生理学报Acta Physiologica Sinica, April 25, 2003, 55(2): 135-141
Received 2002-07-01
Accepted 2002-09-11
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30270583).
*Corresponding author. Tel:13995510595; E-mail:liuxiansheng@tih.tjmu.edu.cn
研究论文
蛋白激酶C对大鼠支气管平滑肌KV通道的影响
刘先胜*, 徐永健, 张珍祥, 倪望, 陈仕新
华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科, 武汉 430030
摘要: 用全细胞膜片钳、 Western印迹法和逆转录-PCR技术, 观察蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)对大鼠支气管平滑肌细胞(bronchial smooth muscle cells, BSMCs)电压依赖性延迟整流钾通道(KV)活性及其亚型KV1.5表达的影响。结果为: (1) PKC激活剂豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)显著抑制急性分离大鼠BSMCs的 KV通道电流, 该效应被PKC阻断剂Ro31-8220显著抑制; (2)PMA显著抑制体外培养大鼠BSMCs的KV1.5 mRNA和蛋白质的表达, 该效应被Ro31-8220显著抑制。 上述观察结果提示, PKC活化可抑制大鼠BSMCs的KV通道电流活性, 下调KV1.5亚型的表达水平。
关键词: 支气管; 平滑肌细胞; 电压依赖性延迟整流钾通道; 蛋白激酶C
中图分类号: Q47; R56
Effect of protein
kinase C on KV channel in rat bronchial smooth muscle
LIU Xian-Sheng*, XU Yong-Jian, ZHANG Zhen-Xiang, NI Wang, CHEN Shi-Xin
Department of Respiratory Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030
Abstract: The effect of protein kinase C (PKC) signaling pathway on the activity of voltage-dependent delayed rectifier potassium channel (KV) and the expression of KV isoform KV1.5 in rat bronchial smooth cells (BSMCs) were investigated with whole-cell patch clamp, Western-blot and RT-PCR techniques. The results showed: (1) phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), a PKC activator, caused a significant inhibition of KV channel currents in rat BSMCs. The inhibition was partly abolished by Ro31-8220, a PKC inhibitor. (2) PMA caused a significant suppression of the expression of KV1.5 mRNA and protein in rat BSMCs. These effects were attenuated by Ro31-8220. The results suggest that in rat BSMCs PKC activation inhibits KV currents and down-regulates the expression of KV1.5.
Key words: bronchus; smooth muscle cells; voltage-dependent delayed rectifier potassium channel; protein kinase C
静息膜电位(Em)是影响平滑肌兴奋性及收缩的重要因素, 在包括气道、食道、血管等平滑肌在内的多种平滑肌细胞的研究表明, 电压依赖性延迟整流钾通道(KV)参与维持平滑肌细胞膜电位水平, 是决定Em的主要钾通道[1-4]。KV活性降低, 使细胞去极化, 细胞膜上电压依赖性钙通道被激活, 致使细胞内钙离子浓度增高, 继而平滑肌兴奋性增强并产生收缩。因此, KV活性变化是影响平滑肌细胞兴奋性的重要因素。气道平滑肌中有关KV的细胞内信号调控机制目前尚未阐明。蛋白激酶C是细胞内信号转导途径中的关键酶, 参与平滑肌细胞多种生理功能的调控[5]。在血管平滑肌细胞及神经细胞的研究表明, 蛋白激酶C (protein kinase C,PKC)参与KV活性调控, PKC被激活之后, KV则受到抑制[6, 7]。但在气道平滑肌中PKC是否也存在类似的调控机制, 目前尚不明了。PKC还与细胞的转录及翻译调控有关[5], 但它是否参与KV表达的调节, 目前也不清楚。本文拟应用全细胞膜片钳、Western印迹和RT-PCR技术探讨PKC对大鼠气道平滑肌细胞KV活性、蛋白质表达和mRNA表达的影响, 为进一步阐明KV的调控机制提供基础实验资料。
1材料和方法
1.1 主要试剂
