Received 2002-01-28 Accepted 2002-09-28

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30070290) and a grant from the Tenth-Five-Year Program of the Chinese People's Liberation Army (No.01MB109).

*Corresponding author. Tel: +86-23-68752340-8205; E-mail: liuliu@mail.tmmu.com.cn

生理学报, Dec. 2002, 54 (6): 519-524

Acta Physiologica Sinica

研究论文

缺氧对大鼠大脑皮质细胞色素氧化酶

亚基Ⅰ、Ⅳ表达协同性的影响

谭小玲, 柳君泽*, 曹利飞, 邓忠才, 李英和

第三军医大学高原军事医学系病理生理学与高原生理学教研室,

全军高原生理和高原病研究重点实验室, 重庆 400038

摘要: 本文探讨缺氧对细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase, COX, 即complex Ⅳ)的mtDNA和nDNA编码亚基Ⅰ、Ⅳ表达及其协同性的影响。实验用成年雄性Wistar大鼠随机分为对照组、缺氧2、5、15和30 d组。缺氧大鼠于低压舱内模拟海拔5000 m连续减压。对照组大鼠于舱外同时喂养(舱外海拔高度为300 m)。用半定量逆转录-PCR法测定大脑皮质COXⅠ、Ⅳ mRNA量, 用Western blot分析大脑皮质线粒体COXⅠ、Ⅳ蛋白量, 以两个亚基的蛋白量、 mRNA量的比值反映亚基表达的协同性。结果显示, 缺氧2、5 d, COXⅠ mRNA增加, 缺氧15、30 d时下降至对照水平。缺氧2、5和15 d时, COX Ⅳ mRNA显著增加, 缺氧30 d时降低, 与对照组差异非常显著。COX Ⅳ、Ⅰ mRNA比值在缺氧15 d时最高, 其它各缺氧组与对照组的差异无显著意义。各组COXⅠ、Ⅳ蛋白量及其比值均无显著差异。上述结果表明, 缺氧可影响COXⅠ、Ⅳ mRNA的表达及其协同性, 但对蛋白的表达及其协同性没有显著影响, 提示转录后调节是缺氧过程中线粒体内COXⅠ、Ⅳ蛋白表达协同的主要机制。

关键词: 细胞色素氧化酶; 基因表达; 大脑皮质; 大鼠; 缺氧

中图分类号: Q426

Effects of hypoxic exposure on coordinative expression of cytochrome oxidase subunitsⅠand Ⅳ in rat cerebral cortex

TAN Xiao-Ling, LIU Jun-Ze*, CAO Li-Fei, DENG Zhong-Cai, LI Ying-He

Department of Pathophysiology, College of High Altitude Military Medicine,

the Third Military Medical University, Chongqing 400038

Abstract: This study was intended to evaluate the effects of hypoxic exposure on gene expression and coordination of cytochrome oxidase (COX) subunitsⅠ (COX Ⅰ) and Ⅳ (COX Ⅳ) encoded by mtDNA and nDNA respectively in rat cerebral cortex. Male Wistar rats were exposed to hypoxia in a hypobaric chamber simulating high altitude at 5000 m for 2, 5, 15 and 30 d. Control rats were fed outside the hypobaric chamber (the height was 300 m above sea level). Rats were sacrificed and mitochondria from cerebral cortex were isolated by differential centrifugation at each time point. COXⅠand COX Ⅳ proteins in isolated rat cerebral cortex mitochondria were detected by Western blot analysis and mRNA in the cerebral cortex by RT-PCR. The ratios of protein and mRNA were used to estimate the coordinative expression of two subunits. The results showed that COXⅠ mRNA increased significantly at 2 and 5 d, and decreased to the control level at 15 and 30 d; COX Ⅳ mRNA remarkably increased at 2, 5 and 15 d, and dropped below the control level at 30 d. The mRNA ratio of COX Ⅳ to COXⅠ reached a peak at 15 d, but showed no differences between other time points. The Western blot analysis of COXⅠand COX Ⅳ in isolated rat cerebral cortex mitochondria showed no obvious changes during hypoxic exposure. Our findings demonstrate that hypoxia can affect mRNA expression of COX Ⅰand COX Ⅳ and their coordination, while protein expression of both subunits are stable and coordinative. This study suggests that the expression of COX Ⅰand COX Ⅳ proteins during hypoxic exposure is coordinately regulated by posttranscriptional mechanisms.

