Received 2002-04-17 Accepted 2002-07-01

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30170355, 30200090)

*Corresponding author. Tel: +86-29-3374802; E-mail: zhanglf@fmmu.edu.cn

生理学报, Dec. 2002, 54 (6): 525-530

Acta Physiologica Sinica

研究论文

四周模拟失重大鼠后身动脉平滑肌细胞钾电流的改变

付兆君, 程宏伟, 张立藩*, 马进

第四军医大学航空航天生理学教研室, 西安 710032

摘要: 本文采用全细胞膜片钳方法观察4周尾部悬吊大鼠 (tail-suspended rats, SUS)隐动脉及肠系膜前动脉第2-6级动脉分支血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cells, VSMCs)钾电流密度的变化。结果表明: SUS大鼠后身动脉VSMCs的静息电位 (RP)较对照大鼠 (CON)后身动脉VSMCs 的RP更负。SUS组隐动脉和肠系膜小动脉VSMCs的全细胞钾电流密度较CON组显著增加。其中, SUS组的隐动脉和肠系膜小动脉VSMCs的大电导钙激活钾离子通道 (BKCa)和电压激活钾离子通道 (KV)电流密度较CON组的BKCa和KV电流密度均显著增加。以上结果提示, VSMCs的超极化及进一步引起的通过电压依赖性钙离子通道的钙内流减少可能是模拟失重引起后身动脉反应性降低的电生理机制之一。

关键词: 模拟失重; 膜片钳; 钾离子通道; 血管平滑肌

中图分类号: Q463; R852.22

Changes in potassium currents of vascular smooth muscle cells isolated from hindquarter arteries of rats after 4 weeks simulated weightlessness

FU Zhao-Jun, CHENG Hong-Wei, ZHANG Li-Fan*, MA Jin

Department of Aerospace Physiology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032

Abstract: The changes in potassium currents of vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from saphenous arteries and the 2nd-6th order branches of the mesenteric arteries of 4-week tail-suspended rats (SUS) were examined using whole cell patch clamp technique.The resting potential (RP) of the VSMCs from SUS group was more negative compared with that of the control group (CON).The whole cell potassium current densities of VSMCs isolated from the saphenous arteries and small mesenteric arteries in SUS group were significantly larger than those of the CON group.The BKCa and KV current densities of VSMCs from saphenous arteries and small mesenteric arteries from SUS group were also significantly larger than those from the CON group.It is speculated that the hyperpolarization of VSMCs and decreased calcium influx through voltage-dependent calcium channels might be one of the electrophysiological mechanisms involved in the depressed vasoreactivity of hindquarter arteries induced by simulated weightlessness.

Key words: weightlessness simulation; patch-clamp techniques; potassium channels; vascular smooth muscle

钾离子通道在调节血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cells, VSMCs)的膜电位中具有重要作用。膜电位不仅可通过电压依赖性钙离子通道影响动脉VSMCs的收缩功能, 还可以通过影响三磷酸肌醇 (IP3)诱发的内储钙释放和影响收缩机构对钙的敏感性而影响其收缩性[1]。钾离子通道又是许多血管活性物质的作用靶点。因此钾离子通道在血管紧张度的维持和血管功能调节中起着重要作用[1, 2]。Delp等[3]及马进等[4, 5]的研究表明, 模拟失重大鼠的后身动脉对血管收缩物质的反应性普遍减弱。我们推测钾离子通道的改变可能是模拟失重大鼠后身动脉收缩反应性降低的原因之一。本实验旨在测定 4周模拟失重大鼠血管平滑肌细胞钾离子通道电流的改变, 包括测定大电导钙激活钾离子通道 (BKCa)及电压激活钾离子通道 (KV)的电流, 以从电生理学角度探讨模拟失重大鼠后身动脉收缩反应性降低的机制。

1 材料和方法

1.1 模拟失重大鼠模型

采用改进的尾部悬吊大鼠模型模拟失重的生理影响[6]。雄性Sprague-Dawley大鼠 (体重180-220 g, 第四军医大学实验动物中心提供)20只。动物在本实验室专门的动物室内适应性饲养1周后, 按体重配对原则随机分为对照组 (control rats, CON)与悬吊组 (tail-suspended rats, SUS)各10只。每周称体重。尾部悬吊按文献方法进行[6]。动物在悬吊期间, 始终保持－30°头低位及后肢悬垂不荷重的状态。室温保持在23±2℃。人工控制动物室内照明, 每昼夜均保持12 h光照与黑暗的循环交替。悬吊4周后进行实验。

