Received 2002-04-10 Accepted 2002-08-06
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30070640).
*Corresponding author. Tel/Fax: +86-351-7011895; E-mail: zqmeng@sxu.edu.cn
生理学报, Dec. 2002, 54 (6): 539-543
Acta Physiologica Sinica
研究论文
硫酸镁对大鼠海马CA1区神经元钠电流的抑制作用
桑 楠, 孟紫强*
山西大学环境医学与毒理学研究所, 太原 030006
摘 要: 利用全细胞膜片钳技术研究了硫酸镁 (MgSO4) 对大鼠海马CA1区神经元钠电流的影响。结果表明, MgSO4可浓度依赖和电压依赖地抑制钠电流, 半数抑制浓度为4.05 mmol/L。这一抑制作用与刺激频率无关。结果还表明, 4 mmol/L MgSO4不影响钠电流的失活过程, 却使半数激活电压由-55.8±6.8 mV变为 -34.2±6.2 mV (n=8, P<0.01), 而激活曲线的斜率因子不变。结果提示, MgSO4抑制大鼠海马CA1区神经元的钠电流可能是其抗缺血缺氧造成的中枢神经系统损伤的机制之一。
关键词: 海马CA1区神经元; 全细胞膜片钳技术; 硫酸镁 (MgSO4); 钠电流
中图分类号: Q424
Inhibition
of sodium currents in acutely isolated hippocampal CA1 neurons of rats by magnesium sulfate
SANG Nan, MENG Zi-Qiang*
Institute of Environmental Medicine and Toxicology, Shanxi University, Taiyuan 030006
Abstract: The effects of magnesium sulfate (MgSO4) on sodium currents (Na+ currents) were studied in freshly dissociated hippocampal CA1 neurons of rat using the whole-cell patch-clamp technique. The results indicated that MgSO4 caused a concentration-dependent and voltage-dependent decrease in Na+ currents. The half-inhibitory concentration (IC50) was 4.05 mmol/L. This action was frequency-independent. The results also showed that 4 mmol/L MgSO4 shifted the steady state activation curve of Na+ currents towards positive potential (control Vh=-55.8±6.8 mV, MgSO4 Vh=-34.2±6.2 mV, n=8, P<0.01) without changing the slope factor. However, the steady state inactivation curve was not affected. These results suggest that blockade of Na+ currents by MgSO4 might be an interpretation for its neuroprotection against damages induced by ischemia and oxygen deprivation.
Key words: hippocampus; CA1 neuron; patch-clamp technique; magnesium sulfate (MgSO4); Na+ current
镁是人体必需的元素之一, 它参与生命活动的重要方面, 是细胞新陈代谢中各种酶系统的重要活化剂, 涉及葡萄糖利用, 脂肪、蛋白质及核酸合成, ATP代谢, 肌肉收缩及某些膜运输等过程, 对维持人体正常生理功能具有重要作用。临床观察和试验研究表明, MgSO4对缺血缺氧造成的中枢神经系统损伤具有保护作用, 并能减缓由损伤所引发的功能紊乱[1-4], 其作用机制可能涉及降低受损神经元兴奋性氨基酸含量, 调节酶活性和神经元胞内钙离子水平及提高机体组织细胞抗氧化损伤的能力[5-11]。
