Received 2002-03-21 Accepted 2002-09-28

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30271211), the Association Franco-Chinoise pourla Recherche Scientifique & Technique (PRA B97-03), and the Sicentific Research and Development Foundation of Shantou University.

*Corresponding author. Tel: +86-754-8900456; E-mail:ksli@stu.edu.cn

生理学报, Dec. 2002, 54 (6): 513-518

Acta Physiologica Sinica

研究论文

小鼠血浆TNF-α、NO、NOS水平与脑不对称的关系

付清玲, 李康生*

汕头大学医学院微生物学与免疫学教研室, 汕头 515031

摘要: 研究脑不对称对单核巨噬细胞(Mo/MФ)的影响。选用雌性4周龄Balb/c健康小鼠, 用伸爪取食法根据右利分将小鼠区分为左利、右利和双利三组。细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)腹腔注射两小时后取血浆检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)水平。结果显示: (1)各组间血浆TNF-α和NO、NOS水平的变化: 正常生理组NO水平为双利组高于左利组(P<0.05); LPS刺激后双利组和右利组血浆TNF-α水平高于左利组(P<0.05), NO水平为双利组高于右利组(P<0.01)和左利组(P<0.05), NOS水平在三组小鼠间无明显差别。(2) 血浆TNF-α、NO、NOS与右利分有一定的相关关系, 各项指标随右利分的变化趋势多为双利>右利和左利, 形成一以双利分段(右利分为21-29)为高峰的弓形向上的曲线, 随右利分的增加或减少曲线向两侧延伸和下降。上述结果提示, 脑不对称小鼠单核/巨噬细胞功能存在差异。脑不对称对免疫功能的影响程度与右利分有关, 各免疫指标随右利分的变化趋势多为一以双利分段为高峰的弓形向上的曲线。

关键词: 脑不对称; 免疫调控; 肿瘤坏死因子α; 一氧化氮; 一氧化氮合酶; 巨噬细胞

中图分类号: Q426; R338.2

The correlations between plasma TNF-α, NO, NOS levels and brain lateralization in mice

FU Qing-Ling, LI Kang-Sheng

Department of Microbiology and Immunology, Shantou University Medical College, Shantou, 515031

Abstract: The brain modulates the immune system in an asymmetrical way, as shown by the association between paw preference and immune response in the mice. The purpose of the present work was to study the relationship between plasma tumor necrosis factor-α (TNF-α), nitric oxide (NO) and nitric oxide synthase (NOS) and brain lateralization.　In the study, paw preference test was used to select right-pawed, left-pawed and ambidextrous mice. Mice were classified as the right-pawed if the right paw entry (RPE) score was equal to or greater than 30 (30-50), as the left-pawed if the score was equal to or less than 20 (0-20), and as the ambidextrous if the score was between 21 and 29. One week after the paw preference testing, the animals were injected intraperitoneally with either sterilized 0.9% saline or lipopolysaccharide (LPS) (5 μg/0.5 ml NS) and were killed 2 h later. Plasma was collected from each mouse. The level of plasma TNF-α was measured with ELISA kits provided by ENDOGEN. NO and NOS levels of plasma were detected with kits from Juli Biotechnology Company. The results showed that (1) in the normal mice, ambidextrous mice had higher NO levels compared with left-pawed mice (P<0.05). After the injection of LPS, plasma level of TNF-α was lower in left-pawed mice compared with those of the right-pawed and ambidextrous mice; plasma level of NO was higher in ambidextrous mice compared with those of the right- (P<0.01) and left-pawed (P<0.05) ones, and there was no significant difference in the plasma levels of NOS among ambidextrous, right- and left-pawed mice. (2) Immune parameters were correlated with the RPE scores. The shape of the curve describing this relation was similar to a parabola. In general, the levels of TNF-α, NO, NOS rose along with the increase of RPE if the scores were in the score range of left-pawed mice.After that, they reached a peak if the scores were in the score range of ambidextrous mice. Then they declined along with the increase of RPE if the scores were in the score range of right-pawed mice. In conclusion, plasma levels of TNF-α, NO and NOS were associated with brain lateralization, suggesting that the activities of Mo/Mф were influenced by brain lateralization, and that the immune parameters were correlated with the RPE scores.

