生理学报Acta Physiologica Sinica, April 25, 2003, 55(2): 147-152
Received 2002-06-20
Accepted 2002-09-11
*Corresponding author. Tel: +86-25-6662886; E-mail:wlbianjs@163.com
研究论文
急、 慢性乙醇处理后大鼠伏核内cAMP反应元件结合蛋白磷酸化的变化
李菁1，*, 李跃华1, 张小虎2, 朱学江2, 戈应滨2, 袁孝如2
南京医科大学 1病理学与病理生理学系, 2生理学系, 南京 210029
摘要: 采用免疫组织化学的方法, 检测急性、 慢性乙醇作用及戒断后大鼠伏核内cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)磷酸化的变化。结果显示, 急性腹腔注射乙醇后15 min, 伏核内磷酸化CREB(phospho-CREB, p-CREB)蛋白明显增加, 30 min后达高峰, 至1和6 h后仍明显高于对照组。而慢性饮乙醇溶液显著降低大鼠伏核内p-CREB蛋白含量, 在撤除乙醇后24、 72 h时, 伏核内p-CREB蛋白含量仍明显较低, 戒断后7 d, 恢复到正常水平。结果表明, 急性乙醇处理增加伏核内CREB磷酸化作用, 而慢性乙醇作用则降低伏核内CREB磷酸化作用, 这可能是乙醇依赖的分子机制之一。
关键词: 乙醇; 伏核; cAMP反应元件结合蛋白
中图分类号: Q426; R338.2
Changes in the
phosphorylation of cAMP response element binding protein in the rat nucleus
accumbens after acute and
chronic ethanol administration
LI Jing1,*, LI Yue-Hua1, ZHANG Xiao-Hu2, ZHU Xue-Jiang2, GE Ying-Bin2 , YUAN Xiao-Ru2
１Department of Pathology and Pathophysiology, and 2Department of Physiology, Nanjing Medical
University, Nanjing 210029
Abstract: To define the molecular basis of ethanol dependence, changes in the phosphorylation of cAMP response element binding protein (CREB) in the nucleus accumbens of rats after acute and chronic ethanol administration were detected using immunohistochemistry. The results demonstrate that the expression of phospho-CREB (p-CREB) protein in the rat nucleus accumbens significantly increased after 15 min of acute ethanol exposure, reaching a peak at 30 min after ethanol administration. The increment remained after 1 or 6 h of ethanol exposure compared to the control rats. In contrast, chronic intake of ethanol solution obviously decreased the expression of p-CREB protein compared to the control rats. The decrement remained 24 h or 72 h after ethanol withdrawal, and returned to the control levels after 7 d of ethanol withdrawal. The results suggest that an acute ethanol administration led to an increase in the phosphorylation of CREB in the nucleus accumbens, but chronic ethanol administration produced a decrement, which is possibly one of the molecular mechanisms of alcohol dependence.
