生理学报Acta Physiologica Sinica,  April  25, 2003, 55(2): 142～146

Received 2002-07-16

Accepted 2002-09-19

This work supported by the National Natural Science Foundation of China (739830450), 973 Program (G199905400), and Educational Foundation of China (2000-66).

*Corresponding author. Tel: +86-21-54237224;  E-mail:  cqzhu@shmu.edu.cn 

 

研究论文

杏仁核注射Aβ25-35后大鼠脑内细胞周期蛋白、tau蛋白和Bax蛋白的异常表达

洪道俊, 裴爱琳, 孙凤艳, 朱粹青*

复旦大学上海医学院医学神经生物国家重点实验室,  上海 200032

 

摘要:  近年来研究发现, 阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)病人脑内神经元细胞周期相关蛋白的异常表达与AD相关病理改变存在关联。为探讨β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)的毒性作用能否导致成年脑神经元表达细胞周期相关蛋白, 以及细胞周期相关蛋白表达与神经损伤之间的关系, 我们运用免疫组化、  积分光密度分析等方法对Aβ25-35多肽片段单侧杏仁核注射的大鼠脑进行了研究。结果显示, Aβ25-35注射的大鼠脑内除了有与神经纤维缠结相关的磷酸化tau 蛋白和凋亡相关蛋白Bax蛋白水平增加外, 术后7 d细胞周期相关蛋白cyclin A和cyclin B1蛋白在神经元内异常表达, 但术后21 d时cyclin A的表达有所降低, 而cyclin B1在脑内神经元中已检测不到; 免疫荧光双标结果显示Aβ25-35注射后7 d的大鼠脑内有较多的cyclin B1和Bax、  cyclin B1和磷酸化tau蛋白共存的神经元, 而Bax与磷酸化tau蛋白阳性信号很少共存在同一细胞上。以上结果提示, Aβ可导致成年脑神经元表达细胞周期相关蛋白, 这些神经元可能会通过与Bax相关的凋亡途径死亡, 或首先导致与AD神经纤维缠结相关的tau蛋白磷酸化。

 

关键词: 脑; β-淀粉样蛋白; cyclin A; cyclin B1; tau蛋白; 阿尔茨海默病

中图分类号: Q421; R741.02

 

Aberrant neuronal expression  of mitotic protein, tau and Bax in the rat brain after injection of   Aβ25-35   into the amygdala

HONG Dao-Jun, PEI Ai-Lin, SUN Feng-Yan,  ZHU Cui-Qing*

National Key Laboratory of Medical Neurobiology, Shanghai Medical College of Fudan University, Shanghai, 200032

 

Abstract: Recent evidence indicates that the aberrant neuronal expression of mitotic proteins in Alzheimer′s disease (AD) brain may be related to AD pathological changes. To investigate whether the toxicity of  β-amyloid protein (Aβ) induces mitotic proteins expression in adult rat brain, we used immunohistochemical and integral optical density analytic method to analyze the adult rat brains, which had been injected with Aβ25-35 into unilateral amygdala. Results showed that the levels of neurofibrillary tangle (NFT) related phosphorylated tau protein and apoptosis related protein Bax were increased in Aβ25-35 injected rat brains, meanwhile the aberrantly expression of mitotic protein cyclin A and cyclin B1 was also detected at 7 d after operation, but the level of cyclin A decreased and cyclin B1 disappeared at 21 d. Immunofluorescence double labeling presented that cyclin B1 was partially co-localized with Bax or phosphorylated tau protein, whereas Bax and phosphorylated tau protein seldom co-localized. These results suggest that Aβ causes mitotic protein expression in adult brain neurons, which may die through apoptosis or may be affected by  AD NFT-related tau phosphorylation.

