生理学报Acta Physiologica Sinica,  April  25, 2003, 55(2): 183-186

Received 2002-07-22

Accepted 2002-12-03

This work was supported by the National Natural  Science Foundation of China (No.30170469)

*Corresponding author. Tel: +86-21-25070328×8701; Fax: +86-21-65492132;   E-mail:  loushujie@hotmail.com

 

 研究论文

肿瘤坏死因子-α对大鼠中脑神经干细胞分化和寡突胶质细胞增殖的影响

娄淑杰1,*,    顾平1,2, 徐荷3,   徐晓辉1, 王铭维2,  何成1,  路长林1

1第二军医大学神经生物学教研室, 上海 200433; 2河北医科大学第一医院神经内科, 石家庄 050013; 3第二军医大学流行病学教研室, 上海  200433

 

摘要:   为观察肿瘤坏死因子对神经干细胞(NSCs)分化的影响, 本研究应用体外扩增的新生大鼠中脑NSCs, 使用免疫组织化学技术, 观察了肿瘤坏死因子-α  (TNF-α )对NSCs分化及其后代细胞的影响。结果显示: (1) TNF-α 可提高中脑NSCs后代中神经元和寡突胶质细胞所占的比例; (2) TNF-α 可明显诱导由NSCs分化的寡突胶质细胞增殖, 但对星形胶质细胞的增殖作用不明显。上述观察结果提示TNF-α 对NSCs的应用具有重要影响。

 

关键词: 肿瘤坏死因子-α; 神经干细胞; 寡突胶质细胞; 分化

中图分类号: Q426

Effect of  tumor necrosis factor-α  on differentiation of mesencephalic neural stem cells and proliferation of oligodendrocytes in the rat

LOU Shu-Jie1,*,   GU Ping1,2,    XU He3,  XU Xiao-Hui1,  WANG Ming-Wei2,  HE Cheng1,   LU Chang-Lin1

1Department of Neurobiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433;

2Department of Neurology, First Hospital, Medical University of Hebei, Shijiazhuang 050013;

3Department of Epidemiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433

 

Abstract:  To observe the influence of  tumor necrosis factor-α  (TNF-α)  on differentiation of rat mesencephalic neural stem cells (NSCs), the numbers of neurons, astrocytes and oligodendrocytes generated from NSCs were  analyzed after differentiation for 3 days by using immunocytochemistry technique. The results show that: (1) TNF-α  enhanced the proportions of neurons and oligodendrocytes in progeny of NSCs; and (2) TNF-α   induced the proliferation of oligodendrocytes derived from NSCs, but the proliferation of astrocytes was not influenced by TNF-α. We conclude that the TNF-α  could influence the application of NSCs.

 

Key words: TNF-α; neural stem cells; oligodendrocytes; differentiation

 

继神经干细胞(neural stem cells, NSCs)从小鼠纹状体成功分离和体外扩增后, 人们又陆续在哺乳动物及人的不同脑区体外分离到了NSCs, 说明成熟的中枢神经系统确实具有神经再生的潜能[1,2]。基于NSCs的迁移和分化是一个受细胞内外诸多因素影响的复杂过程, 人们目前还无法做到定向扩增、 迁移和分化脑内的NSCs, 所以体外移植便成为应用NSCs治疗神经系统疾病的首选策略。而使用NSCs进行细胞替代治疗或进行转基因治疗时, 在脑内事先已存在损伤, 以及手术操作引起的损伤等都可引起局部TNF-α 表达的增加。所以, 无论是体内还是体外移植的NSCs都势必会受到TNF-α 的影响。那么, TNF-α 对NSCs的存活和分化是否产生影响, 对NSCs的后代影响又如何, 目前还未见相关报道。

 

1材料和方法

1.1 试剂和动物

B27添加剂、 DMEM/F12 (1∶1)、 Neurobasal培养基、 DMEM为Gibco公司产品。胎牛血清和小牛血清为杭州四季青公司产品, GFAP抗体购自DAKO公司, 多聚赖氨酸、 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、 TNF-α, Hoechst33258、 其它各种一抗和二抗购于Sigma公司。SD幼鼠购自第二军医大学动物中心。

