Received 2002-03-29    Accepted 2002-09-09

*Corresponding author. Tel: +86-10-66931301;  E-mail: fanming@nic.bmi.ac.cn 

生理学报, Dec. 2002, 54  (6): 508-512

Acta Physiologica Sinica    

 

研究论文

氯化钴增强培养海马神经元葡萄糖转运活性参与抗缺氧的作用

于  顺2,   范  明1,*,  赵  彤1,   丁爱石1,   王福庄1

1军事医学科学院基础医学研究所神经生物学研究室, 北京100850;

2首都医科大学宣武医院老年病研究所, 北京 100053

 

摘  要:    本文用培养新生大鼠海马神经元观察了氯化钴对葡萄糖转运活性的影响及其在神经元抗缺氧中的作用。结果表明, 用CoCl2处理的培养海马神经元, 24 h后其2-脱氧-D-[1-3H]葡萄糖摄取率和葡萄糖转运体GLUT1和GLUT3 mRNA表达明显高于对照组, 并且其在缺氧6或8 h后的损伤也明显减轻。氯化钴对神经元缺氧损伤的保护作用被葡萄糖转运体抑制剂细胞松弛素B大部分消除。结果提示, 氯化钴能够增强神经元GLUT1和GLUT3 mRNA的表达和葡萄糖转运活性。CoCl2的这一作用可能是其增强神经元抗缺氧的重要机制。

 

关键词: 缺氧; 氯化钴; 葡萄糖转运体; 神经元

中图分类号: Q421

 

CoCl2 -induced enhancement of glucose transport activity in mediating hypoxic tolerance in cultured hippocampal neurons

YU Shun2,   FAN Ming1*,    ZHAO Tong1,  DING Ai-Shi1,   WANG Fu-Zhuang1

1Department of Neurobiology, Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences,  Beijing 100850;

2Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital of Capital University of Medical Sciences, Beijing 100053

 

Abstract:   The effect of CoCl2 pretreatment on glucose transport activity of  cultured newborn rat hip- pocampal neurons and its role in neuronal hypoxic tolerance were observed. The results showed that the 2-deoxy-D-[1-3H ]glucose uptake rate and the mRNA expressions of glucose transporters (GLUT1 and GLUT3) in the hippocampal neurons were significantly increased after a 24-hour pretreatment with CoCl2. The cell injury induced by 6-hour or 8-hour hypoxic exposure was also greatly reduced by CoCl2 pretreatment. The protective effect of CoCl2 on the neurons was largely abolished by cytochalasin B, a specific inhibitor of glucose transporters. The results suggest that CoCl2 can increase mRNA expressions of GLUT1 and GLUT3 and glucose transporter activity of the neurons, which may be an  important mechanism for the increased tolerance of the neurons to hypoxia.

 

Key words: hypoxia; CoCl2; glucose transporter; neuron

 

     哺乳动物细胞对缺氧环境的适应很大程度上依赖于其内在的低氧信号传导通路的激活和由此引起的一系列缺氧诱导基因(hypoxia-inducible gene)的表达。缺氧诱导因子被证明在这一传导通路中起关键性作用。缺氧可以使缺氧诱导因子1 (HIF-1)在细胞内积聚, 并使许多缺氧反应基因表达增加, 如磷酸果糖激酶、乳酸脱氢酶、红细胞生成素(EPO)、葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT3等[1,2]。除低氧外, 氯化钴和去铁胺等过渡金属也可以引起细胞内HIF-1积聚[1,2]。有研究表明, 氯化钴预处理可以引起大鼠脑中的HIF-1表达增加, 并明显保护缺血缺氧引起的脑损伤[3,4]。 然而氯化钴的保护作用是否与其促进神经元的葡萄糖摄取有关尚不清楚。葡萄糖是脑的重要能源物质。正常情况下, 脑细胞主要依靠葡萄糖的有氧氧化获得能量。在缺氧时, 由于葡萄糖的有氧氧化受抑制, 脑细胞转为依靠葡萄糖的无氧酵解获取能量。由于脑细胞在无氧时只能通过无氧酵解获得能量, 而葡萄糖摄取是无氧酵解的限速步骤[5], 因此脑细胞的葡萄糖摄取能力在缺氧性脑损伤和抗损伤中起着非常重要的作用。已知在正常情况下, 神经元主要表达GLUT3葡萄糖转运体, 但在应激情况下也表达GLUT1葡萄糖转运体[5]。根据以上分析, 我们用原代培养的大鼠海马神经元研究了氯化钴预处理对海马神经元葡萄糖转运活性以及GLUT1和GLUT3葡萄糖转运体表达的影响, 分析了神经元葡萄糖转运活性与其抗缺氧能力之间的关系。

