生理学报Acta Physiologica Sinica,  April  25, 2003, 55(2): 160-164

Received 2002-07-01

Accepted 2002-11-07

This work was supported by the National Natural  Science Foundation of China (No.30270602) and the Foundation for University Key Teachers by the Ministry of Education of China.

*Corresponding author. Tel: +86-29-3374519;  Fax: +86-29-3246270; E-mail: sszhou@fmmu.edu.cn

 

 研究论文

尼氟灭酸对肝癌细胞增殖的影响

田晶1,  陶凌1, 曹云新2, 董玲1, 胡玉珍1, 杨安钢3, 周士胜1,*

1第四军医大学生理学教研室、2免疫学教研室、3生物化学与分子生物学教研室, 西安 710032

 

摘要:  为了观察氯通道阻断剂尼氟灭酸(NFA)对人肝癌细胞(human hepatoma cell line,  HHCC)增殖的影响, 我们将NFA作用于HHCC, 应用细胞计数法及噻唑兰(MTT)比色分析法观察细胞增殖情况; 用流式细胞仪检测细胞周期时相; 并用激光扫描共聚焦显微镜检测[Ca2+]i 的变化。结果发现， NFA使HHCC细胞数及MTT光吸收值(OD)较对照组都显著降低, 去除NFA后, OD值逐渐恢复。经100  μmol/L NFA处理48 h的HHCC细胞G1期细胞比例比对照组明显增高, S期及G2期细胞比例明显低于对照组。细胞外应用NFA (100  μmol/L)使 [Ca2+]i 快速降低, 去除NFA后, [Ca2+]i可恢复。这些结果表明, 尼氟灭酸能抑制细胞增殖, 其机制可能与细胞内信号转导Ca2+/CaM途径被抑制有关。

 

关键词: 肝癌; 增殖; 氯通道; 钙

中图分类号: Q253; R735.7

 

Effects of niflumic acid on the proliferation of human hepatoma cells

TIAN Jing1, TAO Ling1, CAO Yun-Xin2, DONG Ling1, HU Yu-Zhen1, YANG An-Gang2 ,ZHOU Shi-Sheng1,*

Departments of 1Physiology, 2Immunology, and  3Biochemistry and Molecular Biology, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032

 

Abstract:  The purpose of this work was to investigate the effects of niflumic acid (NFA), a chloride channel blocker, on the proliferation of human hepatoma cell line (HHCC). Cell proliferation was analyzed by cell count and MTT assay. Cell cycle analysis was carried out by flow cytometry. [Ca2+]i  was determined by laser scanning confocal system. It was found that NFA decreased significantly the cell number and the MTT optical density (OD) of HHCC cells, and that the OD value was reversed after washout of NFA. Compared with control, NFA blocked cell cycle progression in  G1 phase. Extracellular application of NFA (100  μmol/L) induced a rapid decrease in [Ca2+] i. These findings demonstrate that blockage of chloride channels by NFA induces growth arrest of HHCC in  G1 phase, which may be due to the inhibition of Ca2+/CaM-dependent signaling pathways.

 

Key words: hepatoma; proliferation; chloride channel; Ca2+

 

哺乳动物细胞膜上有多种类型离子通道, 研究发现这些离子通道除了与细胞电活动有关外, 还与细胞的增殖[1,2]、分化[3]和凋亡[4]有密切关系。氯通道是细胞膜上介导阴离子跨膜运动的一个通道蛋白家族。最近发现氯通道在细胞增殖中起重要作用。Wondergem等报道氯通道阻断剂DIDS、NPPB、tamoxifen、mibefradil通过影响容量敏感性氯电流抑制肝AML12细胞的增殖[5]。而氯通道在肿瘤细胞增殖活动中的作用还不清楚。本实验通过观察氯通道阻断剂尼氟灭酸(NFA)对人肝癌细胞(human hepatoma cell line,  HHCC）增殖的影响, 分析氯通道在癌细胞增殖中的作用机制, 探讨通过抑制氯通道达到控制肿瘤生长的可能性。

 

1  材料和方法

1.1 材料

HHCC由本校细胞工程中心陈志南教授馈赠。NFA、噻唑兰(MTT)、胰蛋白酶、EDTA、HEPES购自Sigma。DMEM购自GIBCO。

1.2方法

1.2.1主要药物配制

NFA: 用二甲基亚砜(DMSO)配成0.1 mol/L的原液, 4℃保存, 实验前用DMEM或台氏液稀释成工作液。DMEM培养基: 按说明书配制, 用1 mol/L的HEPES调pH至7.2-7.4, 过滤分装, 4℃保存备用。MTT溶液: 用生理盐水配制, 浓度为5 g/L, 0.22 μm微孔滤器过滤除菌后, 4℃保存备用。台氏液成分为(mmol/L):  NaCl 143、 KCl 5.4、 MgCl2 0.5、 CaCl2 1.8、 NaH2PO4 0.3、 Glucose 5和HEPES-NaOH 5。