Key words: cytochrome oxidase; gene expression; cerebral cortex; rat; hypoxia

线粒体是哺乳动物细胞质中唯一含有遗传物质--线粒体DNA (mtDNA)的细胞器, 其编码基因的表达受核DNA (nDNA)编码的酶和蛋白因子的影响。mtDNA编码的13条多肽都是与线粒体氧化磷酸化有关的酶蛋白, 而呼吸链中的多亚基酶复合体均由mtDNA和nDNA上基因编码的蛋白产物共同组成, 因此编码呼吸链中多亚基酶复合体各亚基的mtDNA和nDNA上基因的表达及其协同性对维持线粒体的正常结构与功能十分重要。我们以往的研究表明, 急性和慢性缺氧对mtDNA整体转录和蛋白翻译有不同程度的抑制, 那么就某一具体的呼吸链酶复合体而言, mtDNA和nDNA编码各亚基的表达是如何相互协调、相互匹配形成完整的复合体的？细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase, COX, 即complex Ⅳ)是线粒体氧化呼吸的限速酶, 直接参与线粒体氧的利用和能量产生。哺乳动物的COX由13个亚基组成, COXⅠ和Ⅳ是分别由mtDNA和nDNA 编码的两个最大的亚基, 与COX活性密切相关, 因此COX是研究mtDNA-nDNA表达协同性的理想模型[1]。

本研究通过观察缺氧过程中大鼠大脑皮质线粒体COXⅠ和Ⅳ的基因表达状况, 揭示缺氧对mtDNA 和nDNA编码COX亚基表达协同性的影响, 初步探讨缺氧过程中COX亚基表达的可能调节机制和mtDNA-nDNA表达协同性变化的分子机制, 为进一步认识mtDNA-nDNA表达协同性及其相互作用与能量代谢的关系提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

小鼠抗人COXⅠ、抗牛COXⅣ单克隆抗体(Molecular Probe); 碱性磷酸酶标记的马抗小鼠IgG(北京中山公司); 其它试剂及聚偏二氟乙烯(PVDF)膜等购自上海生工生物工程公司。

1.2 实验动物与分组

成年雄性Wistar大鼠(180-250 g, 第三军医大学实验动物中心提供), 随机分为对照组、缺氧2、 5、 15和30 d组。缺氧大鼠于低压舱内模拟海拔5000 m高原, 23 h/d (每天放回舱外1 h打扫卫生及喂食)连续减压, 于模拟海拔 4000 m高原低压舱内采集标本。对照组大鼠于舱外同时喂养和采集标本(舱外海拔高度为300 m)。