文献报道, 在缺血缺氧条件下, 电压门控性钠离子通道开放, 钠电流增大, 钠离子内流增加, 使得膜电位快速去极化, 形成动作电位的上升相, 引起神经元的兴奋性损伤[12]。因此, 抑制钠离子通道的开放、减小钠离子内流可能是抗缺血缺氧造成中枢神经系统损伤的有效途径[13]。同时, 由于钠离子通道是某些药物作用的靶点[14], 这些药物通过抑制钠通道的激活,减小钠电流而发挥其神经保护作用。
由此推断, MgSO4的上述功效可能与其对中枢神经元钠离子通道的影响有关。为此本实验利用全细胞膜片钳技术研究了MgSO4对大鼠海马CA1区神经元钠电流的影响, 以探讨其对缺血缺氧造成的中枢神经系统损伤具有保护作用的机制。
1 材料和方法
1.1 试验动物
用Wistar大鼠, 年龄7-10 d, 雌雄不限。由中国辐射防护研究院动物房提供。
1.2 试剂
Protease、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、己二醇-双(2-氨基乙基)四乙酸 (EGTA)、Na2ATP均为Sigma公司产品, 其余试剂为国产分析纯试剂。(1) 孵育液(mmol/L): NaCl 124, KCl 5, K2HPO4 1.2, MgSO4 1.3, CaCl2 2.4, 葡萄糖 10, NaHCO3 26, pH 7.4。 (2) 标准细胞外液(mmol/L): NaCl 150, KCl 5, MgCl2 1.1, CaCl2 2.6, HEPES 10, 葡萄糖 10, CdCl2 0.2, pH 7.4。(3) 电极内液(mmol/L): CsCl 75, CsF 75, MgCl2 2, HEPES 10, EGTA 2.5, Na2ATP 3, pH 7.5。(4) MgSO4用标准细胞外液配制。
1.3 大鼠海马CA1区神经元的急性分离
大鼠断头取脑, 置于0-4℃孵育液中取出海马, 分出CA1区, 手工切成400-600 μm厚的脑片, 置于32℃孵育液中, 连续通入95% O2+5% CO2, 孵育30 min后在含0.5 mg/ml protease的孵育液中32℃下消化35 min。用孵育液冲洗3次后, 将脑片移入盛有氧饱和标准细胞外液的离心管内, 用Pasteur吸管轻轻吹打, 制成单细胞悬液, 静置约5 min, 取上部细胞悬液, 加入盛有氧饱和标准细胞外液的培养皿内, 约15 min后细胞贴壁, 即可进行全细胞膜片钳记录。
1.4 全细胞膜片钳记录
在20-25℃的室温下, 利用Axopatch 200B膜片钳放大器(Axon Instrument, USA)进行全细胞膜片钳记录。记录电极由玻璃毛细管经PP-830型微电极拉制仪(Narrishage, Japan)拉制, 充灌电极内液后阻抗为8-10 MΩ。电流信号经2 kHz滤波及Digidata 1200B型A/D、D/A转换器进行数模转换后存于计算机。采样频率为10 kHz。实验过程中保持电位及钳制测试脉冲程序的设定、信号采集与储存均借助微机运行pCLAMP 6.0.4软件(Axon Instrument, USA)完成。
1.5 给药方法及数据分析
采用将药物直接加入培养皿的给药方法。结果分析用pCLAMP CLAMPFIT程序(Axon Instrument)和Origin 5.0软件。试验结果用mean±SD表示, 给药前后差异的显著性用t检验进行分析。
2 结果
2.1 硫酸镁对钠电流的影响
置保持电位于-100 ｍＶ, 给予 -100-+60 mV的阶梯去极化脉冲刺激, 步幅10 mV, 刺激波宽12 ms, 刺激频率0.5 Hz, 记录激活的内向电流, 由于该电流可被外液中加入的TTX 1 μmol/L所阻断, 因此被判断为钠电流。
2.1.1 MgSO4对钠电流作用的浓度-效应关系
向培养皿中定量加入MgSO4溶液, 使其终浓度分别为2、3、4、5和6 mmol/L, 对照组中加入等量标准细胞外液。给药后10 min再次记录上述内向电流, 考察MgSO4对钠电流作用的浓度-效应关系。 结果表明, 对照组中加入标准细胞外液后10 min, 记录到的钠电流减小了1.46±1.36% (n=15); 而给药组中钠电流显著减小, 且呈浓度依赖性(图1A)。对图1A中的浓度-效应曲线进行回归分析, 回归方程为 y=16.448x－16.564 (γ=0.999 ) , 由此计算出MgSO4对钠电流的半数抑制浓度IC50为 4.05 mmol/L。
4 mmol/L MgSO4可显著减小钠电流, 抑制率为50.61±3.68% (n=8)。试验完毕, 用标准细胞外液洗脱药物后, 电流可部分恢复(图1B)。
2.1.2 MgSO4对钠电流的电流-电压曲线(I-V曲线)的影响
向培养皿中定量加入MgSO4溶液, 使其终浓度为4 mmol/L, 记录加药前后得到的电流图形。以膜电位为横坐标, 电流峰值为纵坐标, 分别绘制出给药前后的I-V曲线, 以考察MgSO4对钠电流I-V曲线的影响。