DMEM培养基、 胎牛血清、 胰蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 胶原酶、 一步法RNA提取试剂盒, 无血清培养基(SFM)和牛血清白蛋白均为Gibco公司产品; Taq DNA聚合酶、 M-MLV、 OligodT12-18、 RNasin及琼脂糖均为Promega公司产品; 4-氨基吡啶(4-aminopyridine, 4-AP, KV通道阻断剂)、 四乙铵(tetraethylammonium, TEA, 钙离子激活钾通道阻断剂)、 DMSO和小鼠抗大鼠单克隆抗体α-actin购于Sigma公司; phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)为美国LC laboratories产品; KV1.5为Santa Cruz产品; 引物均由上海生物工程公司合成。
1.2 主要仪器
电极拉制仪与抛光仪(Narashige, 日本)、三微操纵器(Olympus, 日本)、 放大器(EPC-9, HEKA, 德国)、 倒置显微镜(Olympus, 日本)、 二氧化碳培养箱、 核酸定量仪(Ultrospec-2000,美国)、 PCR仪(PTC-100, 美国)、 恒压恒流电泳仪(DF-C, 北京东方仪器厂)和自动凝胶成像分析系统(MUVB-20, 美国)。
1.3 大鼠支气管平滑肌细胞(BSMCs)的分离及准备
用参考文献提供的方法并加以改进[8]。 取清洁级SD大鼠(180-250 g)37只, 雌雄不拘, 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。用戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉, 开胸后取左肺、右中肺及右肺下叶置于预冷的生理盐缓冲液(PSS)中, 通以95% O2和5% CO2, 分离主支气管, 在解剖显微镜下, 剥离支气管平滑肌周围的肺动脉、肺静脉、神经纤维、结缔组织等, 去上皮组织。 以上操作均在冰浴中进行。将获得的单层平滑肌置入无Ca2+的PSS中, 剪成1 mm3的小块, 在室温(25℃)下, 20 min后将组织块转入含有下列成分的无Ca2+的PSS中(单位: mg/ml): 胶原酶2、 木瓜蛋白酶3、 牛血清白蛋白2、 大豆胰蛋白酶抑制剂1和二硫苏糖醇 20 μmol/L, 恒温36℃, 消化40-60 min, 去上清, 低钙(20 μmol/L) PSS重悬, 用抛光的巴斯德吸管轻轻地吹打组织块即获得含有大量单个ASM细胞的悬液。
1.4 全细胞记录方法
用全细胞模式记录去极化激活的BSMCs钾电流。记录电极用玻璃毛细管(中国科学院上海脑研究所)经电极拉制仪拉制、抛光处理,
电极阻抗为3-5 MΩ。微电极通过三微操纵器控制进行封接, 封接电阻达到1 GΩ以上。破膜之后即获得全细胞模式。实验过程由计算机软件包Pulse 8.30 (HEKA, 德国)控制, 通过放大器及A-D转换器控制刺激的连续发放、信号采集, 并将信号存储于计算机中。所有的实验均在室温(22-25℃)下进行。为消除细胞间的误差, 除特殊标明外, 电流均用电流密度(pA/pF)表示。
用常规全细胞电压钳制模式检测BSMCs钾电流, 分别用两种刺激方式检测电流。(1)脉冲方式(pulse protocol): 保持膜电位在-60 mV, 从-60 mV至+50 mV给予去极化脉冲刺激, 跃阶为10 mV, 脉冲时间为300 ms。(2)斜坡刺激方式(ramp protocol): 保持电位在-60 mV, 300 ms内给予细胞-100mV至+100 mV的去极化刺激。测定膜电位用全细胞电流钳制模式(whole-cell current clamp mode): 在细胞破膜至少稳定5 min后, 将电压钳制模式转变成电流钳制模式, 记录细胞的膜电位(Em)。
1.5 BSMCs的培养
无菌条件下, 按上述方法, 分离并消化支气管平滑肌, 终止消化后, 用含有10% FCS的DMEM培养基悬浮细胞, 按1×105个细胞/ml接种, 置于CO2培养箱培养(37℃)。第2天, 细胞铺展成梭形(图1); 5-7 d后, 70%-90%融合, 呈现典型的峰-谷结构。经α-actin免疫细胞化学染色鉴定为平滑肌细胞(图2)。用0.04% EDTA-0.25% 胰蛋白酶混合酶消化传代。用D-PBS清洗3次, 按1∶2分装、接种。取第3-5代生长良好的细胞进行研究。换无血清培养基, 24 h后, 使细胞周期同步化。分成三组: (1)单纯加入PMA 溶剂DMSO (1 nmol/L); (2) 10 nmol/L PMA; (3) 10 nmol/L PMA+5 μmol/L Ro31-8220, 每组加入等量的无血清培养基。24 h后收集细胞待测。
1.6 用RT-PCR技术观察PMA对KV1.5 mRNA表达的影响
采用Trizol一步法提取RNA, 参照试剂盒的说明进行。取各组总RNA 2 μg, 与10 mmol/L dNTPs混合液1 μl、随机引物Oligo dT12-18 1 μl、RNasin 20 U混合, 70℃变性5 min, 加入逆转录酶M-MLV 1 μl, 10×Buffer 2.5 μl,总体积为25 μl, 37℃水浴60 min, 95℃维持10 min终止反应。PCR引物及反应条件: (1) KV1.5引物: 上游 atg cag ggt cac tcc atc; 下游 ggc ttc tcc tct tcc ttg, 扩增出340 bp片段; (2)磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH): 上游引物: 5′-cta ccc atg gca aat tcc acg gca-3′; 下游引物: 5′-tcc aga cgg cag gtc agg tcc aca-3′, 扩增出598 bp片段。PCR反应条件: 94℃ 1 min、52℃ 1 min、72℃ 1 min, 循环35次, 最后一个循环72℃延伸10 min。用图像分析系统分别测定每一个目的基因及看家基因GAPDH的吸光度值(A值), 取目的基因与GAPDH吸光度值的比值为相对A值。
图1. 呈典型梭形形状的原代培养大鼠BSMCs
Fig. 1.A single rat BSMC with spindle shape in primary culture. Scale bar, 2.5 μm.