1.2 NSCs的分离培养

取新生SD大鼠中脑, 用D-Hank氏液漂洗, 在解剖显微镜下剥离脑膜后将脑组织剪碎, 用火焰刨光的玻璃吸管反复吹打, 机械分离制成单细胞悬液。台盼蓝染色后细胞计数, 以5×104/ml的密度将细胞种植于25 ml培养瓶中。培养液采用DMEM/F12(1∶1)添加2％B27的无血清培养基, 同时加入20 μg/ml bFGF。将培养瓶置于CO2孵箱(37℃, 5% CO2/95% O2)孵育。此后, 每4 d换液1次, 每次更新培养液的一半; 每5-7 d传代1次, 传代时采用机械分离的方法, 培养液同前。一般在分离培养7 d左右,  单个的NSCs便可增殖形成球体。

娄淑杰等: TNF-α对大鼠中脑神经干细胞分化和寡突胶质细胞增殖的影响生理学报Acta Physiol. Sin.,  April 25, 2003, 55(2): 183-1861.3 细胞免疫化学染色

按常规进行细胞的免疫化学染色以对细胞的种类加以鉴定。所用一抗分别为鉴定神经元的鼠源MAP-2(microtubule associated protein-2)抗体、 鉴定星型胶质细胞的兔源GFAP (glial fibrillary acidic protein)抗体和鉴定寡突胶质细胞的鼠源CNPase (2′,3′-cyclic nucleotide 3′-phosphohydrolase)抗体。所用二抗分别为FITC标记的抗兔IgG抗体和TRITC标记的抗鼠Ig G 抗体。

1.４ 细胞计数和统计学处理

为确定表达某特殊抗原的细胞数量, 细胞经免疫荧光染色后, 在倒置荧光显微镜(Olympus IX70)下每孔随机选择15-20个不同的视野, 使用CCD相机(Princeton Instruments,Inc. MicroMAX 5 MHz system)采样, 分别计数MAP-2、 CNPase和GFAP阳性的细胞数量。为确定神经元、 星型胶质细胞和寡突胶质细胞所占的比例, 每一视野内NSCs后代细胞总数通过计数Hochest33258 染色阳性细胞决定, 然后计算每种抗原阳性细胞在Hochest33258阳性总细胞中所占的比例。将3次独立实验的计数结果用SPSS软件进行统计学分析, 实验组和对照组之间采用Student′s t 检验进行显著性分析。

 

2  结果

2.1 TNF-α 对中脑NSCs分化的影响

为观察TNF-α 对NSCs分化的影响, 先将增殖状态的NSCs接种于铺被多聚赖氨酸、 直径为35 mm的培养皿内, 大约1 h后神经球贴壁, 将含有bFGF的培养基撤去, 更换为含2% B27的Neurobasal 培养基。实验组内同时给予不同浓度的TNF-α 并持续处理细胞一段时间, 免疫染色发现, 用TNF-α 处理细胞6 d时, 除可提高NSCs后代中神经元的比例外, 还可明显提高寡突胶质细胞的比例(图1)。此外, 5000、 500 和200 U/ml的TNF-α 对中脑NSCs分化的影响没有明显区别(结果未显示)。所以, 在后面的实验中TNF-α 使用浓度皆为200 U/ml。

图1.TNF-α 对新生大鼠中脑NSCs分化的影响

Fig. 1.Influence of TNF-α on differentiation of mesencephalic NSCs of new born rats.  Data are presented as mean±SD;  * denotes the values significantly different from control (P<0.01). TNF+, 200 U/ml TNF-α treated group.

2.2 TNF-α 可促进寡突胶质细胞的增殖

在培养过程中, 在TNF-α 处理组可见寡突胶质细胞的数量有逐渐增加的趋势, 这些新产生的细胞迁移距离很短, 所以, 细胞呈聚集状态存在, 随着时间的延长, 细胞团也逐渐变大(图2)。当细胞团增大到一定程度时, 聚集的细胞开始死亡, 进行CNPase荧光染色时, 细胞团中央死去的细胞将不再着色。所以, 随着培养时间的延长, 尽管寡突胶质细胞在不断增殖, 却出现寡突胶质细胞的比例反而下降的现象(图3)。

图2.TNF-α 对寡突胶质细胞的增殖效应

Fig. 2.  Effect of TNF-α on proliferation of oligodendrocytes.  Representative images of CNPase positive cells in control (A) and   TNF-α  treated group. Scale bar, 300 nm.