Key words: ethanol; nucleus accumbens; cAMP response element binding protein (CREB)
乙醇是全球范围内应用最为广泛的滥用物质。 在乙醇刺激时中枢神经系统某些结构内基因表达的调控是目前研究乙醇依赖分子机制的热点之一。近年来, 许多研究发现, 细胞核内基因转录因子如cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,
CREB)能调控脑内多种基因转录, 可能在药物依赖的长时程神经适应性变化过程中具有重要作用[1]。目前已证明CREB上133位丝氨酸磷酸化(简称p-CREB)可被多种蛋白激酶诱导,
如: 蛋白激酶A (PKA)、 Ca2+-和钙调蛋白依赖性激酶(CaMⅡ和CaMⅣ激酶)、 细胞外调控激酶(Erk 1和Erk 2)等。p-CREB为活性形态, 其功能是启动一些基因转录。这些基因包括 c-fos 等立早基因、
前强啡肽基因、 前脑啡肽基因、 脑源性神经因子基因等。抑制子如诱导型cAMP早期抑制因子或核蛋白磷酸酶可以阻断磷酸化的CREB活性。
行为学、 药理学、 生物化学等方面的研究表明, 乙醇依赖与中枢内存在的奖赏系统有关, 该系统主要涉及弓状核、 杏仁核、 蓝斑、 腹侧被盖区(ventral tegument area,VTA)和伏核(nucleus accumbens, Nacc),其中VTA和Nacc是乙醇依赖引起奖赏效应的最后通路。已有研究发现, 慢性可卡因处理后, 大鼠伏核内CREB功能和表达的降低与可卡因奖赏效应及戒断后的抑郁症状密切相关[2,3]。然而, 关于急、 慢性乙醇作用后伏核内CREB功能和表达的变化迄今尚未见报道。本实验采用免疫组织化学的方法观察了急性腹腔注射乙醇、 慢性饮乙醇溶液和戒断对大鼠伏核内CREB磷酸化作用的影响。
1 材料和方法
1．1 试剂
无水乙醇: 南京化工厂产品, 批号01061434; p-CREB (Ser133)抗体购自New England Biolabs公司; ABC试剂盒及DAB购自VECTOR 公司。其他试剂均为国产分析纯。
1．2 动物
SD大鼠, 雄性, 由江苏省实验动物中心提供。急性实验大鼠体重为340-370 g; 慢性实验大鼠实验前体重为180-210 g, 至实验结束时为340-380 g。
1．3 实验分组及乙醇处理
急性乙醇实验参照Yang等[4]方法, 给大鼠腹腔注射(i.p.)乙醇2.5 g/kg (用生理盐水配成含20% 乙醇(w/v)的溶液); 对照组大鼠腹腔注射等体积的生理盐水。两组大鼠于i.p.后15、 30 min和1、 6 h, 心脏取血, 用于血浆乙醇浓度的测定; 然后灌注取脑, 用于免疫组织化学检测。慢性乙醇实验组, 参照Turchan 等[5]方法给大鼠自由饮含6%(v/v)乙醇的水溶液30 d。记录大鼠每天饮乙醇量: 平均每天饮乙醇6.5-8.0 g/kg。分别在大鼠开始饮乙醇溶液后的1、 3、 7、 14、 30 d及戒断后24 h, 通过内眦静脉取血, 测定血中乙醇浓度。饮乙醇溶液30 d后, 大鼠改饮正常水, 并参照Erden等[6]方法观察大鼠乙醇戒断症状。对照组大鼠自由饮自来水。
1．4 血浆乙醇浓度测定
用NAD-乙醇脱氢酶法测定血浆乙醇浓度。检测灵敏度为0.05 mg/ml血浆。
1．5 p-CREB蛋白免疫组织化学
急性乙醇实验组取i.p.乙醇后15、 30 min和1、 6 h的乙醇组及对照组各6只大鼠, 慢性乙醇实验组取对照组、 饮乙醇溶液30 d、 撤除乙醇后24、 72 h和7 d的大鼠各6只。用戊巴比妥钠(100 mg/kg)麻醉大鼠, 然后行左心室主动脉插管, 先灌注0.9% NaCl 150 ml快速冲洗, 随后灌注冷的4% 多聚甲醛(pH 7.4) 400 ml。断头取脑置于同样的固定液中后固定2-3 h, 4℃。然后, 将脑组织浸入20%蔗糖溶液, 4℃过夜。将脑组织冷冻, 使用Leica CM1900恒冷箱切片机, 参照Paxinos and Watson立体定位图谱[7], 切出在Bregma 2.2-0.7 mm之间含伏核的连续冠状切片(图1), 片厚25 μm。
图1.一个典型的含伏核组织的阴性染色片
Fig. 1. One typical negative section containing the nucleus accumbens. The section was incubated with 1% BSA in PBS containing 0.25% Triton X-100 without primary antibody for p-CREB. Nacc, nucleus accumbens; AC, anterior commisure.