图2.培养大鼠BSMCs α-actin的表达鉴定
Fig. 2.Expression of α-actin in cultured rat BSMCs (immunohistochemistry). Scale bar, 1.5 μm.
1.7 用Western-blot检测PMA对BSMCs KV1.5蛋白质表达的影响
首先提取BSMCs总蛋白质。用参考书中的方法[9], 进行制胶、转膜、封闭, 与第一抗体结合, 再与偶联有辣根过氧化物酶的相应第二抗体结合及DAB显色, 最后用凝胶成像分析系统对滤膜进行分析, 读取各条带的吸光度A值。
1.8 溶液
组织浴液及电极外液为PSS(mmol/L): NaCl 135、 KCl 5、 MgCl2 2、 CaCl2 2、 葡萄糖 10和HEPES 10, 用NaOH调pH值至7.4。用于消化组织的无Ca2+-PSS液除不含CaCl2外, 其余成分与PSS相同。电极内液(mmol/L): KCl 130、 MgCl2 2、 K2ATP 5、 EGTA 10和HEPES 10, 通过计算, Ca2+浓度小于1 nmol/L。
1.9 数据处理
电生理结果用软件包Igor 3.1 (Wavemetrics, 德国) 进行分析。数据均用mean±SD表示, 两组间采用t检验进行统计分析。多组间差异性的显著性检验采用方差分析法完成, 两两比较用q检验法检验, P<0.05为差异有显著意义。
2 结果
2.1 大鼠BSMCs膜电容
应用HEKA软件Pulse 8.30和EPC-9, 采用电压钳制方式可直接测定膜电容, 结果为10.4±1.4 pF (n=32,来自19只大鼠)。
2.2 大鼠BSMCs KV电流的检测
电极内液中不含Ca2+,而且有Ca2+络合剂EGTA (10 mmol/L),最大程度地减小Ca2+激活钾通道的作用。在此条件下记录的电流在膜电位正于-40 mV时被激活, 250 ms内无明显失活。细胞内用130 mmol/L CsCl取代KCl后, 该电流几乎完全消失(n=4), 说明该电流主要成分为钾离子。4-AP对该电流有明显抑制作用(n=14, 图3A-C), +50 mV时, 1 mmol/L 4-AP使电流密度从73.8±14.4 pA/pF减少到23.9± 4.7 pA/pF (n=14, P<0.01); 斜坡刺激获得的最高电流密度从84.6±14.2减少到26.5±3.8 pA/pF (n=14, P<0.01, 图3D)。以上特征提示该电流应为KV电流[10]。
图3.急性分离的大鼠BSMCs KV电流
Fig. 3.KV currents in freshly isolated rat BSMCs K+ current were recorded with high internal Ca2+ chelation (10 mmol/L EGTA and no CaCl2 in pipette solution) in the presence of 1 mmol/L TEA in the bath solution for inhibiting Ca2+-activated K+ channel currents. A and B: Representative traces of whole-cell currents recorded from a single BSMC before (A) and after (B) 1 mmol/L 4-AP treatment. C: Current-voltage relationships in the presence and absence of 4-AP (n=14 from 9 rats). Data points are peak KV currents amplitude normalized to cell capacitance (mean±SD). *P<0.05 vs control. D: Representative KV currents measured using ramp protocol in the presence and absence of 1 mmol/L 4-AP.