1.2.2 细胞培养

细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基(正常培养液)中, 置于CO2孵箱中, 在37℃、5% CO2条件下培养。每2 d换液1次, 3-4 d传代1次。

1.2.3 细胞计数法观察细胞增殖

细胞悬液以3×104-4×104每孔的密度接种于24孔板, 培养12 h后, 吸去培养液, 随机分组(n=3), 加入正常培养液(对照)或含不同浓度NFA的培养液, 培养2 d后, 用血细胞计数板计数, 以时间为横轴、细胞数为纵轴做量效曲线。

1.2.4 MTT比色分析法观察细胞增殖

按照文献[6]报道方法, 细胞悬液以每孔3×104-4×104的密度接种于24孔板, 培养12 h后, 随机分组(n=4), 吸去培养液, 加入正常培养液(对照)或含有NFA 50  μmol/L或含有NFA 100  μmol/L的培养液。每天同一时间, 在每组的随机4个孔中加入80  μl  MTT (5 g/L), 并于4 h后小心吸去上清液, 加入200  μl DMSO溶解结晶体。3 d后, 溶液移入96孔板, 用酶联免疫测定仪(Model 550, Bio-Rad, USA)读取490 nm光吸收值。以往的研究表明, 用MTT比色分析法, OD值与细胞数成正比, 可以反映细胞的数量[6]。

1.2.5 细胞周期分析

将HHCC细胞悬液接种于3个25 ml培养瓶中, 每瓶约1×105个细胞。细胞贴壁后, 采用常用的血清饥饿法, 使细胞同步化。 即: 在实验开始前, 先给予无血清培养液处理细胞24 h, 使细胞周期停滞在G0期, 然后给细胞换液, 并随机加入正常培养液(对照组)、含DMSO的培养液及含有100  μmol/L NFA的培养液, 2 d后细胞由70%乙醇固定, PBS清洗2次, 用含有RNase 10 mg/L和PI 50 mg/L的PBS在25℃黑暗条件下染色30 min后, 用流式细胞仪(Elite ESP, Coulter, USA)检测每个周期时相中的细胞比例。

1.2.6 细胞内Ca2+的测定

将HHCC细胞悬液接种在特制的培养皿上培养2 d, 以台氏液清洗细胞2遍, 用fluo-3/AM (10  μmol/L)在37℃避光条件下负载35 min后又用台氏液清洗2遍, 然后置于激光扫描共聚焦显微镜(MRC-1024, Bio-Rad)下扫描[7]。激发波长为488 nm, 检测波长为568 nm。扫描时, 对置于台氏液的细胞进行扫描作为对照, 然后换为含100  μmol/L NFA的台氏液作用2 min, 最后再换为台氏液。在加药及冲洗过程中, 每10 s扫描1次, 以观察细胞内Ca2+的动态变化。

1.2.7  统计学分析

实验数据以mean±SD表示, 统计差异性检验用t检验, P<0.05为有显著差异。

 

2结果

2.1  NFA对HHCC细胞增殖的影响

用不同浓度NFA作用于细胞后, 可见当培养液中的NFA浓度达到60  μmol/L时, 细胞数即明显低于对照组(P<0.05); 当细胞培养液中的NFA浓度增加到100  μmol/L时, 这种抑制作用进一步增加(P<0.01)(图1), 表明NFA 能抑制HHCC细胞增殖, 并具有浓度依赖性。

图1.  不同浓度NFA对细胞增殖的影响

Fig. 1.Effects of NFA of different concentrations on the proliferation of HHCC. HHCC  are cultured with NFA of different concentrations,  and the data are assessed by cell count on a haemocytometer. *P<0.05, **P<0.01 vs control.

 

2.2 NFA对HHCC细胞MTT OD值的影响

在实验组中, 用50  μmol/L和 100  μmol/L的NFA处理后, OD值明显低于对照组(P<0.01), OD值的变化亦与剂量有关, 较大剂量NFA(100  μmol/L)处理的实验组, 其OD值明显低于较小剂量组(NFA 50  μmol/L) (P<0.01)(图2A)。 去除培养液中的NFA后, OD值逐渐恢复(P<0.01)(图2B)。表明NFA抑制HHCC增殖是可逆的。

图2.NFA对HHCC细胞增殖的影响

Fig. 2.Effects of NFA on the proliferation of HHCC. Cell proliferation was measured by colorimetric MTT assay. Data are presented as mean±SD, n=4 wells. A: Dose-dependent effects of NFA. **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs NFA 50  μmol/L treated group. B: Reversal effects of NFA. **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs NFA-treated group.

