生理学报Acta Physiologica Sinica, April 25, 2003, 55(2): 165-170
Received 2002-07-01
Accepted 2002-12-06
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30170353).
*Corresponding author. Tel: +86-29-3374521; E-mail: chisumin@yahoo.com
研究论文
ACh对人垂体腺瘤细胞内蛋白激酶C、
胞内游离钙及cAMP/cGMP的影响
迟素敏1,*, 李承新2, 刘亚莉1, 朱运龙1, 顾建文3
第四军医大学 1生理学教研室、 2西京医院全军皮肤性病中心、 3西京医院脑外科, 西安 710032
摘要: 我们曾发现ACh可明显地抑制垂体腺瘤细胞的增殖代谢, 为深入探讨ACh抑制垂体腺瘤细胞增殖作用的机制, 观察了ACh作用后垂体腺瘤细胞内蛋白激酶C (PKC)、 [Ca2+]i 及cAMP/cGMP的变化。结果发现: (1)与空白处理组相比, 使用PKC的激动剂PMA处理培养的人垂体腺瘤细胞时可使胞浆、 胞膜和细胞总PKC活性浓度均升高, 但ACh (10 μmol/L) 作用15 min后, 胞浆、 胞膜和细胞总PKC活性均下降, 且此作用可被阿托品阻断; (2) ACh (10 μmol/L)作用于单个人垂体腺瘤细胞后, 立即使垂体腺瘤细胞[Ca2+]i相对水平降低, 但此作用可被阿托品阻断; (3) ACh作用于人垂体腺瘤细胞15 min后, 胞内cAMP水平均明显升高, 而cGMP没有改变。该结果为探讨ACh抑制垂体腺瘤细胞增殖的分子机制提供了重要线索, 同时提示, ACh对垂体瘤细胞增殖分化的调控作用是细胞内多信息系统相互整合的结果。
关键词: ACh; 垂体腺瘤; 蛋白激酶C; [Ca2+]i; cAMP/cGMP
中图分类号: Q453; R335
Influence of ACh
on the level of protein kinase C, intracellular free Ca2+ and cyclic AMP/cyclic
GMP of cultured human pituitary adenoma cells
CHI Su-Min1,*, LI Cheng-Xin2, LIU Ya-Li1, ZHU Yun-Long1, GU Jian-Wen3
1Department of Physiology, 2Center of Dermatology of Chinese PLA, Xijing Hospital and 3Department of
Neurosurgery, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032
Abstract: We found previously that ACh can significantly inhibit the proliferation of cultured human pituitary adenoma cells. In order to make a further investigation of the mechanism of the inhibitory effect of ACh on the proliferation of pituitary adenoma cells, we observed the levels of protein kinase C (PKC), [Ca2+]i and cAMP/cGMP in cultured pituitary adenoma cells after treatment with ACh. The results demonstrate that (1) compared with control, PMA, a PKC activator, increased the activity of cytoplasm, membrane and total PKC in human pituitary adenoma cells. However, after a 15-min treatment with ACh (10 μmol/L), a significant reduction of the activity of cytoplasm, membrane and total PKC in human pituitary adenoma cells was observed, and the reduction effect could be blocked by atropine. (2) The level of [Ca2+]i of single adenoma cells was found to decrease immediately on the addition of ACh (10 μmol/L), which could also be blocked by atropine. (3) ACh increased the amount of cAMP in the cytoplasm of human pituitary adenoma cells, but had no effect on that of cGMP. These data provide an important clue to explore the molecular mechanisms of the inhibitory effect of ACh on the proliferation of pituitary adenoma cells, and suggest that the modulating effect of ACh on the proliferation of pituitary adenoma cells results from the interactions of several cellular signaling pathways.