采用ABC-DAB方法进行免疫组织化学实验。p-CREB抗体滴度为1∶200(用PBS/2% Triton X-100 稀释抗体), 4℃孵育72 h。用1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)代替一抗做阴性对照实验。
1．6 定量分析
采用Leica图像分析系统计算伏核组织内免疫反应阳性颗粒。该系统与一光学显微镜相连, 计算每100 μm2组织内的免疫染色阳性颗粒数。以没有染色的区域为零计数的方式建立每个图像的临界值。在这种条件下, 计算前连合周围之伏核组织(图1)中阳性颗粒, 将每个大鼠连续3张切片的阳性颗粒数的平均值作为该大鼠的数值。
1．7 统计学处理
每组数据均来自6 只大鼠的mean±SD。组间比较行样本均数间非配对t检验。以P＜0.05为判断差异显著性的标准。
2 结果
2．1 急性乙醇处理大鼠血内乙醇浓度、 行为和伏核内p-CREB含量的变化
2．1．1 急性乙醇处理后血中乙醇浓度的变化
给大鼠i.p.乙醇(2.5 g/kg)15 min 后, 大鼠血浆乙醇浓度达最高, 为2.54 mg/ml; 以后逐渐下降, 注射6 h后降至为0.67 mg/ml (图2); 乙醇注射后24 h血浆中已检测不到乙醇(数据未报道)。正常对照组在所有的时间点均未检测到乙醇(检测灵敏度为0.05 mg/ml)。
图2.急性乙醇处理大鼠血浆乙醇浓度的变化
Fig. 2.Changes in plasma alcohol levels of rats after acute ethanol administration. Male rats received a single acute dose of ethanol (2.5 g/kg) or saline and were sacrificed at 15 min, 30 min, 1 h, or 6 h after administration. Blood samples were collected and ethanol concentrations were determined in plasma by the NAD-alcohol dehydrogenase enzyme spectrophotometry. Data are expressed as the mean±SD of six rats.
2．1．2 急性乙醇处理大鼠的行为变化 实验观察了大鼠i.p.后6 h内的行为变化。发现i.p.乙醇4 min后大鼠进入安静状态, 翻正反射消失, 触摸大鼠时感觉皮肤较冷; i.p.乙醇10-15 min后大鼠清醒, 翻正反射恢复, 行走、 竖立、 理毛等活动行为增多。
2．1．3 急性乙醇处理诱导大鼠伏核组织内p-CREB的变化
采用免疫组织化学法检测对照组、 急性乙醇处理组大鼠伏核内p-CREB的表达, 在阴性对照切片上伏核组织内没有观察到p-CREB免疫染色阳性颗粒(图1), 表明实验用的133位丝氨酸磷酸化的CREB抗体为特异性的。急性i.p.乙醇后, 大鼠伏核内p-CREB的含量随时间的延长呈现一明显的时相变化过程: i.p.乙醇15 min后伏核组织内p-CREB蛋白含量明显增加, 与对照组比增加54.25%(P<0.01); 乙醇注射后30 min伏核内p-CREB蛋白含量达高峰, 与对照组相比增加115.44%(P<0.01,图3、4)。 此后伏核内p-CREB增幅逐渐下降, 但仍高于对照组水平, 1 h时与对照组相比增加80.67%, 至6 h增加22.94% (P<0.05, 图4)。
图3.急性乙醇处理30 min和对照大鼠的伏核p-CREB蛋白染色照片
Fig. 3.Immunostaining of p-CREB protein in the nucleus accumbens of acute ethanol-exposure (30 min) and control rats. A: p-CREB positive particles in the nucleus accumbens of control rats. B: p-CREB positive particles in the nucleus accumbens of rats exposed to ethanol for 30 min.
2．2 慢性饮乙醇溶液及戒断后大鼠血内乙醇浓度、 行为和伏核内p-CREB含量的变化
2．2．1 慢性饮乙醇溶液和停饮后血中乙醇浓度的变化
饮乙醇溶液组大鼠在整个实验过程中, 血液中乙醇浓度变化不大, 均在0.085 mg/ml以下, 各组动物血液中乙醇浓度也未见明显差异。撤除乙醇24 h后检测不到血中有乙醇。
2．2．2 慢性饮乙醇溶液和停饮后大鼠行为的变化
大鼠在饮乙醇前较为温顺, 不易被激惹, 攻击性行为较少; 在饮乙醇过程中, 大鼠活动量减少, 不易激怒, 攻击性行为明显减少; 乙醇撤除后24-72 h内, 大鼠出现打喷嚏、 理毛增加、 极易激怒、 尾僵直、 异常姿势、 湿狗样抖动等与文献报道相类似的
图4.急性乙醇处理大鼠伏核内p-CREB蛋白含量的变化
Fig. 4.Changes in p-CREB protein levels in the rat nucleus accumbens after acute ethanol exposure. Animals received a single acute dose of ethanol (2.5 g/kg) or saline and were sacrificed 15 min, 30 min, 1 h, or 6 h after acute ethanol exposure. Data represent the mean±SD of six animals. *P<0.05, **P<0.01 vs control.