2.3 细胞周期时相改变

流式细胞仪结果显示, 对照组G1期和S期细胞数分别为57.0%、34.2%, 增殖指数(S+G2/G1+S+G2)为43.1% (图3A); 而在NFA(100  μmol/L)作用组, G1期细胞数明显增多, 为71.3%, 而S 期细胞数降到20.9%, 增殖指数为28.7%(图3B)。重复3次均得出相似的结果(P<0.05)。说明NFA使细胞周期时相发生改变, 抑制细胞从G1期过渡到S期, 使细胞增殖停滞在G1期。DMSO(≤0.12%)对细胞增殖无作用(P>0.05)(数据未显示), 表明NFA的作用与所用溶媒DMSO无关。

图3.NFA对细胞周期的影响

Fig. 3.Effect of NFA on the cell cycle of cultured HHCC. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. A: Control. B: In the presence of NFA (100   μmol/L). 

2.4 细胞内[Ca2+]的变化

用激光扫描共聚焦显微镜动态观察细胞内游离钙的变化, 发现细胞外应用NFA(100  μmol/L)2 min后细胞内Ca2+即明显减少, 去除NFA后约3 min, 细胞内Ca2+水平可恢复到对照水平(P<0.05) (图4)。

图4.NFA对细胞内Ca2+的影响

Fig. 4.Influence of NFA on intracellular Ca2+ level. Con, control; NFA, extracellular application of Tyrode′s solution containing NFA (100  μmol/L); NFA washout,  Tyrode′s solution containing 100  μmol/L NFA was replaced by Tyrode′s solution. n=3 cells. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs NFA.

 

3讨论

本研究发现, Cl- 通道阻断剂NFA能抑制肝癌HHCC的增殖, 使细胞增殖停滞在G1期。细胞增殖是通过细胞周期实现的。细胞周期包括有丝分裂期和分裂间期。分裂间期为细胞分裂做准备, 又分为三期: 合成前期(G1)、合成期(S)、合成后期(G2)。G1期是细胞质复制的主要阶段, 蛋白质、RNA及多聚核蛋白体都在此期合成。氯通道阻断剂NFA使细胞增殖停滞在G1期, 提示氯通道可能在细胞增殖由G1期过渡到S期这一过程中起重要作用。

[Ca2+]i在细胞增殖活动中起重要作用。细胞由静息期到增殖活动期、G/S的过渡过程、 S期及分裂停止等都与Ca2+有关[8]。Ca2+影响细胞增殖活动与Ca2+/CaM依赖性信号转导途径有密切关系,抑制钙信号转导途径可导致细胞增殖停滞在G1期, 从而阻断细胞周期的正常进行[9,10]。本研究观察到NFA能显著地降低[Ca2+]i, 使细胞增殖停滞在G1期, 提示NFA抑制细胞增殖可能是通过影响Ca2+/CaM依赖性信号转导途径起作用, 其详细机制还需要进一步研究。

NFA是一种常用的Cl- 通道阻断剂。 目前发现, 它对多种Cl- 离子通道均有阻断作用, 如钙激活Cl- 通道、容积敏感型Cl- 通道以及囊性纤维跨膜电导调节体(CFTR Cl- 通道)等。 同时研究还表明, 它对其它非Cl- 通道也产生影响[11]。Cl- 通道阻断剂影响其它离子通道活动是一种普遍现象。最近我们在心肌上发现, 阴离子替代Cl- 和Cl- 通道阻断剂(包括NFA)对Ca2+通道的影响可能涉及到Cl- 通道对Ca2+通道的直接调控作用, 即Cl- 通道阻断剂通过抑制Cl- 通道, 继而导致Ca2+通道活性降低, 使细胞内Ca2+ 减少[11]。本文结果显示, NFA对癌细胞[Ca2+]i的影响与在心肌细胞上所观察到的现象非常相似, 提示NFA的作用机制可能涉及Cl- 通道与Ca2+通道之间的相互作用, 这一假设目前正在进一步验证当中。

Cl- 通道广泛地分布于各种细胞质膜上, 它们除了在细胞的电活动中起重要作用外, 还与细胞其它的生理活动有关, 例如, 参与细胞的容积和细胞内pH的调节， 在细胞的增殖和细胞迁移等活动中都发挥一定的作用[12]。因此, 深入研究Cl- 通道与肿瘤细胞增殖的关系, 对于了解肿瘤细胞生理和开发新的抗肿瘤增殖药物有一定意义。

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