生理学报Acta Physiologica Sinica,  April  25, 2003, 55(2): 191-196

Received 2002-07-31

Accepted 2002-10-10

This work was supported by the Major State Research Development Program of People′s Republic of China (G2000056906) and the Natural Science Foundation of China (30070872).

*These authors contributed equally to this work.

**Corresponding author. Tel: +86-10-62092306; Fax: +86-10-62017700;  E-mail: zhangyy@bjmu.edu.cn

 

 研究论文

大鼠成长期左心室基因表达谱的变化

李平*, 李劲梁*, 候嵘, 韩启德, 张幼怡**

北京大学第三医院血管医学研究所, 分子心血管学教育部重点实验室, 北京 100083

 

摘要:  为观察大鼠发育成熟过程中心脏生长与其基因表达谱变化的关系, 应用超声心动术检测8、 10、 12周龄Wistar大鼠的心脏结构和功能指标, 应用cDNA基因芯片技术观察心脏基因表达水平的变化。大鼠从8周龄生长至12周龄, 体重增加约45.7% (287±13 g vs 197±10 g), 前2周和后2周增加幅度相近。心脏左心室重量和室壁厚度分别增加约27.7% (0.60±0.03 g vs  0.47±0.02 g)和23.6% (2.04±0.04 mm vs  1.65±0.13 mm), 前2周增加幅度明显大于后2周。基因表达谱的改变涉及细胞结构、代谢、氧化应激及信号转导等多方面的基因。10周龄和8周龄大鼠比较, 变化的基因多数上调; 12周龄和10周龄大鼠比较, 基因表达谱基本又返转至8周龄水平。结果表明, 大鼠在成长期的4周内(8-12周龄), 左心室基因表达谱发生的变化适应生理性心肌生长需要。

 

关键词: 生理学; 基因表达; 基因芯片; 心脏; 生长

中图分类号: Q463

 

Changes in the gene expression profile  of the  left heart  ventricle during growth in the rat

LI Ping*,  LI Jin-Liang*, HOU Rong, HAN Qi-De, ZHANG You-Yi**

Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, The Key  Laboratory of   Education Ministry on Molecular Cardiology, Beijing 100083

 

Abstract:  Wistar rats of 8, 10 and 12-week-old  were chosen for  study of the relationship between cardiac growth and its gene expression profile changes during maturation. The ultrasonic parameters of rat hearts were recorded before sacrifice, then total RNA of left ventricle were extracted and gene expression profiles were analyzed by cDNA microarray. During growth from 8 weeks to 12 weeks, the body weight increased by 45.5% (287±13 g vs  197±10 g), and the increment in the first two-week period was equal to that of the second two-week period. The mass of left ventricle and the posterior wall thickness increased by 27.7% (0.60±0.03 g vs  0.47±0.02 g) and 23.6% (2.04±0.04 mm vs  1.65±0.13 mm), respectively, and their increment in the first two-week period was much more than that in  the second one. Meanwhile, the gene expression profile of the left ventricle changed significantly, which involved cellular structure, metabolism, oxidative stress, signal transduction, etc. Compared with the 8-week-old  rats, these genes were mostly up-regulated in 10-week-old  rats, while for 12-week-old  rats, the gene expression profile of the left ventricle recovered to the pattern of 8-week-old  rats again on the whole. These results suggest that the relationship between the changes in  cardiac function and  gene expression profile can be analyzed comprehensively with the technique of microarray, and that the changes in  gene expression profile of the left ventricle during rat maturation adapt to the physiological growth of heart, which is of benefit for keeping the metabolism balance between materials and energy.

 

Key words: physiology; gene expression; microarray; heart; growth

 

心脏在个体出生后主要以肥厚的形式适应负荷变化。病理性心肌肥厚作为一种代偿性反应, 被认为与心力衰竭的发生发展密切相关, 而同为代偿过程的生理性心肌肥厚却不发展成心力衰竭。研究表明, 病理性肥厚心肌在受到致生理性肥厚因素刺激后, 如运动训练或给予低剂量甲状腺素, 均能延缓其失代偿的演变进程, 当病理性心肌肥厚过程被诱导为生理性肥厚时, 可能抑制心力衰竭的发生[1,2]。因此, 对生理性和病理性心肌肥厚过程的比较和调控机制的研究具有重要意义。目前研究者对运动训练等引起的生理性心肌肥厚过程已有一定的认识, 而对另一种更为广义的心肌生理性肥厚过程, 即伴随发育成熟过程的心肌肥厚的研究较少。作为生理负荷变化的适应反应, 该过程应该是研究心肌肥厚过程维持内部自我平衡机制的天然模型。本实验利用高通量的基因芯片技术, 观察了大鼠在生长成熟过程中心脏的生长变化及其心室基因表达谱的变化。

 

1材料和方法

1.1 动物及处理

SPF级8、 10、 12周龄雄性Wistar 大鼠由本校实验动物中心提供。处死前对大鼠行超声心动图检查(北京大学第三医院超声心动室, Acuson公司Sequoia C256 超声仪)。 线阵探头频率8 MHz, 选择探测深度2 cm。实验大鼠应用氯胺酮及戊巴比妥混和制剂腹腔注射麻醉, 刮去胸前体毛并仰卧固定, 连接Ⅱ导心电图。探头轻置胸前, 二维显示心底短轴及左室短轴近乳头肌水平, 在二维超声指导下应用M型超声分别记录主动脉、 左心室、 室间隔及后壁曲线, 扫描速度为100 mm/s, 测量3个心动周期计算均值, 记录左室内径, 室壁厚度及收缩分数[3]。然后颈椎脱臼处死, 取下左心室, 称重, 液氮冻存。