1.3 实验方法

1.3.1 大脑皮质线粒体的提取

采用本实验室建立的方法[2]。线粒体蛋白质测定采用Lowry's法。

1.3.2 COXⅠ和Ⅳ mRNA的半定量RTPCR分析

每组6只大鼠, 对每只大鼠单独进行分析。按Tripure试剂使用说明提取组织总RNA。在20 μl逆转录反应体系中, 加入RNA 4 μg, COXⅠreverse primer (5'GCTTCGGAAACTGACTTGTACC3')和oligo (dT)18 各20 pmol, 按逆转录酶使用说明进行逆转录反应, 同时设立阴性对照。以βactin为内对照对逆转录cDNA进行PCR扩增。在50 μl反应体系中, 加入cDNA 1 μl, βactin引物对(5'CCTAGCACCATGAAGATCAA3'和5'AGCCATGCCAAATGTCTCAT3')各10 pmol, 目的基因COXⅠforward primer (5'GCTGCTAATACTGGCAGTGAGA3')和COXⅣ引物对(5'CTTATGTTGATCGGCGTGACTACC3'和5'CATGGACCATTGGACACAGC3')各10 pmol, 于95℃变性5 min后, 95℃ 60 s、 52℃ 60 s、 72℃ 60 s (COXⅠ), 95℃ 60 s、 50℃ 60 s、 72℃ 60 s (COXⅣ) 各30循环, 分别扩增出243 bp (βactin)、 381 bp (COXⅠ)和474 bp (COXⅣ)片段。对扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳, 以目的片段与内对照的扫描积分光密度值之比反映各目的片段 mRNA量的相对高低。

1.3.3 线粒体COXⅠ和Ⅳ蛋白免疫杂交分析[3]

对照组、缺氧2、 5、 15和30 d组的大鼠分别为5、 6、 9、 8和9只, 对每只大鼠单独进行分析。

40 μg线粒体蛋白与变性缓冲液 (50 mmol/L Tris·HCl, pH 6.8, 2% SDS, 2 mmol/L EDTA, pH 7.0, 1% β巯基乙醇, 10%甘油, 0.03%溴酚蓝, 8 mol/L 尿素)混合, 100℃加热7 min、冰上冷却后行尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(4%浓缩胶、 13%分离胶, 尿素8 mol/L)。然后电转移至PVDF膜, 转印膜经含1% BSA的PBS 4℃封闭过夜, 依次与COXⅠ、 COXⅣ单克隆抗体混合液 (使用浓度分别为2和0.2 μg/ml)、碱性磷酸酶标记的马抗小鼠IgG杂交, 常规显色、拍照。对转印膜行薄层密度扫描, 记录相应条带的透射光积分光密度(IOD)。

1.4统计学处理

所有数据均以mean±SD表示; 采用SPSS10.0统计软件的单因素方差分析, 各组均值的多重比较采用NK法。

2结果

2.1 缺氧过程中大鼠大脑皮质COXⅠ、 Ⅳ mRNA量

缺氧2 和5 d时, COXⅠ mRNA量增加, 与对照组差异有非常显著意义(P<0.01); 缺氧15和30 d时下降, 与对照组差异无显著意义(图1、3)。缺氧2、 5和15 d时, COX Ⅳ mRNA量增加, 与对照组差异有非常显著意义(P<0.01), 而三组间差异无显著意义; 缺氧30 d时, COX Ⅳ mRNA量降低,与对照组以及其它各组的差异均具有非常显著意义(P<0.01)(图2、3)。COX Ⅳ、 Ⅰ mRNA比值在缺氧2 和5 d时, 略有下降, 但与对照组差异无显著意义; 缺氧15 d时比值升高, 与对照组、缺氧2 d、 5 d组差异均具有非常显著意义(P<0.01); 缺氧30 d与缺氧15 d比较, 比值降低, 差异具有显著意义(P<0.01), 但与对照组差异无显著意义(图3)。

图1. 不同缺氧时间大鼠大脑皮质COX Ⅰ mRNA RTPCR扩增产物电泳结果

Fig. 1.Electrophoresis results of COX Ⅰ mRNA RTPCR in rat cerebral cortex according to different hypoxic exposure time. A, B, C, D and E stand for control, 2, 5, 15 and 30 d, respectively.

F stands for molecular weight marker.

图2. 不同缺氧时间大鼠大脑皮质 COX Ⅳ mRNA RTPCR扩增产物电泳结果

Fig. 2.Electrophoresis results of COX Ⅳ mRNA RTPCR in rat cerebral cortex according to different hypoxic exposure time. A, B, C, D and E stand for control, 2, 5, 15 and 30 d, respectively. F stands for molecular weight marker.