Key words: brain lateralization; immunomodulation; tumor necrosis factor-α; nitric oxide; nitric oxide synthase; macrophage

两侧大脑半球在解剖结构、递质分泌及功能上都具有着不对称性。脑不对称(brain lateralization)是个普遍的生物学现象, 其与性格、特殊才能、免疫功能及对应激的反应等有着密切关系, 并对机体许多病理生理过程产生影响。左、右侧大脑皮质对免疫系统的调控亦具有不对称性, 正常机体左侧皮质承担正反馈免疫调节, 右侧为负反馈免疫调节。手功能不对称是脑不对称的反映, 研究者可通过手功能不对称的动物来研究脑的不对称性。流行病学调查发现, 左利人群免疫紊乱如自身免疫病的发病率较一般人群高。白细胞介素1(interleukin-1, IL-1)、白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)、TNF-α、NO和NOS是神经免疫内分泌网络的重要因子。我室前期的工作表明, 腹腔注射细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)后, 小鼠血浆IL-1、IL-6、皮质酮(corticosterone, CS)等的水平变化[1,2]及大脑皮质IL-1、IL-6含量[3,4]均与脑不对称有关; 且腹腔巨噬细胞产生炎性因子IL-1, NO的水平也与脑不对称有关(尚未发表资料)。下丘脑-垂体-肾上腺皮质-单核巨噬细胞(hapothalamic-pituitary-adrenal-monocyte/macrophage, HPA-Mo/MФ)调节环路是神经内分泌免疫网络中的一个重要组成部分。神经系统可通过HPA轴调节免疫功能影响单核巨噬细胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α、NO等因子的功能。单核巨噬细胞分泌的IL-1、IL-6 、TNF-α等因子又可刺激HPA轴, 使促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone, CRH)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrophin, ACTH) 及CS的分泌增加进而调控单核巨噬细胞的功能。这条HPA轴与免疫系统间的信息传递通道即为HPA-Mo/MФ调节环路。据此, 本室在前期工作的基础上, 进一步观察了脑不对称与小鼠单核细胞炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合成酶(NOS)的关系, 以期深入了解脑不对称与HPA-Mo/MФ调节环路的关系。

1 材料和方法

1.1实验动物

Balb/c健康小鼠, 雌性, 4周龄, 清洁级, 由上海西普尔必凯动物实验有限公司供应。在本校清洁级动物饲养室喂养, 5只/笼, 自由饮水取食, 每天保持12 h明暗环境, 行为测试及最后的实验均在上午进行。

1.2 左利、右利和双利小鼠的建立

小鼠适应环境1周后经伸爪取食法区分为左利、右利和双利3组, 方法如下[5]: 小鼠禁食12-18 h后, 置于一特制测试盒内, 盒子体积为4.5 cm×4.5 cm×6.0 cm, 前壁中央连有一小管可放入小饲料块, 以小饲料块逗引小鼠伸爪取食, 观察其50次伸爪取食中伸右爪的次数, 记为右利分(right paw entry, RPE)。2 周内共测试4次, 第1次作为训练不记录, 余下3次右利分取平均值, 0-20分为左利鼠(left-pawed mice), 21-29分为双利鼠 (ambidextrous mice), 30-50分为右利鼠 (right-pawed mice)。每次测试时间控制在30 min内, 伸爪次数不够则加试一次。实验过程中剔出未伸爪取食的小鼠。行为不对称区分后一周, 随机地分为实验组和正常生理组, 实验组每只小鼠以LPS 5 μg/0.5 ml NS、正常生理组以0.5 ml NS腹腔注射。注射后2 h快速断头杀鼠, 用置于冰上EDTA化的试管收集小鼠血液, 3000 r/min离心15 min, 收取血浆, 分装后置于－30℃保存待测。