Key words: ACh; pituitary adenoma; PKC; [Ca2+]i; cAMP/cGMP
虽然垂体腺瘤绝大多数为良性, 但有三分之一为侵袭性, 更有一少部分(约1％)可转变为恶性肿瘤[1]。其形成是在垂体细胞首先发生突变(编码G蛋白α亚单位的基因存在突变)的基础上, 然后在内外因素的促进下突变的细胞增生、 发展为垂体腺瘤。研究表明, 下丘脑的促激素和垂体内的旁分泌因子可能在垂体腺瘤形成的促进阶段起重要作用[2]。这些旁分泌因子包括ACh、 激活素、 神经肽、 生长因子、 细胞因子、 催乳素片段等。既往研究表明, 多种动物的正常垂体前叶细胞及肿瘤细胞都可以合成和分泌ACh。正常的促肾上腺皮质激素细胞及其肿瘤细胞均能合成并释放ACh[3]。大鼠GH3细胞也能释放ACh, 当对实验中的GH3细胞停止灌流时, GH3细胞释放的ACh会逐渐升高并表现出对GH3细胞的影响, 而一旦加入阿托品后ACh的影响则立即消失[4,5]。Strien在对蟾蜍的研究中, 发现促黑素细胞内均含有胆碱乙酰转移酶(ChAT), 可在体外合成ACh, ACh并能增加促黑素细胞的活性[6]。我们应用免疫组织化学的方法, 也发现在人的正常垂体前叶细胞及人无功能瘤、 催乳素瘤和生长激素瘤等三种垂体腺瘤细胞的胞浆内均明显存在ChAT阳性染色[7]。尽管ACh能够明显地影响垂体的分泌功能, 但由于实验方法的不同以及所使用的实验对象的不同, 众多学者所观察到的结果尚未取得一致性的认识[8-10]。而ACh对垂体前叶细胞增殖代谢的影响的研究资料更少, 仅Fedotov观察了ACh对不同年龄组大鼠垂体细胞总蛋白及DNA合成的影响, 结果发现, ACh可减少青春期大鼠垂体细胞总蛋白合成, 但对新生鼠无影响, 而且ACh对新生鼠垂体细胞DNA合成亦无影响[11]。近来资料表明, 鼠垂体前叶细胞表面存在着功能性的M型胆碱能受体[12], 该受体可以调节GH3细胞的Ca2+的振荡频率[13] , 提示ACh能够以旁分泌或自分泌的方式作用于垂体前叶细胞。我们曾通过体外实验发现, ACh对三种垂体腺瘤: 催乳素瘤、 无功能瘤和生长激素瘤都具有明显的抑制细胞增殖代谢的作用, 而且, 这种抑制作用可被ACh M受体拮抗剂阻断, 但ACh N受体拮抗剂对此作用无影响[7]。为深入探讨ACh抑制垂体腺瘤细胞增殖作用的机制, 我们观察了ACh作用后垂体腺瘤细胞内蛋白激酶C (PKC)、 [Ca2+]i 及cAMP/cGMP的变化。
1材料和方法
1.1 材料
新鲜人垂体腺瘤手术标本12例, 无功能瘤4例, 催乳素瘤4例, 生长激素瘤4例, 由西京医院神经外科提供, 诊断均经临床表现和病理组织学检查证实。将手术取下的瘤组织置于无菌生理盐水中暂时保存。
1.2 主要试剂和药品
ACh、 胶原酶、 胰蛋白酶、 DNA酶、 Fluo-3/AM和佛波酯(PMA)均购自Sigma公司; DF-12培养基、 PKC检测试剂盒购自美国Gibco公司; 新生牛血清为杭州四季青生物制品公司产品; cAMP、 cGMP放免试剂盒购自上海中医药大学。
1.3 垂体腺瘤细胞的分离和培养
具体方法参见文献[7]。简述如下, 在超净台内, 用DF-12培养液清洗瘤组织后置于青霉素小瓶中剪碎至糊状, 分别加入胰蛋白酶、 胶原酶和DNA酶各5 ml, 于37℃水浴振摇消化25 min, 终止消化、 过滤, 离心弃上清, 加DF-12培养液轻轻吹起细胞, 再离心, 加含100 ml/L胎牛血清的DF-12培养液, 接种于6孔板和培养皿, 在37℃, 50 ml/L CO2及饱和湿度条件下培养。24 h换液, 之后48 h再换液1次。
1.4 PKC活性的检测
培养皿培养细胞, 培养至第6 d换无血清DMEM培养液, 24 h后加药处理, 药物作用15 min后吸弃培养液, 加入冰冷的Tris buffer (20 mmol/L Tris, pH 7.4, 0.5 mmol/L EDTA, 0.5 mmol/L EGTA)洗1次, 再加入1 ml Tris buffer终止。刮取细胞, 离心(1000 r/min, 5 min), 弃上清, 于-70℃冻存。每管细胞中加0.5 ml buffer A′(不含Triton的buffer A)。以超声破碎细胞。100 g离心5 min, 取上清。1×105 g离心, 30 min。 分开上清与沉淀: (1)上清为细胞浆; (2)沉淀加buffer A, 振摇45 min, 1×104 g离心, 20 min, 上清为细胞膜。以上操作均在冰上进行。用紫外分光光度仪测定每管中蛋白含量。加入同位素32磷, 建立反应体系(每管蛋白量相同)。点膜、 洗膜、 烤干, 闪烁计数(每管加闪烁液1 ml)。计算单位体积中PKC的摩尔浓度。计算变化率, 变化率＝(实验组PKC摩尔浓度值/对照组PKC摩尔浓度值)×100％。