 

1  材料和方法

1.1  海马神经元的培养

    取新生当天Wistar大鼠, 无菌条件下断头、取脑, 分离出双侧海马。海马组织用0.125%胰蛋白酶消化(36℃, 30 min), 在含有10%马血清和10%胎牛血清(HyClone, USA)的高糖DMEM(GIBCO, USA)中吹打分散成细胞悬液, 按2×105/cm2接种于涂有多聚赖氨酸的Φ35 mm塑料培养皿中(Nunc, Denmark), 在37℃、10% CO2培养箱(Forma Scientific, USA)中培养。24 h后更换含10%马血清的新鲜DMEM高糖培养基。3-5 d后, 在培养皿中加入阿糖胞苷以抑制非神经细胞的过度增殖, 以后每隔3 d换1次半液, 直到培养至第12天。

 

1.2  细胞的缺氧处理

    将细胞转移到37℃缺氧密闭罐中, 向密闭罐中充以无氧混合气(10% CO2 + 90% N2) 6或8 h。

 

1.3  葡萄糖摄取率的测定

   葡萄糖摄取率的测定参考Hara M等[6]的方法进行。缺氧结束后, 用37℃ PBS将细胞洗3遍。然后向培养皿中加入1 ml含0.5 mmol/L 2-DG(2-Deoxy-D-[1-3H] glucose, Amersham Pharmacia Biotech)和18.5 kBq/ml [3H]-2-DG的 PBS, 37℃孵育5 min。吸出反应液, 并用冰冷的PBS洗4遍。加0.5 ml 0.2 mol/L NaOH, 在室温下消化细胞1 h。用0.5 ml 0.2 mol/L HCl中和消化产物。消化产物各取100  μl, 分别用于蛋白浓度和放射性测定。蛋白浓度用Lowry 法测定, [3H]-2-DG放射性用液体闪烁计数器(Beckman LS6500, USA)测定。

 

1.4  Northern blot 法

    细胞总RNA用RNA提取试剂盒(RNAgents Total RNA Isolation System, Promega, USA)提取。20 μg总RNA用1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离后, 转移至尼龙膜上, 然后在快杂液中(Clonetech)于68℃条件下分别与GLUT1和 GLUT3 cDNA以及β-actin cDNA探针杂交。用于Northern杂交的GLUT1和 GLUT3 cDNA探针是编码大鼠GLUT1第208-393氨基酸和GLUT3 204-383氨基酸的一段cDNA, 从大鼠脑组织用RT-PCR合成。探针用[32P]-dCTP通过随机引物标记试剂盒(Prime-a-Gene Labeling System, Promega, USA)标记。杂交后的尼龙膜分别用2×SSC 和0.5×SSC 各洗两次, 然后暴露于X-光胶片。杂交条带被扫描到电脑中, 然后用Image Master Elite 1D (Version 3.01, Amasham Pharmacia Biotech)软件分析杂交条带的光密度。

 

1.5  细胞存活率的判定

    参照Maiese K等[7]的方法, 用台盼蓝排斥试验判定细胞的存活和死亡, 细胞的损伤程度用细胞存活率表示。具体方法为: 在急性缺氧6-8 h后细胞用0.4%台盼蓝染色后, 利用双盲法在明视野下计数活细胞数。根据细胞的形态识别神经元, 每个皿随机选择8个视野, 计数每个视野的活细胞和死细胞数, 然后计算每个皿的平均细胞存活率。每个皿的细胞存活率按n=1, 每个实验组计数5个皿, 即n=5次。

 

1.6  数据的统计

    所得数据用mean±SD列出, 各实验组之间的显著性差异用t检验分析。P<0.01为差异显著, P<0.05为有统计学意义。

 