1.3 血浆TNF-α的检测

使用由深圳晶美生物工程有限公司提供的EN DGEN公司分装小鼠TNF-α双抗体夹心ELISA试剂盒, 按试剂盒说明书使用。

1.4 血浆NO的检测

南京聚力公司提供的NO检测试剂盒: 通过测定样品中硝酸盐的量来反映NO浓度的高低, 即用硝酸还原酶将样品中硝酸根离子还原为亚硝酸根离子, 进而在酸性条件下用Griess试剂与其反应显色, 用紫外分光光度计在540 nm波长下检测其消光值来反映NO的浓度, 同设空白管和标准管, 空白管调零。计算: NO μmol/L=样品消光值/标准管消光值×100。

1.5 NOS的检测

南京聚力公司提供的NOS检测试剂盒: NOS催化L-精氨酸生成NO, NO与二价铁配合物形成有色物, 在540 nm波长下检测其消光值即代表NOS活性。用L-精氨酸和二价铁配合物配制反应液, 现用现配。空白孔50 μl加双蒸水, 标本孔加50 μl血浆, 每孔加入150 μl反应液, 混匀后37℃水浴15 min, 立即在酶标仪上540 nm 波长处, 用空白管调零, 测定标本消光值。计算: NOS (U/ml)＝21.77×标本消光值。

1.6 统计方法

用SPSS软件对血浆TNF-α、NO和NOS水平进行双因素方差分析(ANOVA)做各因素的组间比较; 对各组做单因素方差分析, 方差齐时用LSD(最小显著差异法)、方差不齐时用Dunnett's T3法做各组间的多重比较。对各组TNF-α、NO和NOS水平做其随RPE的变化趋势图, 用抛物线方程(y=a+b1x+b2x2)拟合趋势线并对此方程做统计学检验[6]。

2 结果

2.1 Balb/c小鼠行为不对称分布模式

Balb/c小鼠共52只, 一只始终未伸爪取食, 被剔除实验。51只小鼠行为不对称大致呈U型分布, 极左和极右利小鼠较多。其中左利鼠23只, RPE在0-20分之间; 双利鼠9只, RPE在21-29分之间; 右利鼠19只, RPE在30-50分之间。左利鼠的RPE分主要在0-5分之间, 右利鼠主要在45-50分之间(图1)。39只小鼠三次测试的结果与终结果一致, 占78%, 余12只小鼠三次测试中均有两次结果与终结果一致, 即二次测试一致率达100%, 三次右利分相差不大, 不一致者多是徘徊在左利和双利, 双利和右利之间。由此可见伸爪取食法具有较高的可重复性, 稳定性高, 结果可信。本实验采用随机化的原则选用双利8只, 左利右利各16只用于血浆TNF-α、NO、NOS水平的检测。

图 1. Balb/c 小鼠RPE (right paw entry)分布

Fig. 1. Distribution of paw preference in the population of Balb/c female mice. Paw preference is represented as the RPE scores.

2.2 血浆TNF-α、NO、NOS水平

2.2.1 TNF-α水平

正常生理组血浆中即有较高水平的TNF-α。血浆TNF-α与脑不对称有关。双因素方差分析表明行为不对称效应有统计学意义(P=0.049), 行为不对称和LPS之间无交互作用, F (2,26)=0.379, P=0.688。单因素方差分析结果显示正常生理组左利、右利和双利小鼠间血浆TNF-α水平无差异。LPS注射后右利组和双利组TNF-α水平均无明显升高, 双利组(P=0.025)和右利组(P=0.019) TNF-α水平均高于左利组(表1),双利和右利组之间无差异。

表 1. 脑不对称Balb/c小鼠血浆TNF-α水平

Table 1. Plasma levels of TNF-α in right-pawed, left-pawed and ambidextrous Balb/c mice (pg/ml) (mean±SD)

Group	n	Normal	n	LPS	P*
Ambidextrous mice	4	915.0±111.6	4	954.0±92.0	0.025
Right-pawed mice	6	809.0±125.9	6	944.0±160.3	0.019
Left-pawed mice	6	831.0±113.4	6	770.0±47.8

*, compared among left-pawed, right-pawed and ambidextrous mice after LPS treatment.