1.5 细胞内钙的测定
将垂体腺瘤细胞以2×108/L的浓度接种于特制的培养皿上, 24 h换液, 之后每隔48 h换液1次, 培养至第6 d换无血清DMEM培养液, 24 h后用Hank′s液洗涤细胞2次, 在37℃, 避光条件下用Fluo-3/AM (10 μmol/L)荷载, 30 min后用Hank′s液洗涤2次, 洗去残余染料, 在镜下找到荷载好的细胞后, 用共聚焦显微镜扫描加药前细胞内[Ca2+]i荧光强度, 然后向培养皿的中心滴加不同的试剂100 μl, 用共聚焦显微镜动态扫描加药后细胞内[Ca2+]i荧光强度的变化。以背景的荧光强度为对照, 加药前后的细胞荧光强度与背景的荧光强度相比较, 而获得相对的变化趋势来判断加药前后细胞内[Ca2+]i荧光强度的变化。
1.6 cAMP和cGMP的检测
6孔板培养细胞, 培养至第6 d换无血清DMEM培养液, 24 h后加药处理, 药物作用15 min后吸弃培养液, 立即加入1 ml 0.24 mol/L (4℃)的高氯酸沉淀蛋白, 以自制的橡皮刮器刮取、 收集细胞, 在冰浴中, 用玻璃匀浆器匀浆, 离心(4℃, 3000 r/min, 15 min), 取上清, 以KOH调pH至6.3左右, 冰浴中放置片刻, 出现白色高氯酸钾沉淀后再离心(2000 r/min, 10 min), 取上清, -20℃保存。按照试剂盒说明书, 在各个试管中分别加入醋酸缓冲液、 标准品、 样品、 乙酰化试剂、 125I、 抗cAMP/cGMP血清, 摇匀后, 于4℃保存过夜。离心(3000 r/min, 15 min)后, 负压吸去上清, 用γ计数器测量沉淀的放射性强度。绘制标准曲线, 灵敏度好于0.01 nmol/L, 标准曲线范围为0.087、 0.156、 0.312、 0.625、 1.25、 2.5、 5、 10和20 nmol/L。根据标准曲线采用RIA数据处理软件得样品中cAMP及cGMP的绝对含量。然后计算变化率, 变化率＝(实验组cAMP或cGMP的绝对含量/对照组cAMP或cGMP的绝对含量值)×100％。
1.7 实验分组及统计学分析
所有数据均以mean±SD表示, 两组间均数比较用t检验处理, 多组间均数采用Origin 5.0软件中单因素方差分析进行统计学处理。
2结果
2.1 ACh对胞浆和胞膜PKC活性的影响
各组样本均为12, 三种垂体腺瘤各4例。对照组的胞浆、 胞膜和细胞总PKC活性浓度分别为200.48±10.23、 71.85±9.81和267.04±8.14 pmol/L。ACh (10 μmol/L)作用15 min后, 胞浆、 胞膜和细胞总PKC活性均下降(P<0.01), 此作用可被阿托品阻断。PKC的激动剂PMA则使胞膜和细胞总PKC活性浓度均升高, 而使胞浆的PKC活性浓度稍微下降(P<0.01, 表1)。
表1. ACh对垂体腺瘤细胞内PKC活性的影响
Table 1. Effect of ACh on the PKC activity of cells (μmol/L, mean±SD)
|
Group |
n |
PKC (membrane) |
PKC (cytoplasm) |
PKC (total) |
|
Control |
12 |
71.85±9.81 |
200.48±10.23 |
267.04±8.14 |
|
ACh (10 μmol/L) |
12 |
21.54±6.58* |
56.75±6.81* |
80.62±10.07* |
|
ACh+atropine (10 μmol/L) |
12 |
68.64±11.52 |
208.36±9.04 |
285.56±10.28 |
|
PMA (1 μmol/L) |
12 |
186.26±13.14* |
164.32±9.87* |
357.18±11.63* |
*P<0.01 vs control.