结果表明, 4 mmol/L MgSO4可使钠电流的I-V曲线显著上升, 即减小钠电流, 但在不同膜电位下的减小程度不同, 呈现出电压依赖性关系(图1C)。由图中还可以看出, 加药前此电流在-70 mV激活, 在-40 mV达到峰值。给药后, 电流的激活电位和到达电流峰值的电位均有所变化, 向去极化方向移动约20 mV左右。
2.1.3 MgSO4对钠电流的作用与刺激频率无关
给药前, 置保持电位于-100 mV, 给予-100 -－30 mV的去极化刺激, 刺激次数40次, 刺激频率分别为0.25、0.5和10 Hz, 记录激活的内向电流。 结果表明, 随着刺激频率的增加, 记录到的电流值未发生变化。然后向培养皿中定量加入MgSO4溶液, 使其终浓度为4 mmol/L。给药后给予同样的去极化刺激, 这时记录到的钠电流较给药前均有所减小, 但其减小程度并不随刺激频率的增加而增大。由此说明, MgSO4对钠电流的作用与刺激频率无关。
图 1. MgSO4对钠电流的影响
Fig. 1. Effects of MgSO4 on Na+ currents. A： Concentration-response curve for the effects of MgSO4 on Na+ currents which were evoked by depolarizing steps from a holding potential (HP) of -100 to +60 mV. B： Current traces evoked by depolarizing from -100 mV (HP) to －30 mV under control, 4 mmol/L MgSO4 and wash out. C： Effect of 4 mmol/L MgSO4 on the I-V curve of Na+ currents. A series of 12 ms depolarizing steps from -100 mV (HP) to +60 mV (10 mV increment each step) were applied at 0.5 Hz. Each point represents mean±SD (n=8). *P<0.05, **P<0.01 vs control.
2.2 MgSO4对钠电流电压依赖性激活和失活的影响
2.2.1 MgSO4对钠电流电压依赖性激活的影响
置保持电位于-100 mV, 给予-100-0 mV、步幅10 mV的阶梯去极化钳制脉冲刺激, 刺激波宽12 ms, 刺激频率0.5 Hz, 记录得到的电流图形。加入4 mmol/L MgSO4后再次记录上述电流。然后利用公式G=I/(V-VNa)将图中的钠电流峰值转换为电导值, 其中, G为电导, V为膜电位, VNa为翻转电位。以电导值与最大电导值的比值对应膜电位分别绘制出给药前后钠电流的激活曲线。所得曲线可以用Boltzmann方程G/Gmax=1/{1+exp[(V-Vh)/k]}进行拟合, 式中G为电导, V为膜电位, Vh为半数激活电压, k为曲线的斜率因子(图2A)。
图 2. MgSO4对钠电流电压依赖性激活和失活的影响
Fig. 2. Effects of 4 mmol/L MgSO4 on the steady-state activation and inactivation kinetics of Na+ currents. A: Steady-state activation curves of Na+ currents before and after application of 4 mmol/L MgSO4 depolarized at 0.5 Hz. Currents were evoked by a series of 12 ms depolarizing steps from HP -100 mV to 0 mV, 10 mV increment for each step. B: Steady-state inactivation curves of Na+ currents before and after application of 4 mmol/L MgSO4 depolarized at 0.5 Hz. Currents were elicited with a 12 ms test pulse to －30 mV preceded by 500 ms pulses to potentials between －120 to －20 mV, separated by a 1 ms gap. HP and gap potential=-100 mV. Each point represents mean±SD (n=8).