2.2.2 NO水平

双因素方差分析结果表明血浆NO水平与脑不对称有关(P=0.001)。行为不对称和LPS之间无交互作用, F (2,23)=1.729, P=0.2。单因素方差分析结果显示正常生理组NO水平为双利组显著高于左利组(P=0.031), 双利组和右利组相比统计学上无显著性差异(P=0.080)。LPS注射后仅左利组NO水平的升高有统计学意义(P=0.019), LPS注射后NO水平为双利组显著高于右利组(P=0.002)和左利组(P=0.018) (表2、图2)。

表 2. 脑不对称Balb/c小鼠血浆NO水平

Table 2. NO levels of plasma in right-pawed,left-pawed and ambidextrous Balb/c mice (μmol/L) (mean±SD)

Group	n	Normal	P*	n	LPS	P**
Ambidextrous mice	4	87.6±43.0		4	85.3±9
Right-pawed mice	6	50.1±31.8	0.080	5	41.4±21.3	0.002
Left-pawed mice	5	37.7±10.7	0.031	6	58.5±13.0	0.018

*,compared between ambidextrous, right-pawed and left-pawed normal mice.

**, compared between ambidextrous, right-pawed and left-pawed mice after LPS treatment.

图 2. 血浆TNF-α, NO, NOS水平随右利分变化趋势图

Fig. 2. Correlations between plasma levels of TNF-α, NO, NOS and RPE scores. The shape of the curve describing this relation was similar to a parabola and best fitted by the quadratic curve equation y=a+b1x+b2x2. Coefficient of correlation for a non-liner regression is R2 and the curve estimation is better if R2 is more near to 1.

2.2.3 NOS水平

双因素方差分析结果表明血浆NOS水平与脑不对称有关(P=0.022)。行为不对称和LPS之间无交互作用, F (2,16)=2.095, P=0.156。单因素方差分析结果显示正常生理组各组间NOS水平无差异。LPS注射后脑不对称效应有意义(P=0.013), 但各组之间NOS水平差异不明显(表3)。

表 3. 脑不对称Balb/c小鼠血浆NOS水平

Table 3. NOS levels of plasma in right-pawed,left-pawed and ambidextrous Balb/c mice (U/mL) (mean±SD)

Group	n	Normal	n	LPS
Ambidextrous mice	3	3.30±1.64	3	5.68±2.52
Right-pawed mice	4	3.25±2.37	5	2.47±0.65
Left-pawed mice	3	2.81±0.78	4	2.34±0.29

2.3 脑不对称小鼠血浆TNF-α、NO和NOS水平随RPE的变化趋势

脑不对称小鼠血浆TNF-α、NO、NOS水平和RPE具有一定的相关关系(图2)。正常生理组及LPS刺激组血浆TNF-α、NO、NOS水平的变化均为双利>右利和左利(生理组NOS水平除外), 用抛物线方程拟合趋势线, 形成以双利分段(RPE为21-29)为高峰的弓形向上的曲线, 随RPE的增加或减少曲线向两侧延伸下降, RPE越偏离中心各因子的水平越低, 体现出一个血浆水平与RPE的效应关系, 对方程做统计学检验显示LPS刺激组NO水平随RPE的变化效应有意义(图2D), 其余各组均没有统计学意义。生理组NOS水平与RPE未形成明显的变化趋势, 这可能与样本量偏小有关。

3 讨论

通过伸爪取食实验可将小鼠群体分为左利、右利和双利, 不同种系的小鼠有着不同的行为不对称分布模式。C57BL/6J小鼠的分布模式呈U型, 即大多数小鼠是左利或右利, 仅有少数是双利[7]; C3H小鼠大致呈正态分布; NZB小鼠(自身免疫病模型鼠)及亚类则有多种分布模式。我们的实验结果显示Balb/c小鼠行为不对称分布模式大致呈U型, 左利和右利鼠占了近80%, 且极左和极右利小鼠较多, 左利鼠数量大致等于右利鼠。这表明小鼠行为不对称的分布模式可能与其遗传背景有关, 种系不同行为不对称分布模式亦可能不同。