 

Key words: brain; β-amyloid; cyclin A; cyclin B1; tau; Alzheimer′s disease

 

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一种进行性的神经退行性疾病, 以严重的记忆减退和认知障碍为主要临床表现。AD的主要病理表现是细胞外的老年斑(senile plaque, SP)形成, 细胞内的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)的出现, 以及神经细胞和突触数量的减少[1,2]。近年来在探索AD发病机制和病理改变的过程中, 发现AD病人脑内的神经元中出现细胞周期相关蛋白(cyclin A、  cyclin B、  Ki67、  p35等)的异常表达, 且异常表达的细胞周期相关蛋白可能与AD神经元的病理改变有关联[3-5]。目前研究表明, 导致AD神经元变性的因素有很多, 其中β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)的神经毒性作用尤其引人关注[6-8], Aβ 导致神经元变性的机制中是否有细胞周期相关机制的参与值得进一步的研究。为此, 本实验将Aβ25-35多肽片段注射于大鼠杏仁核内[9,10],进行细胞周期相关蛋白和神经细胞损伤的分析。

 

1  材料和方法

1.1 动物

雄性Sprage-Dawley (SD)大鼠, 体重200-250 g, 清洁级, 由复旦大学上海医学院(原上海医科大学)实验动物中心提供。

1.2 大鼠单侧杏仁核注射Aβ25-35

大鼠手术前饲养1周, 自由饮食, 室温20-22℃, 每日光照12 h。动物随机分成两组: 脑内杏仁核注射Aβ25-35组 (n=12), 生理盐水注射对照组(n=10)。动物用10%水合氯醛(0.36 ml/100 g)腹腔注射麻醉, 根据Paxinos and Waston 大鼠脑图谱, 于前囟后3.2 mm, 右侧旁开4.5 mm, 深度8.5 mm进针。在10 min内缓慢注射1 μl  Aβ25-35(5 nmol/μl, Sigma), 留针20 min。手术对照组注射1    μl生理盐水。

1.3 免疫组织化学染色

正常大鼠(n=3), 以及两组杏仁核注射大鼠分别在术后7 d (Aβ25-35组n=6, 手术对照组n=5)和21 d (Aβ25-35组n=6, 手术对照组n=5), 用10%水合氯醛(0.36 ml/100 g)腹腔麻醉, 经左心室灌注生理盐水和4%多聚甲醛固定后取脑。脑组织用4%多聚甲醛于4℃固定6  h, 依次浸于20%和30%的蔗糖液, 待脑组织下沉, 行冠状切面冰冻切片(30 μm)。脑片按标准ABC免疫组化法染色[11]。一抗分别为小鼠单克隆 cyclin A 抗体(1∶100, NeoMarkers)、  cyclin B1 抗体 (1∶100, NeoMarkers)、  磷酸化 tau 蛋白抗体AT8 (1∶1000, Innogenetics)和兔多克隆Bax 抗体(1∶1500, Dako), ABC 试剂盒由 Vector公司提供。阴性对照用抗体稀释液代替一抗作用, 未见明显的细胞着色。

1.4 免疫组化结果积分光密度测定

在光学显微镜下对大鼠脑内的海马、  顶额叶皮层、  梨状皮层和内嗅皮层等结构的免疫阳性细胞分布进行观察。用Leica公司的图像分析系统对海马CA2区免疫组化结果进行积分光密度(integral optical density, IOD)测定。在5倍视野下取大鼠海马CA2区的图像(面积=1.9 mm2), 对图像中所有免疫组化阳性信号进行积分光密度值测定。

1.5 统计分析

数据均用Mean±SD表示。两组间均数比较用t检验。P<0.05为差别有显著性统计学意义。

1.6 免疫荧光双标

依据实验目的对脑片进行三种双标, 所用一级抗体分别为: (1)兔多克隆cyclin B1抗体(1∶200, Santa Cruz)和小鼠单克隆磷酸化tau蛋白抗体AT8; (2)单克隆cyclin B1抗体和兔多克隆Bax抗体; (3)小鼠单克隆磷酸化tau蛋白抗体AT8和兔多克隆Bax抗体进行免疫双标记。依据一抗的动物来源, 分别用相应的rhodamine结合的IgG (1∶200, Sigma)或异硫氰酸荧光素 (FITC)结合的IgG (1∶200, Sigma)进行结合反应。用激光共聚焦显微镜 (Leica, TCS-NT)观察脑片。2结果

