70 and －110 mV, it was indicated that their suppressing effect  on the nicotine-induced currents was voltage-dependent. However, different from that of HEX, the inhibitory effect of MEC increased with  administrating the mixture of MEC and  nicotine at intervals of 3 min, indicating a use-dependent effect of MEC.  It is concluded that the action site of MEC on nicotinic receptors of sympathetic neurons is different from that of HEX.

 

Key words: nicotinic receptors; patch clamp technique; sympathetic neurons; allosteric modulation; 

  antagonist

 

    美加明(mecamylamine, MEC)和六烃季铵(hexamethonium, HEX)作为神经节阻断剂是常用的工具药, 现认为MEC的作用部位在神经节细胞烟碱受体的离子通道[1]。我们用膜片钳全细胞记录方法在培养的交感神经元上观察了MEC和HEX对烟碱受体脱敏的影响及其抑制作用的电压依赖性和使用依赖性, 由此判断它们作用位点的差异。

 

1  材料和方法

1.1 交感神经元培养[2]

    取当天新生的Wistar大鼠, 无菌条件下取双侧颈上交感神经节, 在冰浴的磷酸缓冲液中剥离干净并撕成数小块, 放入37℃含0.25%胰蛋白酶的磷酸缓冲液中消化30 min, 离心, 弃上清液, 加入饲养液[含DMEM 89%、马血清10%、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS) 1%], 吹打使神经元分散, 加入适量神经生长因子后移入35 mm塑料培养皿中, 细胞接种密度为1×105/ml。在36℃ 10% CO2培养箱中孵育, 3 d换液1次, 培养7-9 d的神经元突起联成网状, 用于全细胞记录, 胞体有较稳定的烟碱诱发电流。

 

1.2 全细胞记录

   取培养的交感神经元, 弃去饲养液, 加入2 ml细胞外液(mmol/L: NaCl 140、KCl 5、MgCl2 1、HEPES 10、glucose 10, CaCl2 3,  pH 7.2-7.4), 用尖端直径1 μm的软质玻璃电极充满细胞内液(mmol/L: KCl 140、HEPES 10、EGTA 10  mmol/L, pH 7.2-7.4)后与膜片钳前置放大器相连, 在倒置相差显微镜下用微操纵器引导小心贴附细胞膜, 施加负压使电极尖端与细胞膜形成紧密封接, 用1.5 V 20 ms脉冲击破细胞膜, 形成全细胞记录。

 

1.3 细胞给药

    烟碱、盐酸MEC和盐酸HEX均为Sigma产品。将尖端直径8-10 μm的玻璃微管充满用细胞外液配制的药液后与压力注射仪相连, 给药压力2-6 psi, 玻璃微管尖端与细胞距离20-50 μm, 观察喷出的药液以能覆盖记录细胞但不使细胞变形为宜。根据需要调整给药持续时间1 s或30 s 。

 

1.4 数据的采集和分析

    用pClamp 7.0采集信号, 数据用Origin 6.0进行统计分析和画图。数据以mean±SD表示, 根据资料性质用单因素或双因素方差分析(ANOVA)进行统计分析。

 

2  结果

2.1 MEC和HEX对烟碱诱发电流的抑制作用

     把细胞膜电位钳制在－70 mV, 向细胞喷射0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mmol/L烟碱1 s, 可诱发一内向烟碱电流, 诱发电流幅度有量效依赖关系(图1)。MEC或HEX与烟碱混合给药, 可观察到MEC或HEX对烟碱诱发电流的抑制作用。设绝对大剂量MEC(1.0 mmol/L)或HEX(1.0 mmol/L)对0.08 mmol/L烟碱诱发电流的抑制作用Emax为1, 比较MEC和HEX对0.08 mmol/L烟碱诱发电流抑制作用的量效曲线(图2), 用Lineweaver-Burk方法对Clark方程E=Emax·[A]H/(K+[A]H)进行双倒数转换和对数转换, 得Hill对数方程lg[E/(Emax－E)]＝H lg[A]－lgK, 拟合直线, 得MEC和HEX的Hill系数H和半数抑制量(IC50)K分别为HMEC=1.19, KMEC=0.0012 mmol/L; HHEX=1.07, KHEX=0.0095 mmol/L。

图  1.  颈上神经节神经元的烟碱诱发电流及其量效关系

Fig. 1.  Nicotine-induced current in super cervical ganglion neurons (A) and the dose-effect relationship (B)  (mean±SD; n=7 cells).