图3.TNF-α 对寡突胶质细胞增殖作用的时间-效应关系

Fig. 3.Time-course of the effect of TNF-α on proliferation of oligodendrocytes.Data are presented as mean±SD;  * denotes the  values significantly different from control (P<0.01). TNF+,  200 U/ml TNF-α treated group.

 

3  讨论

研究表明TNF-α 兼具神经保护和神经毒性的双重作用。如TNF-α 可降低兴奋性氨基酸引起的海马神经元损伤及保护神经元免受Aβ蛋白的毒性作用[3,4], 而细菌内毒素等引起的神经元损伤依赖于TNF-α 的存在也是比较肯定的事实[ 5 ]。同时, TNF-α 还是星型胶质细胞和小胶质细胞的激活剂, 可引起这两种细胞增殖并分泌一些生物活性物质[6,7]。但在本实验中却未发现TNF-α 可明显诱导星形胶质细胞增殖的作用。不知这是否与NSCs分化后使用Neurobasal培养基有关。同样, TNF-α 也具有调节寡突胶质细胞功能的生物学活性, 从而与寡突胶质细胞的成髓鞘功能密切相关。如脑室内注射TNF-α, 1 d后可引起成熟寡突胶质细胞数量的明显降低, 但在注射后2-7 d可引起寡突胶质细胞前体的渐进性增加[8]。提示TNF-α 对髓鞘可产生两方面的影响, 一方面通过引起寡突胶质细胞的死亡, 引起脱髓鞘过程; 另一方面则通过诱导寡突胶质细胞前体的增殖, 提供更多成熟的寡突胶质细胞, 从而促进寡突胶质细胞成髓鞘的功能。在缺失TNF-α 及其受体的小鼠, 在使用毒性物质cuprizone诱导脱髓鞘病变后, 发现TNF-α 及其受体的缺失可明显延缓髓鞘再生的出现。而出现这种现象的原因即为寡突胶质细胞前体不能受TNF-α 刺激而增殖, 进而不能提供足够数量的成熟寡突胶质细胞, 进一步证实TNF-α 作用的双向性[9]。至于以何种效应为主, 则可能受TNF-α 浓度和作用时间的影响。如TNF-α 在浓度较低时发挥的是正常调节作用, 但在高浓度时则体现为毒性作用[10]。而NSCs可在体内外分化为神经元、 星形胶质细胞和寡突胶质细胞, 因此, TNF-α 对NSCs及其后代的影响可直接影响NSCs的应用效果。

本研究中, 在NSCs分化后6 d, TNF-α 处理组内的神经元和寡突胶质细胞在NSCs后代中所占的比例明显高于对照组, 因神经元不存在增殖的问题, 提示TNF-α 可诱导NSCs较多分化为神经元, 这还有待于进一步研究; 但寡突胶质细胞的高比例则源自于增殖作用, 一方面TNF-α 可在作用于寡突胶质细胞48 h后便可引起增殖[8],  另一方面我们在显微镜下直接观察到了寡突胶质细胞数量逐渐增加的现象(图2)。一般认为CNPase为成熟寡突胶质细胞的标记物, 所以常与MBP (myelin basic protein)一起用于标记成熟的寡突胶质细胞, 而O4和A2B5则用于标记寡突胶质细胞前体[11]。但研究发现CNPase也表达于寡突胶质细胞的前体细胞, 可与 PDGF-α 受体共存[12]。所以, 本文所报道的CNPase阳性细胞增殖现象可能便是寡突胶质细胞前体的增殖, 事实上, 作者也观察到在CNPase阳性细胞增殖成簇后, 细胞会逐渐发生死亡。至于这些死亡的细胞是否为表达MBP的成熟寡突胶质细胞, 是否被TNF-α 杀死, 则有待于今后进一步实验的验证。总之, 本文的结果充分提示TNF-α 对NSCs分化及其后代细胞-寡突胶质细胞具有重要影响, 而这些无疑会影响NSCs的应用效果。

 

参考文献

 

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