1.2血管平滑肌细胞的分离

以戊巴比妥钠 (40-50 mg/kg bw)腹腔内注射麻醉。取出两侧隐动脉自股动脉分出处向下2-3 cm长的一段[直径: 380.0±78.3 μm (mean± SD), n=18]及肠系膜前动脉支配的全段肠系膜, 置于4℃的生理盐溶液中暂时存放。生理盐溶液成分(mmol/L)[2]: NaCl 137, KCl 5.6, MgCl2 1.0, Na2HPO4 0.42, NaH2PO4 0.44, NaHCO3 4.2, HEPES 10, 硝普钠 30 μmol/L, 通以95% O2和5% CO2的混合气体, pH值7.4。解剖大鼠左侧比目鱼肌及腓肠肌并称其湿重。将隐动脉及肠系膜转移到装有分离液的培养皿中。该分离液成分为加入1 mg/ml牛血清白蛋白的生理盐溶液。在解剖显微镜下去除动脉周围结缔组织及脂肪, 并将隐动脉和肠系膜前动脉2-6级分支[直径: 250.6±45.7 μm (mean± SD), n=16]剪成约1 mm长的小段。将小动脉段分别转移到两个装有1 ml分离液及4 mg木瓜蛋白酶 (Papain, 德国BIB)、2 mg二硫代苏糖醇 (DTT, 美国Amresco)的试管中。置于36.9℃的水浴中温育 (隐动脉33 min, 肠系膜动脉25 min)。温育完成后经洗脱和吹打分离VSMCs。细胞悬液在室温 (18-23 ℃)下可放置6 h, 在4℃冰箱中可放置12 h, 仍保持活性。

1.3 电生理学记录

实验采用全细胞膜片钳记录模式。全细胞记录状态形成后, 运行pClamp软件 (8.0.2.114, 美国Axon Instruments)的膜测试功能记录细胞膜电容 (电压钳模式, 滤波2 kHz, 保持电位－30 mV, 去极化至+20 mV)。接入电阻 (Ra)小于20 MΩ则表明破膜完全。保存膜测试结果, 随后以膜片钳放大器 (CEZ-2300, 日本Nihon Kohden)上的慢电容补偿旋钮进行膜电容补偿。记录膜电位的方法是在电流钳制模式下给予0 nA钳制, 此时记录的电位即静息电位 (resting potential, RP)。

记录钾电流时, 保持电位－70 mV, 去极化至－60-+60 mV, 每次递增10 mV。每个刺激持续2 s, 刺激间隔10 s。首先记录全部钾电流, 再换入含有1 mmol/L TEA-Cl (tetraethylammonium chloride, 以下用缩写TEA, 美国Sigma)的灌流液, 并于换液结束后第3、5及10 min各重复记录一次钾电流。最后再换入含有1 mmol/L TEA+3 mmol/L 4-AP (4-aminopyridine, 美国Sigma)的灌流液, 同样于换液后第3、5、10 min各重复记录一次钾电流, 此时减少的电流即为对3 mmol/L 4-AP敏感的KV电流。测量电流时取刺激时程最后400 ms的电流均值, 并将各次重复测试所得的电流值平均。通过电流相减依次得到BKCa电流及KV电流。电流密度的计算方法为电流值÷细胞膜电容, 单位pA/pF。

整个实验过程中, 所有灌流液均通以100% O2 , 以2 ml/min的流量持续灌流小槽内细胞。灌流液成分 (mmol/L)[2]: NaCl 135, KCl 4, MgCl2 1, CaCl2 2, HEPES 10, 葡萄糖 10; 以NaOH调节pH值到 7.4。电极内液成分 (mmol/L)[2]: KCl 143, MgCl2 1, EGTA 0.5, HEPES 10; 以KOH调节pH值到 7.2。

1.4 统计处理

对电流密度数据进行单向方差分析检验, 比较SUS与CON两组间是否具有显著差异。体重及比目鱼肌、腓肠肌湿重数据采用配对t检验分析。实验数据均以means±SE表示, 取P<0.05作为差异显著的水平。

2 结果

SUS大鼠左侧比目鱼肌及腓肠肌4周模拟失重后的湿重分别为42±3与1458±26 mg, 较对照组 (分别为144±6 及1990±32 mg)均显著降低(P<0.01, n分别为8和7), 表明4周SUS大鼠已出现典型的模拟失重效应[6]。SUS及CON大鼠4周模拟失重后体重分别为363±8 及371±11 g, 无显著差异(P>0.05, n=10)