图3. 缺氧过程中大鼠大脑皮质COXⅠ、 Ⅳ mRNA量及其比值

Fig. 3.mRNA and mRNA ratio of COX Ⅰ and COX Ⅳ in rat cerebral cortex during hypoxic exposure. Data are presented as mean±SD, n=6. *Ｐ<0.05 vs control,**P<0.01 vs control, P<0.01 vs 2 d, P<0.01 vs 5 d, #P<0.01 vs 15 d.

2.2 缺氧过程中大鼠大脑皮质线粒体内COX亚基蛋白含量

缺氧过程中, 大鼠大脑皮质线粒体COXⅠ、 Ⅳ蛋白含量(图4、 5)及Ⅳ/Ⅰ蛋白比值(图6)均无明显改变, 各组与对照组差异无显著意义, 组间差别无统计学意义。

图4. 缺氧过程中大鼠大脑皮质线粒体COXⅠ、 Ⅳ的Western Blot 显色结果

Fig. 4.Western blot analysis results of COX Ⅰ and Ⅳ in isolated rat cerebral cortex mitochondria during hypoxic exposure. A stands for molecular weight marker.

B, C, D, E and F stand for control, 2, 5, 15 and 30 d, respectively.

图5. 缺氧过程中大鼠大脑皮质线粒体COX亚基Ⅰ、 Ⅳ蛋白含量

Fig. 5.Protein contents of COX Ⅰ and Ⅳ in isolated rat cerebral cortex mitochondria during hypoxic exposure. Data are presented as mean±SD.

图6. 缺氧过程中大鼠大脑皮质线粒体COX亚基Ⅳ和Ⅰ蛋白比值

Fig. 6.Protein ratio of COX Ⅳ to Ⅰ in isolated rat cerebral cortex mitochondria during hypoxic exposure. Data are presented as mean±SD.

3 讨论

国内外有关缺氧条件下COX亚基基因表达变化的研究不多, 且研究结果因实验条件、动物种类或组织来源不同而有差异。缺氧(1% O2)培养的HepG2肝癌细胞, COXⅡ mRNA下降[4]。海龟在无氧条件下(100% N2)生存1 h, 心肌COXⅠ及nDNA编码的Nad5(NADHubiquinone ixidoreductase subunit 5) mRNA明显增加, 分别达到常氧对照的4.5和3.0倍, 复氧20 h后Nad5 mRNA 量下降到常氧对照水平, 而COXⅠ mRNA 量仍显著低于常氧对照水平。说明mtDNA和nDNA转录对缺氧、复氧的反应机制不同; 在海龟脑组织, 无氧20 h后, COXⅠ mRNA量较常氧对照增加1.5倍, 而Nad5 mRNA 量无显著变化, 说明缺氧对mtDNA和nDNA表达的影响有组织差异[5]。

实验发现, 缺氧2 和5 d时, COXⅠ、 Ⅳ的 mRNA量增加, 当延长缺氧暴露时间, 两个亚基 mRNA量的变化不同, COXⅠ mRNA量在缺氧15和30 d时下降到对照水平, 而COXⅣ的 mRNA量在缺氧15 d时仍维持较高的水平, 到缺氧30 d时下降并低于对照。表明缺氧条件下两种亚基 mRNA量变化的调节机制不同。

COXⅠ mRNA的变化可能与mtDNA整体转录水平的变化有关。哺乳动物mtDNA 的两条链同时转录, 各形成一个转录本, 进而经进一步剪切加工形成多个单一的 mRNA。目前已发现多种nDNA编码的转录因子参与调节mtDNA转录活性。而我们以往的研究表明, 急性缺氧时离体线粒体的转录活性是降低的, 慢性缺氧较急性缺氧时活性虽有所回升, 但仍未达到对照水平[2]。这提示, 缺氧时某些转录因子表达的增加可能调节mtDNA整体转录; 线粒体前体 mRNA的加工, 包括tRNA切除、 mRNA5'和3'末端加工等是形成有翻译活性的mRNA及有结合和运载功能的tRNA的必需过程, 同时对维持 mRNA的稳定十分重要[1]。用KCl处理原代培养的神经元发现, COXⅡ mRNA的半衰期不变, 而COXⅣ mRNA半衰期由82 min延长到102 min[6]。提示, 缺氧过程中大脑皮质COXⅠ mRNA量的改变可能与转录后加工及 mRNA的稳定性调节有关。