2.3 PKC活化对BSMCs KV活性的影响
应用全细胞电压钳制脉冲刺激模式记录KV电流。PMA对该电流有明显影响, 如图4A-D所示。+50 mV时, 1 μmol/L PMA显著抑制KV电流密度(从61.5±9.7 pA/pF下降到44.7±7.1 pA/pF,n=7, P<0.01), 该效应被PKC抑制剂Ro31-8220 (1 μmol/L)减弱(57.7±6.5 pA/pF,n=7)。斜坡刺激模式记录电流亦被显著抑制(从68.2±13.2 pA/pF下降到45.8±5.4 pA/pF,n=7, P<0.01, 图4E)。
2.4 PKC对BSMCs Em的影响
应用全细胞电流钳制模式记录细胞Em。1 μmol/L PMA使细胞显著去极化(从-36.8±5.7 mV到 -30.4±7.3 mV, n=10, P<0.05)。
2.5 PKC活化对BSMCs KV1.5 mRNA表达的影响
PKC激活剂PMA显著抑制 KV1.5 mRNA的表达(P<0.05), PKC抑制剂Ro31-8220则取消PMA的上述效应, 如图5所示。
2.6 PKC活化对BSMCs KV1.5蛋白质表达的影响
PKC激活剂PMA显著抑制 KV1.5蛋白质的表达(P<0.05), Ro31-8220则取消PMA的上述效应, 如图6所示。
图4.PMA对急性分离大鼠BSMCs KV电流的影响
Fig. 4.Effect of PMA on KV currents in rat BSMCs. KV current traces of a single BSMC were recorded before (A) and during exposure to 1 μmol/L PMA (B) and then to PMA+1 μmol/L Ro31-8220 (C). D: Current-voltage relationships in the presence and absence of 1 μmol/L PMA or PMA+1 μmol/L Ro31-8220 (n=7 from 4 rats). Data points are peak KV currents amplitude normalized to cell capacitance (mean±SD). *P<0.05 vs control. E: Representative KV current measured using ramp protocol in the presence and absence of 1 μmol/L PMA.
图5.PKC活化对培养大鼠BSMCs KV1.5 mRNA表达的影响
Fig. 5.Effect of PKC activation on KV1.5 mRNA expression in cultured rat BSMCs (n=7 in all groups). *P<0.05 vs control. 1, marker; 2, control; 3, PMA; 4, PMA+Ro31-8220.
图6.PKC活化对培养大鼠BSMCs KV1.5蛋白质表达的影响
Fig. 6.Effect of PKC activation on KV1.5 protein expression in cultured rat BSMCs (n=7 in all groups). *P<0.05 vs control. 1, control; 2, PMA; 3, PMA+Ro31-8220.
3 讨论
本研究结果发现, 在大鼠支气管平滑肌中, PKC通道参与KV活性调控, PKC活化显著抑制KV活性。该结果与神经元及血管平滑肌细胞中的报道结果类似[6,7
]。由于KV是影响Em的主要钾通道, 从理论上推测, PKC对KV的抑制可能引起细胞的去极化反应, 该实验的电流钳制测定结果亦证实了这点。我们以前的研究表明,
PKC活化诱发支气管平滑肌产生强烈而持久的收缩反应[11], 推测其作用机制可能与此有关, 因为KV被抑制之后, 细胞去极化, 细胞膜中电压依赖性钙通道被激活导致细胞内钙离子浓度升高[1]。有关PKC对KV的调控机制目前尚不明了,
可能与其直接磷酸化作用有关, 研究表明, KV通道上有PKC的直接磷酸化位点[12], 另外它还可能通过其它蛋白激酶的磷酸化效应途径间接调控KV的活性[13],
详细机制尚待进一步研究。
迄今已发现KV达数十种,
KV1.5是其中之一, 在血管、食道等多种平滑肌中均有分布, 对平滑肌细胞电生理调控具有重要意义[2, 3,14]。单通道研究结果表明, KV1.5具有延迟整流特性,
可被4-AP阻断, 对四乙铵不敏感[15]。人及大鼠气道平滑肌已被证实有该通道分布[16]。PKC通过对核因子NF-κB及AP-1等的影响参与细胞多种蛋白质的表达调控[5], 但有关它是否参与KV1.5表达的调节目前尚少见报道。本研究发现, PKC活化在mRNA和蛋白质两个水平显著抑制体外培养大鼠支气管平滑肌细胞KV1.5的表达。气道平滑肌中,
除KV1.5之外, 还有KV1.1、1.2、2.1等亚型分布[16,17], PKC对这些亚型是否亦存在类似的调控机制有待进一步研究。
总之, 本研究表明, 在大鼠BSMCs中, PKC不仅直接参与KV活性的调控, 而且显著抑制KV亚型KV1.5的表达。
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