 

图  2.  MEC和HEX对0.08 mmol/L烟碱诱发电流的抑制作用

Fig. 2.  Inhibitory effects of mecamylamine and hexamethonium on 0.08 mmol/L nicotine-induced current   in super cervical ganglion neurons    (mean±SD; n=7 cells).

 

2.2 MEC和HEX对烟碱受体脱敏的影响

     向细胞喷射烟碱30 s覆盖诱发电流的全过程, 诱发电流的衰减过程反映了烟碱受体的脱敏, 它符合双指数曲线, 双指数曲线的2个时间常数即快脱敏时间常数τf和慢脱敏时间常数τs是衡量烟碱受体脱敏的定量指标[3]。细胞膜钳制在－70 mV, 用0.001 mmol/L MEC或0.01 mmol/L HEX与0.08 mmol/L烟碱混合给药30 s (图3)。 结果表明, MEC或HEX都使烟碱受体脱敏的时间常数τs减小 (表1,  P<0.01),  MEC或HEX加速了烟碱受体脱敏。

图  3.   MEC和HEX加速烟碱受体脱敏

Fig. 3.  Accelerating  effect of mecamylamine (MEC) and hexamethonium  (HEX) on desensitization of nicotinic receptor  in super cervical ganglion neurons.A: Nicotine 0.08 mmol/L for 30 s.  B: Nicotine 0.08 mmol/L+MEC  0.001 mmol/L  for 30 s. C: Nicotine 0.08 mmol/L+HEX 0.01 mmol/L  for 30 s.

 

表  1. MEC和HEX对烟碱受体脱敏的影响

Table 1. Effect of mecamylamine and hexamethonium on desensitization of nicotinic receptor

	Time constant τf (s)	Time constant τs(s)
Nicotine	1.83±0.38	13.1±2.17
Mecamylamine	1.25±0.31	3.91±0.77**
Hexamethonium	1.71±0.33	3.06±0.92**

n=7 cells. **P<0.01 ANOVA, vs nicotine.

 

2.3 MEC和HEX的电压依赖性

       把细胞膜分别钳制在－30、－70、－110 mV, 观察在各钳制电压处MEC或HEX对烟碱诱发电流的抑制作用(图4)。结果是, 随着细胞膜超极化, 0.001 mmol/L MEC或0.01 mmol/L HEX对0.08 mmol/L烟碱诱发电流的抑制作用显著增加(P<0.05), 表明MEC或HEX抑制烟碱受体的作用有电压依赖性(表2)。

 

表  2. MEC和HEX对烟碱诱发电流的电压依赖性抑制作用

Table 2. Voltage-dependent suppression of nicotine-induced currents by MEC and HEX 

	Inhibitory  effects (%)  at different holding potentials
	-30  mV	-70 mV	-110 mV
Mecamylamine	32.8±11	52.1±8.8	65.7±12.3*
Hexamethonium	37.2±9.5	61.0±10	77.1±12.8*

  n=7 cells. *P<0.05 ANOVA vs -30  mV．

 

图  4.   MEC和HEX对烟碱诱发电流抑制作用的电压依赖性

Fig. 4. Voltage-dependent suppression of nicotine-induced current by mecamylamine and hexamethonium. NIC, nicotine; MEC, mecamylamine; HEX, hexamethonium.

 

2.4 MEC和HEX的使用依赖性

       把细胞膜钳制在－70 mV, 间隔3 min向同一神经元连续喷射0.001 mmol/L MEC或0.01 mmol/L HEX与0.08 mmol/L烟碱的混合物。 随着给药次数增加, MEC对烟碱的抑制率有增加趋势, 而HEX没有(图5), 表明MEC有使用依赖性而HEX没有。

 

3  讨论

     膜片钳全细胞记录技术在研究烟碱受体的变构调节中有独到之处, 变构调节剂对烟碱受体脱敏的影响、变构调节剂的电压依赖性和使用依赖性都能用膜片钳全细胞记录技术表现出来, 通过这些指标, 能判断出变构调节剂在烟碱受体上的作用位点[4]。

     持续的烟碱刺激能导致烟碱受体脱敏, 这在全细胞记录上表现为电流的有规律衰减, 用电流的衰减过程作为指标观察药物对烟碱受体脱敏的影响已成为一种普遍采用的方法[3]。 由于变构调节剂的变构作用间

接地改变了受体通道的通透性而能改变激活态受体的脱敏过程[5], 在全细胞记录中表现为烟碱电流衰减加快, 衰减过程的双指数曲线时间参数(τ)变小。

 

图  5.  MEC和HEX抑制烟碱诱发电流的使用依赖性

Fig. 5.  Use-dependence of MEC suppressing nicotine-induced currents in  super cervical ganglion neurons.A: Nicotine 0.08 mmol/L for 1 s at intervals of 3 min.  B: Nicotine 0.08 mmol/L+MEC  0.001 mmol/L  for 1 s at intervals of 3 min. C: Nicotine 0.08 mmol/L+HEX 0.01 mmol/L  for 1 s at intervals of 3 min. n=9, ANOVA, *P<0.05 vs 1 s administration (q test).