进一步实验发现, 缺氧时在COX Ⅰ和Ⅳ mRNA量变化的同时, 并不伴有线粒体内相应蛋白含量的变化, 说明COXⅠ和 Ⅳ 蛋白含量与相应mRNA量之间没有直接关系, 推测转录后或翻译后调节机制参与了线粒体内COX亚基Ⅰ和Ⅳ蛋白含量的精细调整。一方面 mRNA翻译活性的改变可影响蛋白的合成。缺氧条件下海龟肝、肾组织中有翻译活性的 mRNA种类及数量发生改变, 提示整体翻译功能的改变可能与COX亚基蛋白量的调整有关[7]; 我们以往的研究也表明, 急性缺氧时离体大鼠大脑皮质线粒体的翻译活性降低, 慢性缺氧时活性恢复到对照组水平[8]。另一方面蛋白质的稳定性也可影响线粒体内相应蛋白含量。研究表明, 线粒体内未组装的COX蛋白亚基分解速率增加。由于COX Ⅳ合成是在线粒体外进行的, 然后转运到线粒体内与其它亚基组装成完整的COX全酶, 因此线粒体内COX Ⅳ蛋白量是亚基转录、翻译、线粒体蛋白转运及蛋白稳定性调节共同作用的结果。研究缺氧条件下COX Ⅳ亚基转运效率的变化, 有助于进一步深入认识COX亚基蛋白稳定的机制及意义。目前已发现了线粒体内的多种蛋白水解酶, 它们不仅参与nDNA编码蛋白向线粒体及mtDNA编码蛋白向内膜、膜间腔的转运过程, 而且与线粒体蛋白生物合成及半衰期调节有关[1]。

COX 是由mtDNA和nDNA共同编码的13条亚基在线粒体内膜上以等比例组装而成, 因此mtDNAnDNA表达的相互协调是形成有功能的COX全酶的重要条件。而COX在能量产生及调节中的重要地位, 也使之成为研究mtDNAnDNA表达协同性的理想模型。缺氧条件下mtDNAnDNA表达协同性的研究未见报道。我们通过观察缺氧过程中大鼠大脑皮质COXⅣ、 Ⅰ亚基的 mRNA比值及线粒体内两亚基的蛋白比值来反映mtDNAnDNA表达在转录及蛋白水平上的协同性。实验表明, 缺氧过程中COXⅣ/COXⅠ的 mRNA比值在缺氧15 d显著高于对照组, 这种失调源于COXⅣ mRNA的相对增加, 这可能是nDNA和mtDNA转录对缺氧的反应有时空差异的缘故。而线粒体内COXⅣ/COXⅠ的蛋白比值没有显著变化, 说明mtDNAnDNA表达在COXⅠ、 Ⅳ的蛋白水平上是协调的。基因表达协同性在 mRNA和蛋白水平上的不一致, 说明转录后调节是线粒体内COXⅠ和COXⅣ蛋白量协调的主要机制。研究发现一些nDNA编码的蛋白因子对COX的核及线粒体编码基因表达及稳定性都具有调节作用, 它们对这两个编码系统的“平行”调节可能与mtDNAnDNA协调表达有关[1]。缺氧条件下这些蛋白因子的表达、运输及作用有待进一步的研究。另外, 蛋白水平上mtDNA和nDNA编码亚基的协调对于形成有功能的COX有重要意义, 提示缺氧条件下两个编码系统基因表达在时间、空间的不同改变, 可能通过它们特异的和共通的调节过程, 最终归于蛋白水平上的协调, 这对于机体在缺氧环境下的能量代谢有特殊意义。

参考文献

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