2.1 Aβ25-35注射后大鼠脑内磷酸化tau蛋白、  Bax蛋白水平变化

用免疫组化法检测磷酸化tau蛋白和Bax蛋白水平变化。在术后不同时间点, 生理盐水对照组大鼠脑内未检测到明显的AT8标记的磷酸化tau蛋白阳性神经元; Bax蛋白在正常成年大鼠脑内有表达, 生理盐水对照组大鼠脑内的Bax蛋白水平与正常成年大鼠相似。而在Aβ25-35注射组大鼠, 海马、  顶额叶皮层、  梨状皮层和内嗅皮层等部位均出现磷酸化tau蛋白阳性神经元, 且在海马、  顶额叶皮层和内嗅皮层等部位Bax蛋白阳性细胞也明显增多。海马CA2区的IOD测定显示, 与生理盐水对照组比较, Aβ25-35注射组大鼠脑内磷酸化tau蛋白(P<0.01)和Bax (P<0.05)的IOD值在术后不同时间点均增强, 但术后21 d的磷酸化tau蛋白阳性信号的IOD值高于术后7 d (P<0.05), 而Bax蛋白水平在术后7 d和21 d之间无显著差异(表1)。

2.2 Aβ25-35注射后大鼠脑内细胞周期相关蛋白表达的变化

用免疫组化法未检测到正常成年大鼠脑内存在cyclin A和cyclin B1蛋白阳性神经元, 在生理盐水对照组大鼠脑内也没有观察到cyclin A和cyclin B1阳性神经元。杏仁核注射Aβ25-35后, 大鼠的新皮层、  海马等部位出现cyclin A和cyclin B1阳性神经元表达, 其中cyclin A阳性神经元相对较多, 染色也较深。海马CA2区的IOD测定显示, 与生理盐水对照组比较,  Aβ25-35注射组大鼠术后7 d脑内cyclin A和cyclin B1阳性信号的IOD值显著增高(P<0.01); 术后21 d, 脑内cyclin A的IOD值尽管有所降低, 但仍明显高于对照(P<0.01),  而cyclin B1的IOD值已与生理盐水对照组相近(表1)。

 

表1. 大鼠杏仁核注射Aβ25-35后, 大鼠海马CA2区磷酸化tau蛋白、  Aβ蛋白、  Bax、  cyclin A、cyclin

B1等蛋白免疫组化阳性信号的积分光密度分析

Table 1. Integral optical density analysis of phosphorylated tau, Bax, cyclin A,  cyclin B1 immunopositive signals in the CA2 of hippocampus after injecting Aβ25-35 into amygdala (mean±SD)  

	7 d		21 d
	Control (n=5)	Aβ injected rats  (n=6)	Control (n=5)	Aβ injected rats  (n=6)
AT8	5.12±1.64	256.45±38.41**	6.89±2.55	543.39±24.74**#
Bax	1474.38±100.88	2102.25±511.32*	1394.09±85.67	2038.73±461.91*
Cyclin A	1.3±1.29	873.85±221.20**	2.13±1.73	598.92±121.18**
Cyclin B1	6.15±5.01	524.37±76.25**	7.8±4.64	7.96±4.01

*P<0.05  vs control,  **P<0.01  vs control,  #P<0.05  vs  Aβ injected group at 7 d.

图1.激光共聚焦扫描显示Aβ25-35杏仁核注射后7 d大鼠脑内免疫荧光双标结果

Fig. 1.Using laser confocal microscopy to observe the immunofluorescence double labeled cells in rat brain 7 d after injecting Aβ25-35 into the amygdala. Cyclin B1 (A) and phosphorylated tau (B) immunoreactive maters are co-localized in some neurons (C). Cyclin B1 (D) and Bax (E) immunoreactive maters are  also co-localized in some neurons (F), but Bax (G) is rarely  co-localized with phosphorylated tau (H), which are separately presented  (I). Scale bar, 20 μm.

 

2.3 大鼠脑内cyclin B1、  磷酸化tau蛋白和Bax蛋白之间的关系

大鼠杏仁核注射Aβ25-35后, 脑内较多脑区均出现神经原纤维缠结相关的tau蛋白磷酸化, 凋亡相关蛋白Bax的表达以及细胞周期相关蛋白表达改变。为了进一步研究细胞周期相关蛋白与tau蛋白磷酸化之间的关系, 以及Bax蛋白和磷酸化tau蛋白之间的联系, 我们对Aβ25-35注射后7 d大鼠脑片进行了免疫双标分析。结果显示磷酸化tau蛋白和cyclin B1在大鼠的皮层、  海马等部位的神经元出现共存细胞, 同时也观察到皮层、  海马等部位有较多的Bax蛋白与cyclin B1共存的神经元; 但脑内仅有少量的Bax蛋白与磷酸化tau蛋白共存细胞存在, 而大部分Bax阳性细胞和磷酸化tau蛋白阳性细胞彼此独立存在(图1)。