图5.慢性饮乙醇、 乙醇戒断及对照大鼠的伏核p-CREB免疫染色照片
Fig. 5.Immunostaining of p-CREB protein in the nucleus accumbens of ethanol-intake, ethanol-withdrawal, and control rats. A: p-CREB positive particles in the nucleus accumbens of control rats. B: p-CREB positive particles in the nucleus accumbens of rats exposed to ethanol for 30 d. C, D, E: p-CREB positive particles in the nucleus accumbens of rats which ethanol had been withdrawn for 24 or 72 h, and for 7 d. 戒断症状[6], 致戒断7 d后上述戒断症状基本消失。
2．2．3 慢性饮乙醇溶液和戒断期间大鼠伏核内的p-CREB含量变化
结果如图4、 5所示, 大鼠连续饮低浓度乙醇溶液(6% v/v)30 d后, 伏核组织内p-CREB蛋白含量显著降低, 与对照大鼠相比降低75.03% (P<0.01);乙醇撤除后24、 72 h, 伏核组织内p-CREB蛋白含量与饮酒30 d比较虽明显升高(P<0.01), 但仍然低于对照组水平。在戒断24 h时, 与对照组相比降低34.80%(P<0.01), 戒断72 h时降低28.05%(P<0.01), 乙醇戒断后7 d, 伏核内p-CREB蛋白水平与对照组比较无统计学显著性差异(P>0.05)。
图6.慢性饮乙醇和戒断对大鼠伏核内p-CREB蛋白含量的影响
Fig. 6.Effects of chronic ethanol intake and its withdrawal on p-CREB protein levels in the rat nucleus accumbens. Ethanol was administered (6% v/v) for 30 d or was withdrawn for 24 h, 72 h or 7 d after 30 d of chronic ethanol intake. Data represent the mean±SD of six animals. **P<0.01 vs control, # P<0.01 vs ethanol exposure 30th day.
3 讨论
行为学、 生物化学等方面的研究表明, 中脑边缘系统奖赏通路的激活, 包括多巴胺的释放, 在成瘾行为的发生发展中具有关键性作用。刺激中脑边缘系统的VTA多巴胺神经元放电, 导致其向伏核内释放的多巴胺增加[8]。急性乙醇作用能增加伏核内多巴胺含量[9,10],
而多巴胺与D1受体结合, 激活cAMP-PKA信号转导系统, 增加CREB磷酸化, 从而启动一些基因转录, 引起乙醇的急性强化效应[11]。本实验发现, 急性i.p.乙醇(2.5
mg/kg)后大鼠伏核内p-CREB蛋白增加与血浆中有较高的乙醇浓度相一致。腹腔注射乙醇后15 min, 大鼠血浆内乙醇浓度最高为2.54 mg/ml, 至1
h时降为2.26 mg/ml, 注射后6 h降至0.67 mg/ml。因此, 本研究观察到的急性乙醇处理后伏核内p-CREB反应性增加与文献报道的乙醇正性强化效应相一致[11,
12]。另外, Imperato等[9]研究发现, 急性i.p.乙醇(2.5 mg/kg)后伏核内多巴胺释放增加, 而本研究发现的急性乙醇处理后伏核内p-CREB亦明显增加。我们推测,
急性注射乙醇后伏核内p-CREB含量的增加, 可能与乙醇增加伏核内多巴胺含量相关, 而p-CREB进而调控立早基因、 强啡肽基因等表达, 提高突触连接活性, 介导乙醇的急性强化效应[11]。