结果表明, 给药前后钠电流的Vh分别为－55.8±6.8 mV 和－34.2±6.2 mV (n=8, P<0.01), 斜率因子k分别为－7.9±1.2 和－7.7±2.8 (n=8, P>0.05)。这说明4 mmol/L MgSO4使钠电流的激活曲线非常显著地右移, 其激活过程受到抑制。
2.2.2 MgSO4对钠电流稳态失活的影响
置保持电位于-100 mV, 先给予－120-－20 mV、步幅10 mV的阶梯钳制脉冲刺激, 刺激波宽500 ms, 然后回到保持电位(-100 mV), 间隔1 ms再给予至－30 mV的测试脉冲刺激, 刺激波宽12 ms, 刺激频率0.5 Hz, 记录得到的电流图形。加入4 mmol/L MgSO4后再次记录上述电流。然后以电流峰值与最大电流峰值的比值对应预脉冲刺激电压, 分别绘制出给药前后钠电流的失活曲线。所得曲线可以用Boltzmann方程I/Imax=1/{1+exp[(V-Vh)/k]}进行拟合, 式中I为电流峰值, V为膜电位, Vh为半数失活电压, k为曲线的斜率因子(图2B)。
结果表明, 给药前后钠电流的Vh分别为－62.7±11.0 mV和－65.3±13.5 mV (n=8, P>0.05), 斜率因子 k分别为8.3±1.8 和 8.9±2.5 (n=8, P>0.05)。这说明MgSO4对钠电流的失活过程没有显著影响。
3 讨论
本文利用全细胞膜片钳技术研究了MgSO4对大鼠海马CA1区神经元钠电流的影响, 旨在为从细胞膜离子通道的角度深入探讨MgSO4抗缺血缺氧的药理学作用机制提供试验依据。
我们的试验结果表明, MgSO4可显著减小钠电流, 此作用呈浓度依赖性关系和电压依赖性关系, 但不具有频率依赖性。试验结果还表明, 4 mmol/L MgSO4非常显著地影响钠电流的激活过程, 作用前后的半数激活电压分别为 －55.8±6.8 和 －34.2±6.2 mV (n=8, P<0.01), 但不改变激活曲线的斜率因子。这说明, MgSO4极显著地抑制钠电流的激活过程, 造成钠通道开放延迟。但是, 4 mmol/L MgSO4对钠电流的失活过程没有显著影响。
文献报道, 缺血缺氧引发的中枢神经系统损伤可能源于多因素以及与多因素相关的过程, 但其中神经元胞内阳离子平衡失调是一个非常重要的原因[15]。在缺血缺氧的条件下, 电压依赖性钠电流增大, 致使钠离子内流增加; 同时, 由于能量消耗的加速, Na+、K+-ATP酶的活性受到抑制, 造成神经元胞内钠离子浓度过大[16]。另一方面, 神经元胞内钠离子浓度的显著增加, 又会逆转细胞膜上的Na+/Ca2+交换, 使得神经元胞内钙离子浓度增加[17,18]; 加之能量消耗的加速使之供应不足, 使Ca2+-ATP酶的活性降低, 钙离子外流减少。由此引起了钙离子依赖机制的破坏, 造成胞内钙离子水平持续增高, 导致蛋白酶、磷脂酶和核酸内切酶的活化, 引起蛋白质、磷脂和DNA损伤, 而且还会启动耗能的代偿机制, 导致与功能有关的系统紊乱, 甚至细胞死亡[19]。钠离子通道的抑制剂或阻断剂能够使动作电位的去极化过程延迟, 减小钠离子内流, 减缓能量消耗。研究表明, 钠离子通道阻断剂, 如lidocaine、lifarizine、BW1003C87、bepridil和U50488H均对缺血缺氧造成的中枢神经元损伤具有抑制作用[15, 20, 21]。钠离子通道是神经保护性药物作用的靶位点, 而MgSO4在神经元损伤的临床治疗中效果显著。 由此可以推断, MgSO4减小钠电流, 并抑制钠通道的激活过程, 可使钠离子内流减小, 减缓神经元胞内能量消耗, 调节胞内Na+、K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性, 进而维持胞内钠离子和钙离子的正常水平, 防止由阳离子平衡失调而引起的依赖机制的破坏, 调节缺血缺氧造成的中枢神经系统功能紊乱, 使受损神经元得以恢复。
研究表明, 镁离子可通过静电结合方式与膜表面的负电荷发生相互作用而产生屏蔽效应, 即镁离子与膜表面的阴离子部分形成复合物, 从而降低生物膜对物质的转运。因此, 上述MgSO4对钠通道的抑制作用可能涉及镁离子与膜表面的阴离子部分形成复合物后细胞膜表面电荷的改变; 同时, 又由于镁离子是质膜上Na+、K+-ATP酶的活化剂, 致使钠离子内流减小, 细胞内钾离子的储存增加, 改变钙离子通过质膜和亚细胞膜的流动, 从而改变细胞内离子的分布[22]。
总之, MgSO4减小大鼠海马CA1区神经元的钠电流, 并抑制其激活过程, 可使缺血缺氧状态下神经元胞外钠离子的内流减小, 调节由此而造成的中枢神经系统功能紊乱, 防止受损神经元发生死亡。这一结果提示MgSO4对电压门控性钠电流的抑制可能是其具有神经保护作用的原因之一, 从而为临床上使用MgSO4治疗缺血缺氧造成的中枢神经系统损伤提供了试验依据。
参 考 文 献
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