 

    电压依赖性是变构调节剂作用在烟碱受体离子通道中或作用在受体外侧与脂质双分子层交界部位时表现出的性质。因为这2个位点处于作为电容的细胞膜的电场之中, 随着钳制电压的改变, 细胞膜电量改变, 处于电场之中带电荷的药物分子数目随之不同, 因而作用强度不同。例如, 局部麻醉药能阻断烟碱受体离子通道[6], 普鲁卡因等药物在抑制乙酰胆碱诱发电流时有电压依赖性[7]。

    还有一个与药物有关的指标是使用依赖性, 它是指药物随使用频率增加而药效不断增强的性质, 在分子水平上, “陷阱”理论是较合理的解释[8]。当烟碱受体被烟碱激活, 离子通道不断开放、关闭时, 对于位置在细胞“陷阱”中的作用位点(如在离子通道中或细胞内)来说, 拮抗剂随通道开放不断进入“陷阱”中, 由于拮抗剂解离速度较慢, 在受体重新被激活并再使用拮抗剂抑制激活时, 又有拮抗剂分子进入“陷阱”并与作用位点结合, 使抑制作用不断加强, 从而表现出使用依赖性。例如, MEC阻断离子通道, 其特征是既有电压依赖性又有使用依赖性; 多肽PAMP抑制烟碱电流只有使用依赖性没有电压依赖性, 所以其作用位点在细胞内[9]。

     MEC和HEX是常用的工具药, 精确阐述其作用机制对进一步明确烟碱受体及其变构调节有重要意义。本实验结果表明, MEC和HEX在神经节烟碱受体上的作用位点不完全一致。由于MEC和HEX都加速烟碱受体脱敏, 所以它们都是烟碱受体的变构调节剂; 又由于它们的抑制作用都有电压依赖性, 所以它们的作用位点有2种可能: (1)在离子通道中; (2)在受体外侧与细胞膜交界的部位。进一步观察它们的使用依赖性, 可见MEC的作用位点有“陷阱”的性质, 即在离子通道中; 而HEX由于没有使用依赖性, 所以其作用位点没有“陷阱”的性质, 即在受体外侧与细胞膜交界的部位。

 

参  考  文  献

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[2]  Zheng JQ, He XP, Yang AZ, Liu CG. Blocking effect of tricyclopinate on nicotinic receptors in cultured sympathetic neurons. Acta Pharmacol Sin, 2000,21:1016-1020.

[3]  Changeux JP, Revah F. The acetylcholine receptor molecule: allosteric sites and the ion channel. TINS, 1987,10:245-250.

[4]  刘传缋, 郑建全, 高占国. 抗胆碱药在神经元N受体上作用位点的分析。周宏灏主编, 分子药理学,  哈尔滨:  黑龙江科学技术出版社, 1999,116-127.

[5]  Changeux JP. The nicotinic acetylcholine receptor: an allosteric protein prototype of ligand-gated ion channels. TiPS, 1990,11:485-492.

[6]  Arias HR. Role of local anesthetics on both cholinergic and serotonergic ionotropic receptors. Neurosci Biobehav Rev, 1999,23:817-843.

[7]  Adams DJ, Cuevas J. Local anaesthetic blockade of neuronal nicotinic ACh receptor-channels in rat parasympathetic ganglion cells. Br J Pharmacol, 1994,111:663-672.

[8]  McDonald JF, Miljkovic Z, Pennefather P. Use-dependent block of excitatory amino acid currents in cultured neurons by ketamine. J Neurophysiol, 1987,58:251-266.

[9]  Nabekura J, Murata O, Isibashi H, Akaike N. Use-dependent suppression of nicotinic acetylcholine receptor response by the proadrenomedullin N-terminal 20-amino acid peptide in rat locus coeruleus neurons. J Neurochem,  1997,70:865-870.