2.1 动脉血管平滑肌细胞外向电流的特性

新分离大鼠VSMCs呈梭形, 来自直径较大的隐动脉的VSMCs直径、长度均较来自肠系膜动脉的VSMCs大。全细胞电流中包括具有明显波动的BKCa电流及KV电流(图1A)。加入1 mmol/L TEA, 总的外向电流也明显降低, 减少的电流在高刺激电位下具有明显的波动 (图1B), 这是BKCa电流的特征[7, 8]。加入TEA不影响实验中同时记录的RP, 表明1 mmol/L TEA尚未阻断KV 。加入1 mmol/L TEA后剩余的电流呈明显的随时间衰减的特性, 表明该剩余电流是以KV为主。在1 mmol/L TEA存在的基础上, 在灌流液中再加入3 mmol/L 4-AP, 则电流更进一步降低, 并且电流随时间衰减的特性消失, 膜电位去极化(图1C)。这种对3 mmol/L 4-AP敏感的电流在膜电位附近即已被激活 (图1D, 2Ac, 2Bc), 根据其电流特性, 可知其为KV电流[7, 8] 。

图 1. 对照大鼠肠系膜小动脉一个平滑肌细胞的钾电流及TEA和4-AP的阻断作用

Fig. 1. Potassium currents of a VSMC from a small mesenteric artery of a control rat, showing the blocking effects of tetraethylammonium chloride and 4-aminopyridine.

2.2 模拟失重对血管平滑肌细胞静息电位和膜电容的影响

SUS大鼠后身动脉VSMCs的RP (隐动脉, －41.5±1.6 mV, n=19; 肠系膜动脉, －40.9±1.3 mV, n=18)较CON大鼠 (隐动脉, －36.7±1.2 mV, n=19; 肠系膜动脉, －35.3±1.4 mV, n=18)呈更负的电位, 两者间的差异均显著(P<0.05)。这些RP数值与Jackson等[2]在大鼠提睾肌中微动脉VSMCs上记录的数值接近。

隐动脉VSMCs膜电容在SUS组和CON组间未见显著差异(CON, 31.9±1.9 pF, n=19; SUS, 30.2±1.9 pF, n=18; P>0.05); 肠系膜小动脉VSMCs膜电容在SUS组和CON组间亦未见显著差异 (CON, 20.1±1.9 pF, n=18; SUS, 23.7±1.3 pF, n=14; P>0.05)。其中肠系膜小动脉VSMCs膜电容与Jackson等[2]在大鼠提睾肌中微动脉VSMCs上记录的膜电容数值接近(18±0.6 pF)。由于细胞膜电容与膜面积成正比, 以上结果从某种程度上间接反映了后身动脉VSMCs的细胞体积在模拟失重后未发生改变。

2.3 模拟失重对大鼠后身血管平滑肌细胞钾电流的影响

SUS组隐动脉和肠系膜小动脉的全细胞钾电流密度较CON组显著增加(ANOVA主效应, P< 0.01)。SUS组BKCa和KV电流密度较CON组亦显著增加(ANOVA主效应均为P<0.01), 见表1和图2。

图 2. 模拟失重对大鼠隐动脉VSMCs (A) 和肠系膜小动脉VSMCs (B)钾电流密度的影响

Fig. 2. Effect of simulated weightlessness on potassium channel current densities of VSMCs isolated from saphenous arteries (A) and small mensenteric arteries (B). Vertical bars represent 1 SE. *P<0.05 between groups, ANOVA.

表 1. 4周模拟失重对大鼠后身动脉VSMCs钾离子通道电流密度的影响

Table 1. Effect of 4-week simulated weightlessness on potassium current densities of VSMCs isolated from hindquarter arteries

		Total current density (pA/pF)	BKCa current density (pA/pF)	KV current density (pA/pF)
Saphenous arteries	CON	3.98±0.44 (10)	1.42±0.24 (9)	0.94±0.20 (9)
	SUS	6.38±0.44 (10)*	2.32±0.40 (9)*	1. 97±0.32 (8)*
Small mesenteric arteries	CON	7.70±1.07 (10)	2.38±0.52 (8)	2.70±0.30 (6)
	SUS	8.92±0.86 (10)*	3.14±0.41 (8)*	3.11±0.64 (8)*

Data are expressed as means±SE; numbers in brackets are numbers of VSMCs measured. All data showed are under the condition of +20 mV stimulus. CON, control; SUS, tail-suspended rats. *P<0.05 vs CON.