2.2 ACh对细胞内钙的影响
由图 1A看出, 与背景荧光钙强度(曲线a)相比较, 垂体腺瘤细胞[Ca2+]i相对水平在仅加入空白培养基的前(21.36±0.18 U) 、 后(18.22±0.35 U)无明显变化(P>0.05)。但ACh (10 μmol/L)可使垂体腺瘤细胞[Ca2+]i相对水平迅速降低。加入ACh (10 μmol/L)前, 垂体腺瘤细胞[Ca2+]i相对水平为27.30±0.21 U, 加入ACh 13 s后其相对水平降至12.42±0.12 U, 而90 s后则降至3.9±0.10 U (图1B, P<0.01)。然而, 与仅加入ACh相比, 如同时加入Atropine则可以明显地阻断ACh引起的[Ca2+]i水平下降, 此时与背景荧光钙强度(曲线a)相比较, 垂体腺瘤细胞[Ca2+]i相对水平在加入ACh+atropine (10 μmol/L)的前(18.86±0.28 U)、 后(18.24±0.46 U)无明显变化(图1C, P>0.05)。表明Atropine可阻断ACh对垂体腺瘤细胞[Ca2+]i的影响。
表2. ACh对垂体腺瘤细胞内cAMP 和 cGMP 水平的影响
Table 2. Effect of ACh on the cAMP and cGMP of pituitary adenoma cells (μmol/L, mean±SD)
|
Group |
n |
cAMP |
cGMP |
|
Control |
12 |
1.58±0.31 |
0.96±0.21 |
|
ACh (1 μmol/L) |
12 |
2.67±0.26* |
1.01±0.20 |
|
ACh (10 μmol/L) |
12 |
5.59±1.27* |
0.90±0.17 |
|
ACh+atropine (10 μmol/L) |
12 |
1.94±0.18 |
0.89±0.18 |
*P<0.01 vs control.
图1.加入ACh (10 μmol/L)和ACh+atropine (10 μmol/L)前后垂体腺瘤细胞内荧光光密度曲线
Fig. 1.Intracellular fluorescence intensity curves of pituitary adenoma cells after treatment with blank culture medium, ACh (10 μmol/L) and ACh+atropine (10 μmol/L) (n=6). a, background fluorescence intensity curve; b, c, d, the fluorescence intensity curves of pituitary adenoma cells. Arrows show the time of adding drug. A: Blank culture medium. B: ACh (10 μmol/L). C: Administration of ACh+atropine (10 μmol/L).
2.3 ACh对cAMP和cGMP的影响
各组样本均为12, 三种垂体腺瘤各4例。对照组胞内cAMP和cGMP的浓度分别为1.58±0.31 nmol/L和0.96±0.21 nmol/L。ACh (1、 10 μmol/L)作用15 min后, 胞内cAMP的浓度显著增加, 并随ACh作用浓度的增加而增加(P<0.01)。ACh增加胞内cAMP浓度的作用可被阿托品阻断。而ACh对胞内cGMP的浓度无显著性影响(表2)。
3讨论
大量资料表明, 作为组成垂体旁分泌网络的一个重要旁分泌因子, ACh能够以旁分泌或自分泌的方式作用于垂体前叶细胞, 从而调节垂体前叶细胞的分泌功能和增殖代谢。我们通过体外实验发现,
ACh对三种垂体腺瘤: 催乳素瘤、 无功能瘤和生长激素瘤都具有明显的抑制细胞增殖代谢的作用, 而且, 这种抑制作用可被ACh M受体拮抗剂阻断, 但ACh N受体拮抗剂对此作用无影响[7]。提示ACh对垂体腺瘤细胞增殖和代谢的抑制作用是通过M型受体起作用的。但是,
ACh是如何通过其M受体来调控细胞的增殖代谢仍不清楚。
在细胞增殖、 生长、 分化及癌变的信号转导中, PKC家族所催化的磷酸化反应处于信号传递通路的中心位置。在垂体腺瘤细胞中, PKC的表达水平及活性程度均高于正常人或大鼠垂体, 抑制PKC的活性可以明显地抑制垂体腺瘤细胞的生长[14]。而且,
侵袭性肿瘤中PKC的水平高于非侵袭性的垂体腺瘤, 表明PKC在垂体腺瘤的生长中起着重要作用[15]。我们的研究观察到, 与空白处理组相比, 使用PKC的激动剂PMA处理培养的人垂体腺瘤细胞可使胞浆、