2  结果

2.1  氯化钴预处理增强海马神经元的葡萄糖摄取率

      海马神经元培养至12 d时, 向培养基中加入CoCl2 (终浓度250  μmol/L), 12 h后测定神经元对2-DG的摄取率。结果如图1所示, CoCl2处理神经元的2-DG摄取率由对照组的4.34±1.72 nM/(mg·min)增加到6.76±1.24 nM/(mg·min), 平均增加了55.8%。这一结果提示CoCl2可以增强神经元的葡萄糖转运活性。

 

图  1.   CoCl2对神经元2-DG摄取率的影响

Fig. 1.  Effect of CoCl2 on 2-DG uptake rate of neurons.

 

2.2  氯化钴提高海马神经元GLUT1和 GLUT3 mRNA 的表达

    为证明由CoCl2引起的海马神经元葡萄糖转运活性增强与GLUT1和 GLUT3 mRNA表达之间的关系, 采用Northern blot 分析法观察了CoCl2对GLUT1和 GLUT3 mRNA表达的影响。结果表明, 用250  μmol/L  CoCl2处理12 h后, 神经元的GLUT1和 GLUT3 mRNA水平均明显高于对照组。GLUT1和 GLUT3 mRNA的表达分别比对照组增加了2.4%和3.5% (图2A和2B)。

 

图  2.   Northern blot 分析CoCl2处理12 h后海马神经元GLUT1和GLUT3 mRNA的表达

Fig. 2.  Northern blot analysis of the expression of GLUT1 and   GLUT3 mRNA in hippocampal neurons   treated with CoCl2 for 12 h.

 

2.3  氯化钴增强海马神经元的抗缺氧能力

      我们首先观察了不同浓度的CoCl2对海马神经元抗缺氧能力的影响。神经元培养至12 d时, 向培养基中加入不同浓度的CoCl2, 然后让神经元暴露于无氧混合气6 h。如图3所示, CoCl2的抗缺氧作用与其浓度具有密切关系。其中, 当CoCl2的浓度由15  μmol/L增加到62  μmol/L时, 神经元的抗缺氧能力随浓度升高而明显增强。但进一步将CoCl2的浓度由62  μmol/L升高到125和250  μmol/L时, 神经元的抗缺氧能力的虽然有所增强但幅度明显减小。统计结果显示, 当神经元分别用15、31、62、125和250  μmol/L CoCl2处理时, 神经元在6 h缺氧后的存活率分别为62.4±2.7%、73.4±2.1%、88.3±3.0%、88.4±1.9%和92.2±2.1% (图3)。

 

图  3.  不同浓度CoCl2对海马神经元耐缺氧能力的影响

Fig. 3.  Effects of different concentrations of CoCl2 on the   hypoxic tolerance of hippocampal neurons.

 

2.4  细胞松弛素B对CoCl2抗缺氧作用的抑制效应

      在以上观察的基础上, 我们研究了葡萄糖转运体抑制剂细胞松弛素B对CoCl2抗缺氧作用的影响。用250  μmol/L CoCl2预处理神经元12 h, 然后将神经元分成两组, 一组细胞加细胞松弛素B(终浓度10  μmol/L), 另一组加PBS做对照。孵育30 min后, 将两组细胞转移到缺氧密闭罐中, 使其暴露于缺氧混合气6或8   h。结果表明, CoCl2明显增强神经元的抗缺氧能力, 这些神经元在暴露于无氧环境6 h后, 细胞形态无明显变化, 细胞存活率与对照组无显著差别。当暴露于无氧环境8 h后, 只有少数神经元死亡, 细胞形态轻度改变。统计结果显示, 正常对照以及经CoCl2处理的神经元在缺氧6和8 h后的细胞存活率分别为92.1±3.1%、91.3±2.1%和83.7±2.6%。而未经CoCl2处理的神经元在缺氧6和8 h后的细胞存活率则分别降至40.8±6.7%和23.75±2.7%(图4)。细胞大部分崩解死亡, 部分细胞肿胀, 外观扁平, 缺乏立体感。该结果提示, CoCl2可以明显增强神经元的抗缺氧能力。然而, 如在缺氧前30 min向培养基中加入10 μmol/L CB以阻断葡萄糖的摄取, 则CoCl2的抗缺氧作用明显减弱。统计结果显示, 在CB存在时进行6和8 h缺氧后, CoCl2预处理神经元的存活率由无CB时的91.3±2.1%和83.7±2.6%分别降低到15.2±2.2%和0, 此时, 未经CoCl2处理的神经元已经全部死亡(图4)。这一结果提示, CoCl2的抗缺氧作用在很大程度上与增强葡萄糖的摄取率有关或明显依赖于葡萄糖的摄取。