 

3  讨论

Aβ不仅是AD脑内老年斑的主要结构物质, 而且它的毒性作用是AD病理机制中的重要环节。 在Aβ蛋白序列中Aβ25-35的神经毒性较强[12], 目前已知, Aβ25-35可能通过氧化应激增加细胞内钙离子浓度, 影响细胞信号机制, 阻抑神经轴突的快速转运等途径导致神经元损伤[6-8,13,14]。研究认为, 杏仁核不仅是AD脑内主要的有严重病理改变的脑区之一[15,16], 而且它的老年斑病理变化可能早于海马、  大脑皮层等结构[17]。Sigurdsson等用Aβ25-35 进行Fischer大鼠单侧杏仁核注射, 观察到除了杏仁核外, 还有海马、  皮层等结构产生tau蛋白的异常变化[9,10]。我们的实验也观察到在Aβ25-35注射后大鼠脑内出现磷酸化tau蛋白水平升高, 并且还观察到细胞凋亡相关蛋白Bax表达上调等AD相关的病理改变。同时, 我们首次观察到在Aβ神经毒性作用下大鼠脑内出现cyclin A、  cyclin B1等细胞周期相关蛋白的异常表达。

细胞周期分为四个期: G1期、  DNA的复制期(S期)、  G2期、  有丝分裂期(M期)。细胞周期的主要调节因子为多种细胞周期蛋白和依赖细胞周期蛋白的激酶(cyclin/cyclin-dependent kinase, CDK), 这些蛋白的表达和激活不仅调节细胞从一个时期转化为另一个时期, 而且可作为细胞处于不同时期的标志蛋白[18]。其中cyclin A蛋白是细胞周期由G1期向S期转变过程中的一种重要调节蛋白, 它的表达标志着细胞周期G1晚期的机制激活, 而cyclin B1是细胞周期由G2期向M期转变过程中的一种重要调节蛋白, cyclin B1在细胞内大量出现可能标志着细胞周期G2期机制的激活。神经元是一种脱离细胞周期的终极分化细胞, 但是在本实验中观察到Aβ25-35的神经毒性作用能够诱导成年大鼠脑内的神经元异常表达cyclin A和cyclin B1蛋白, 提示Aβ的毒性机制中有细胞周期机制或部分机制的异常激活, 这与在AD脑组织上进行的有关研究报道相似[3,4]。

Nagy等总结AD病人脑组织的研究结果认为, AD脑内的表达cyclin蛋白的神经元中并没有完整的DNA复制, 因而细胞周期循环在成熟的神经元将不能正常进行; 他提出的AD病理的细胞周期假说认为, 这些异常表达cyclin A或cyclin B1蛋白的神经元可能有两种归宿, 一是通过与Bax相关的凋亡途径导致神经元死亡, 另一是首先产生与AD相关的神经纤维缠结而引起神经元损伤[19]。我们的免疫荧光双标结果显示在大鼠脑内有部分cyclin B1和磷酸化tau、  cyclin B1和Bax蛋白的共存细胞, 然而Bax蛋白和磷酸化tau蛋白各自都有较多阳性细胞呈现, 但是相互共存的细胞很少。该结果在一定程度上支持了Nagy的AD病理的细胞周期假说。我们观察到, 在Aβ作用下, 细胞周期相关蛋白(尤其是cyclin B1)阳性的神经元出现, 以后减少, 这与磷酸化tau蛋白的变化以及Bax表达的时程变化并不一致。可能提示细胞周期机制的部分激活在启动AD相关的神经元变性反应中起作用。但是, 那些细胞周期蛋白先为阳性后转为阴性的神经元是否都将进行不可逆的神经元退行性变化, 尚有待进一步研究。

总之, 我们运用Aβ25-35的毒性作用在成年大鼠脑内可诱导出AD相关的一些病理改变, 同时首次在大鼠脑内神经元中观察到cyclin A和cyclin B1的表达, 免疫荧光双标的结果提示异常表达的细胞周期相关蛋白可能与AD相关的病理改变有一定联系。

 

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