胞膜和细胞总PKC活性浓度均升高, 但ACh (10 μmol/L)作用15 min后, 胞浆、 胞膜和细胞总PKC活性均下降,
且此作用可被阿托品阻断。表明ACh在与M受体结合后, 可引起人垂体腺瘤细胞PKC活性下降, 我们推测PKC活性的下降有可能是ACh抑制人垂体腺瘤细胞增殖的主要原因。
Ca2+是细胞内重要的信使物质。大量的研究发现,
许多细胞功能都与Ca2+密切相关, 虽然细胞在非激活状态时胞内游离Ca2+([Ca2+]i)浓度仅为0.1 μmol/L左右, 但胞内游离Ca2+浓度的改变却是细胞生理功能的关键环节。因此, 检测[Ca2+]i的水平变化对于了解细胞内信息传递有着重要的意义。虽然Pinter等观察到ACh和胆碱能受体激动剂可增加
[Ca2+]i [10], 然而在GH3细胞, M型胆碱能受体激动剂可以抑制PRL的分泌, 碳酰胆碱可以迅速降低GH3细胞内的[Ca2+]i水平, 当加入阿托品后,
胞浆内游离钙可以迅速恢复到原来水平, 同时碳酰胆碱可以降低所有GH3细胞平均的胞内游离钙, 并引起细胞膜的超极化 [16]。我们在实验中观察到, ACh
(10 μmol/L)作用于单个人垂体腺瘤细胞后, 立即使垂体腺瘤细胞[Ca2+]i相对水平降低。 该结果不仅与Schlegel的研究相一致,
而且Kushmerick的发现也支持我们的实验结果。Kushmerick[13]使用激光扫描共聚焦的方法测定单个GH3细胞内Ca2+振荡频率的变化。结果发现碳酰胆碱能够非常显著地降低Ca2+的振荡频率(约减少85％),
并且该作用可被阿托品阻断。假若在实验开始前先不对GH3细胞进行灌流, GH3细胞本身所释放的ACh也能够抑制细胞本身的Ca2+振荡频率, 此时给予阿托品灌洗则可观察到Ca2+的振荡频率有一个较小的、
但是有意义的增加。有研究表明, M受体激活的G蛋白能够直接作用于K+和Ca2+的离子通道, 胆碱能刺激可激活 “毒蕈碱”K+通道[17], 并抑制L-型Ca2+通道[18]。同时, K+离子通道在决定Ca2+振荡频率中起着重要作用, 阻断K+离子通道可以增加Ca2+振荡频率[13]。K+离子通道的开放可使细胞难以达到兴奋阈值,
而Ca2+离子通道的抑制会降低Ca2+的动作电位和振荡频率。因此, M受体激活可以降低细胞的电兴奋性, 这是由于离子通道的作用, 所以可以观察到胞内钙的迅速下降。
cAMP信使系统同样是细胞内一个重要的信息传递通路,
在细胞外信息分子调节细胞功能的过程中起着快速跨膜传递和放大信号的作用, 凡能使细胞内 cAMP含量升高的因素, 均能降低细胞的生长速度, 抑制细胞的增殖, 反之亦然。关于ACh对垂体前叶细胞内cAMP信使系统的影响,
由于观察的对象不同以及所使用的方法不同, 所得到的结果也不尽相同。在观察到ACh可以抑制大鼠垂体腺瘤GH3细胞分泌PRL和GH的同时, 有学者注意到, ACh可降低GH3细胞内腺苷酸环化酶(AC)的活性,
并抑制细胞内cAMP的产生, 推测cAMP的降低是ACh抑制GH3细胞分泌PRL和GH的机制之一[19]。由于ACh对垂体前叶细胞分泌功能的影响尚无定论, 因此有关该机制的研究尚需进一步验证。新近的一项研究表明,
ACh对GH3细胞胆碱能受体的持续激活可导致腺苷酸环化酶活性增高, 引起细胞内cAMP水平的明显升高, 并可以促使VIP、 forskolin等诱导cAMP产生,
这种作用不但可以被碳酰胆碱模拟, 而且可被阿托品所阻断[20]。我们在实验中观察到ACh作用于人垂体无功能瘤、 催乳素瘤和生长激素瘤等三种垂体腺瘤细胞15
min后, 胞内cAMP水平均明显升高, 而cGMP水平没有改变, 与Chou的结果基本相一致。目前认为, M1和 M3在与ACh结合后, 主要与G蛋白中的Gs蛋白结合,
激活AC, 使细胞内 cAMP增加, 进而激活蛋白激酶 A, 导致细胞膜上K+传导下降。迄今为止, 在垂体前叶细胞膜表面尚未发现M2受体。 因此, 我们有理由相信，
ACh作用于三种垂体腺瘤细胞表面的M1和/或M3受体后, 可能通过与 Gs蛋白结合, 激活AC, AC再催化ATP生成 cAMP, 使细胞内 cAMP增加。
细胞内通讯网络系统的相互关系是非常密切和复杂的, 某一信号在胞内的传递往往不是局限在某一单独的信息传递系统内, 而是涉及其它系统, 一定的胞外刺激所产生的细胞效应往往是细胞内各信息系统相互作用的结果。因此, 完全阐明ACh调控垂体腺瘤细胞增殖代谢的作用机制， 尚需大量的、 细致的研究工作。
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