机体在发育过程中形成了脑不对称, 使用物理或化学损毁脑核团和神经束路的方法研究中枢神经系统不同部位对免疫系统的作用结果表明, 不同脑区对免疫功能具有不同的调节作用[8], 一般认为, 左侧大脑承担正反馈免疫调节, 右侧为负反馈免疫调节[8]。在脑核团和束路损毁研究中发现, 切除左侧或右侧部分大脑额页皮层对单核巨噬细胞功能有影响[9]。单核巨噬细胞胞膜上分布有ACTH、生长激素、P物质等激素受体并受它们的调控, 影响其分泌IL-1、TNF-α、IL-6和NO等因子功能。而这些因子又是LPS刺激后有效刺激HPA轴的效应分子, 在神经免疫内分泌网络中具有重要的调节作用, 故现在认为HPA-Mo/MФ调节环路是神经免疫内分泌网络中一个重要部分。我室曾观察到LPS刺激后小鼠血浆IL-1β、IL-6和CS水平与脑不对称有关, 左利者受刺激后IL-1β呈大幅度、长时期升高, 双利鼠CS、IL-6均高, 同时左右大脑皮质IL-1β、IL-6和NO含量亦与脑不对称有关, 趋于双利>右利>左利[3,4]。小鼠腹腔巨噬细胞体外培养显示在LPS体内刺激、LPS先体内再体外刺激等情况下, 脑不对称小鼠分泌IL-1β、NO均存在差异, 两者水平均在双利组较高[10]。

本实验结果表明, LPS刺激后双利和右利小鼠TNF-α的水平均高于左利。本室以往的工作证实LPS刺激后Balb/c小鼠血中IL-1β水平为左利高于右利和双利, IL-6的水平为双利组高于右利和左利组[1,2], 表明脑不对称可能与单核/巨噬细胞产生细胞因子的功能有关。LPS刺激后左利、右利、双利小鼠细胞因子的含量不同, 说明行为不对称小鼠单核巨噬细胞的功能亦存在差异。

NO是一种自由基性质的无机分子, 在神经、免疫、心血管等多个系统中具有广泛而复杂的生理与病理作用[11], 经诱导活化的巨噬细胞可以产生大量的NO。本实验结果显示, 正常组和LPS刺激后血浆中NO和LPS刺激后NOS的水平均为双利高于右利和左利, 这表明脑不对称小鼠血浆NO和NOS的水平表现不一致, 这可能与脑不对称影响单核/巨噬细胞的功能有关。LPS刺激后左利小鼠NO水平升高幅度较双利组和右利组明显, 这表明脑不对称小鼠血浆NO对LPS的反应性不一样, 这可能与左利者免疫紊乱发生率高有关。

研究早期多采用脑皮层或核团损毁的方法观察脑不对称对免疫功能的影响效应。由于手术创伤本身是个应激因素且可引发机体一系列的复杂反应, 这可对所观察的指标产生一定的干扰。近期多采用行为不对称动物研究脑不对称对免疫系统的影响, 其中使用较多的为伸爪取食实验, 这种方法给每个动物一个右利分, 据此就能对脑不对称的程度进行定量的分析研究, 增加了客观性。本实验结果表明血浆TNF-α、NO和NOS水平均与脑不对称有关, 且与右利分有相关性, 其变化趋势多为双利大于右利和左利组, 形成一个以双利RPE为高峰的弓形向上曲线, 随RPE的增加或减少向两侧延伸下降, 各检测指标的含量与RPE分数有相关关系。本室研究发现左右侧大脑皮层IL-1、IL-6水平与RPE的关系亦呈一弓形向上的曲线(尚未发表资料), 与本实验结果呈一致性, 这表明脑不对称对各免疫指标的影响程度确实与脑不对称的程度有关, 随脑不对称程度的不同而对免疫功能影响的程度亦不同, 这就使研究者可以对脑不对称的程度进行定量的分析研究。

脑不对称可以影响HPA-Mo/MФ调节环路, 本室以往的工作表明, 脑不对称可以影响Balb/c小鼠血浆IL-1β、IL-6水平, 且左利、右利小鼠对LPS的反应性不同[4]。本实验结果也表明脑不对称可以影响血浆TNF-α和NO、NOS水平, 进一步证实了脑不对称可以影响单核巨噬细胞功能, 从理论上丰富了脑不对称影响HPA-Mo/MФ调节环路的理论知识。

参考文献

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