3 讨论

本工作主要发现, 4周SUS大鼠后身动脉VSMCs较CON大鼠VSMCs具有更负的静息电位; SUS大鼠的隐动脉和肠系膜小动脉VSMCs全细胞总钾电流密度, 以及BKCa 、KV电流密度均较CON VSMCs显著增加; 但两组VSMCs细胞的膜电容未见显著差别。

VSMCs细胞上表达有多种钾离子通道[1, 2], 包括电压激活钾离子通道 (KV)、钙激活钾离子通道(KCa)、内向整流钾离子通道 (KIR)及ATP敏感钾离子通道(KATP)等。前两者在数量上要远多于后两者。其中KV在RP附近即已经部分激活, 该通道在调节膜电位中起着重要作用。另一个比较重要的钾离子通道是KCa 。它既对膜电位敏感, 也对细胞内游离钙离子浓度敏感。由于KCa的这种特性, 它在VSMCs收缩而胞内游离钙离子浓度升高时开放增强, 此时钾离子外流导致膜复极化, 以减少钙离子的进一步内流。通过这种负反馈调节可防止重要器官小动脉痉挛。本实验中VSMCs上没有观察到快钠电流, 这与Quignard等[9]的结果一致。而钙离子通道亦会在持续时间长达2 s的刺激末段完全失活。所以在记录钾电流过程中, 可以不考虑钠、钙电流的影响, 而使用含钠、钙离子的灌流液灌流细胞。这样可以使VSMCs保持正常生理状态。

4-AP是特异性很强的KV的阻断剂, 它是一种透膜离子, 在VSMCs它只阻断KV[10] 。相对地, TEA的阻断作用要广泛的多, 在高浓度下, 几乎可以阻断所有类型的钾离子通道。但在浓度<1 mmol/L时主要阻断BKCa[11, 12]。本实验中, 我们采用加入不同通道阻断剂的方法, 分离出外向钾电流的两种成分, 即对1 mmol/L TEA敏感的BKCa电流及对3 mmol/L 4-AP敏感的KV电流。加入两种阻断剂后剩余的电流可能包括线性漏电流、KIR电流和KATP电流等。

航天飞行后, 航天员普遍会出现心血管失调现象, 它可能影响航天员返回地面时的安全、着陆后应急离舱能力及返回后对1 G重力环境的再适应[13]。飞行后心血管失调的表现之一为立位耐力降低。目前认为, 立位耐力降低的发生涉及多重机制, 而非单一因素能圆满解释。由于外周血管阻力在血压调节中的重要作用, 人们越来越关注动脉血管在失重或模拟失重中的变化[5,13,14]。Delp等[3]及马进等[4, 5]的研究表明, 模拟失重大鼠后身动脉对血管激动剂的反应性普遍减弱。但目前这种血管收缩反应性改变的机制尚不明了。动脉的反应性涉及很多因素, 包括收缩物质数量、离子通道功能及收缩装置对钙的敏感性等[1, 3-5]。通过细胞膜上电压依赖性钙离子通道 (PDC)的钙内流是起动VSMCs收缩的重要机制之一, PDC主要受膜电位的调节[1,2,15]。本实验中我们观察到: 4周模拟失重大鼠后身隐动脉及肠系膜小动脉VSMCs上KV及BKCa电流密度均显著增大, 并导致了RP超极化。该超极化将导致通过PDC的钙内流减少, 细胞内钙离子浓度降低, 导致动脉收缩反应性降低。本实验结果能部分解释Delp等及马进等的实验结果。另外, Krick等[16]发现, 钾离子通道功能的升高引起的细胞内钾离子外流可导致肺动脉平滑肌细胞凋亡。由于本实验证实模拟失重过程中大鼠后身动脉VSMCs钾离子通道功能增加, 因此钾离子通道功能的升高可能也是引起模拟失重大鼠后身动脉结构重塑[5,14]的一个重要机制。但关于模拟失重过程中大鼠后身动脉VSMCs钾离子通道功能增加与血管壁结构重塑间的关系尚需进一步阐明。

本实验选择的动脉之一是肠系膜前动脉穿入肠系膜后第2-6级分支, 外径 <300 μm, 属于阻力动脉。它在调节外周血管阻力中起着重要作用, 其收缩反应性的改变必然会影响到体位改变时动脉血压的调节。

总之, 本工作首次报道中期的模拟失重可导致后身动脉VSMCs膜上BKCa和KV电流密度增加, 并导致VSMCs超极化; 我们推测VSMCs的超极化及通过电压依赖性钙离子通道的钙内流减少可能是模拟失重引起的血管反应性降低的电生理机制之一。但这种全细胞钾电流的增加是通道数量增加所致抑或是单个通道功能发生了改变还有待进一步阐明。

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