图  4.  细胞松弛素B对CoCl2增强海马神经元抗缺氧能力作用的的抑制效应

Fig. 4.  Inhibitory effect of cytochalasin B on the increased hypoxic tolerance of  hippocampal neurons  induced by CoCl2.

 

3  讨论

     以往的研究发现, 氯化钴预处理对新生大鼠脑的缺血缺氧损伤有保护作用, 但目前尚无直接证据表明这种保护作用与刺激葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取有关[3,4]。已知, 脑在无氧条件下的唯一产能途径是无氧酵解, 而葡萄糖摄取是无氧酵解的限速步骤。因此我们认为, 在无氧条件下神经元能否从细胞外获得足够的葡萄糖是神经元获得缺氧耐受性的关键。本研究在培养新生大鼠海马神经元观察到氯化钴预处理能够增强海马神经元对缺氧的耐受力, 并刺激神经元的葡萄糖摄取。氯化钴增强海马神经元葡萄糖摄取能力的作用很可能与其促进GLUT1和GLUT3 mRNA表达有关。因为, 用氯化钴处理的神经元其GLUT1和GLUT3 mRNA的表达也大幅度升高。在某些其它组织细胞, 也有证据表明氯化钴刺激GLUT1 mRNA表达伴随这些细胞的葡萄糖摄取率增强[8,9]。氯化钴促进GLUT1和GLUT3 mRNA表达的作用很可能与其诱导缺氧诱导因子HIF-1表达有关。尽管我们没有直接观察氯化钴对HIF-1表达的影响, 但大量研究表明, 氯化钴可以引起包括神经元在内的各种细胞的HIF-1表达, 而GLUT1和GLUT3已被证明是HIF-1的下游调控基因。

为证明氯化钴增强神经元葡萄糖摄取的效应在其抗缺氧中的作用, 我们利用細胞松弛素B处理神经元, 观察氯化钴抗缺氧作用的变化。结果显示, 细胞松弛素B明显削弱氯化钴的抗缺氧作用。细胞松弛素B被广泛用作葡萄糖摄取的抑制剂[10-13]。有研究表明, 细胞松弛素B可以阻断95%以上的神经细胞的葡萄糖摄取[11]。因此, 细胞松弛素B使CoCl2的抗缺氧作用削弱很可能与其抑制神经元的葡萄糖摄取有关。已知, 细胞松弛素B可以影响细胞骨架, 因此由细胞松弛素B导致的神经元抗缺氧作用减弱可能不单纯是由于抑制葡萄糖引起的。然而, 我们用细胞松弛素B单独处理神经元后, 没有发现对神经元存活率有明显影响。此外, 去除细胞外液的葡萄糖后, 氯化钴的抗缺氧作用也明显减弱。以上结果提示葡萄糖摄取在抗缺氧中具有重要作用。

     已知氯化钴可以竞争性阻断Ca2+通道, 然而用于Ca2+通道阻断剂所使用的氯化钴的浓度约在2 mmol/L左右, 而本研究所使用的氯化钴的浓度为250  μmol/L, 因此很难想象如此低浓度的氯化钴能够竞争性阻断钙通道。此外, 低浓度的氯化钴(250  μmol/L)被证明对氧化应激引起的神经元凋亡有保护作用, 氯化钴的这一作用并不因增加细胞外Ca2+而被抑制[14]。

     根据以上结果和分析, 我们认为当细胞外葡萄糖供给充足的情况下, 神经元在缺氧时的葡萄糖摄取能力是其能否有效耐受缺氧的关键。因此, 寻找缺氧时增强神经元葡萄糖供给和葡萄糖摄取能力的调控因素具有重要意义。

 

参  考  文  献

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