本实验亦发现在急性i.p.乙醇后, 伏核内p-CREB蛋白水平的增加可持续到注射后6 h。这与高浓度乙醇能直接诱导NG 108-15细胞PKA催化亚基进入细胞核内,
使CREB长时间处于磷酸化状态(至少维持24 h)的结果一致[14]。Yang等[5]实验发现急性乙醇处理后6 h大鼠小脑组织CREB与CRE结合活性仍处于较高水平亦支持了我们的结论。但注射后6
h血浆中仍有较高浓度的乙醇(0.67 mg/ml), 而伏核组织中p-CREB蛋白水平呈下降趋势, 这可能与乙醇诱导核蛋白磷酸酶活性增加使p-CREB脱磷酸化有关[15
], 亦可能与此时伏核内多巴胺含量已降低有关[9]。
已有研究证明cAMP信号通路是乙醇急慢性作用的细胞内靶标, 急性乙醇作用引起cAMP信号系统上调, 而慢性乙醇作用导致cAMP系统适应性脱敏, 这可能是乙醇耐受和依赖的重要机制。我们的研究结果发现,
大鼠长期饮用低浓度乙醇溶液后伏核内p-CREB蛋白含量显著降低, 撤除乙醇后这种抑制效应亦不能快速恢复, 直至戒断后7 d伏核组织内p-CREB蛋白水平才逐渐恢复。实验亦发现,
饮乙醇溶液组大鼠在整个饮乙醇过程中, 血液中乙醇浓度变化不大, 说明饮乙醇和戒断后大鼠伏核组织内p-CREB含量的变化可能是低浓度乙醇反复刺激作用的结果, 而非乙醇的蓄积作用。以上结果提示,
反复乙醇刺激降低伏核内CREB磷酸化作用, 可能与大鼠较长时间饮用乙醇后, 其脑组织发生了适应性变化有关。与本实验结果相似的是, Ikemoto等[16]采用原位DNA-蛋白结合的方法,
发现慢性吗啡处理能降低杏仁核、 丘脑、 下丘脑以及皮层中CREB与CRE的结合活性, 并且停用吗啡后这种效应至少可以持续14 d, 这与吗啡的长时程适应性变化有关。有实验研究表明细胞内p-CREB蛋白水平与细胞膜去极化能力有关,
它能介导细胞膜去极化[17]。我们实验室前期工作利用同样的饮乙醇溶液模型, 记录了饮乙醇溶液及撤除乙醇后大鼠伏核脑电图(EEG), 发现慢性饮乙醇对伏核神经元具有抑制作用[18]。这一结果与本研究发现的慢性乙醇作用后伏核组织内p-CREB蛋白水平降低的变化一致。因此,
我们推测慢性乙醇作用对伏核神经元的抑制可能与伏核内p-CREB水平降低有关。但在撤除乙醇后24、 72 h, 伏核内p-CREB蛋白含量仍明显低于对照组水平(P＜0.01),
表明在慢性乙醇作用下, 中枢神经系统发生了适应性变化, 并形成了与细胞结构和功能相适应的一种病理性稳态。 当停止饮用乙醇后, 乙醇不再抑制细胞电活动, 但乙醇诱导的细胞结构的变化不能马上恢复,
使已形成的病理性稳态遭到破坏, 细胞出现异常放电活动, 如出现成串棘波和棘慢综合波[18], 并表现为戒断症状, 随着时间的延长, 生理性稳态才逐渐恢复[19]。另外,
与本实验研究结果不同的是Pandey等[20]发现慢性乙醇刺激对前额皮层、 顶叶皮层及梨状皮层等部位p-CREB表达无显著影响, 他们观察到仅在乙醇戒断24
h时这些部位的p-CREB表达才明显降低。我们认为本研究的结果与他们不同的原因可能是研究的部位不同(伏核对皮层), 也可能是乙醇作用的时间不同所致。在他们的乙醇饲养模型中,
乙醇仅使用14 d, 而在本研究中大鼠饮乙醇溶液1个月。支持我们的究结果是, Yang等[21]观察到, 慢性乙醇处理35 d后大鼠纹状体CREB磷酸化及CRE-DNA结合活性显著降低,
并且与CREB调控的基因前脑啡肽、 c-fos基因表达减少有关。本项研究亦表明, 慢性乙醇作用后大鼠伏核内CREB磷酸化显著降低, 提示伏核内CREB依赖基因表达的减少可能与乙醇依赖的形成有关。
下一步工作将是设法确定在乙醇依赖时, 磷酸化CREB的变化如何启动另一些基因转录及成瘾相关基因的表达, 以进一步阐明CREB功能变化介导乙醇依赖形成的机制。
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