1.2 基因芯片检测

采用Genetic research公司的cDNA微阵列(microarray)尼龙膜(大鼠, GF300), 本膜含5184个cDNA 克隆, 其中33%为已知基因, 其余为表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)(www.resgen.com)。采用TRIZOL试剂盒, 按说明书提取各组动物左心室总RNA。探针标记和纯化、预杂交、杂交、洗膜、扫描成像均按照Genetic research公司的操作流程进行[4]。步骤简述: 等量混合4-6只大鼠左心室的总RNA, 取出混合后的总RNA 8 μg, 以300单位Superscript Ⅱ逆转录酶, 3.7 MBq 33P-dCTP(Amersham)和 2 μg Oligo dT 37℃温育90 min进行逆转录标记。每个反应体积共30 μl, 含1×First strand buffer, 3.3  mmol/L DTT, 1  mmol/L dNTP(含dATP、 dGTP、 dTTP)。标记探针按QIAquik试剂盒操作说明书进行纯化。将Microarray尼龙膜预先在煮沸的0.5% SDS中漂洗5-10 min, 置于杂交管中, 加入MicroHyb杂交液, 以小鼠Cot-1 DNA及Poly dA作为封闭剂, 于42℃预杂交2 h。将纯化好的探针变性后加入杂交管, 于42℃杂交18 h。杂交结束后, 2×SSC, 1% SDS 50℃洗膜2×20 min,  0.5×SSC, 1% SDS 55℃洗膜15 min。将尼龙膜放入暗盒中, 覆盖Storage Phosphor Screen, 室温曝光48 h后用Cyclone Storage Phosphor Scanner (Packard)图像扫描。每个样品重复杂交2次, 平行对比样品的杂交实验同批进行, 以减少杂交操作误差。以上所用试剂除特殊指出外均为Invitrogen公司产品。

1.3数据处理

扫描成像后得到的图像文件输入Pathway3.0分析软件(Genetic research公司)中, 以杂交点面积的75%采样, 得到每一个点的原始杂交信号强度值(raw intensity)和校正的强度值(normalized intensity)。后者为各点原始杂交信号强度值除以膜上所有点总强度的平均值得到的数据。为降低非特异信号的干扰, 筛选在杂交结果中校正杂交信号强度在前50%的克隆2867个(包括已知基因和ESTs )进行分析, 计算不同膜上相同位置克隆的校正杂交信号强度的比值(Ratio值)。取同一样本RNA同批进行两张膜的对比microarray检测, 各点信号强度比值与理论值1的偏离95%在1.65-0.62之间, 据此, 选择两次重复杂交的ratio值均大于1.7为表达上调, 小于0.58为表达下调。

心脏指标数据以mean±SE表示, 采用单因素方差分析作统计学检验, P<0.05为有显著性差异。

 

2结果

2.1 不同周龄大鼠心脏指标的变化

从8周龄到12周龄, 大鼠体重增加约45.7% (287±13 g vs 197±10 g), 前2周和后2周体重增加程度相近。心脏左心室重量增加约27.7% (0.60±0.03 vs 0.47±0.02 g), 前2周增加19.1%, 后2周增加7.1％。超声心动显示舒张期左室游离后壁厚度增加约23.6% (2.04±0.04 mm vs 1.65±0.13 mm), 前2周和后2周分别增加16.4%和6.3%。左心室心腔大小和收缩分数未发生显著改变 (表1)。

2.2  大鼠左心室基因表达谱的变化

大鼠在8-12周龄的发育成熟过程中, 左心室的基因表达谱也发生了显著的变化。 对已知基因根据功能进行分类,表达变化的基因包括细胞结构、代谢、氧化应激、信号转导等多个方面(表2), 此外包括一部分功能未知基因和EST序列。10周龄和8周龄大鼠比较, 变化的基因大多数为表达上调。而12周龄和10周龄大鼠比较, 变化的基因与10周龄相对于8周龄表达改变的基因基本相同, 但调节方向相反。12周龄与8周龄大鼠比较, 除少数几个基因表达水平还维持改变, 基因表达谱基本恢复到8周龄时的表达水平。

 

表1. 大鼠心肌生长指标

Table 1. Parameters of the heart during growth in rats

 

 8 W

10 W

12 W

BW (g)

197±10

240±12*

287±13*#

LVW (g)

0.47±0.02

0.56±0.04

0.60±0.03*

PWTd (mm)

1.65±0.13

1.92±0.08

2.04±0.04*

LVIDd (mm)

5.70±0.04

5.37±0.26

5.46±0.26

FS (%)

68.8±1.9

65.2±3.8

70.0±1.6

BW, body weight; LVW, left ventricular weight; PWTd, thickness of diastolic left ventricle; LVIDd, inner dimension of diastolic left ventricle;  FS, fractional shortening; W, week. Data are mean±SE (n= 6 in each group). *P<0.05 vs 8 W group; #P<0.05 vs 10 W group.

 

表2. 大鼠生理性心肌生长过程中左心室表达变化的基因和分类

Table 2. Genes regulated in the left ventricle during physiologic cardiac growth and their classification in rats

Classification

Acc No.

 Description

10W/8W ratio

12W/10W ratio

12W/8W ratio

Structure

AA964363

Plectin

2.72

0.52

1.41

 

AA998058

Tropomyosin 4

15.63

0.29

4.52

 

AI044110

Thymopoietin (lamina associated polypeptide 2)

4.90

0.38

1.85

 

AA924911

Alpha cardiac myosin heavy chain

1.87

0.62

1.16

 

AI136540

Fast skeletal TnT gene encoding troponin T isoforms

2.07

0.53

1.11

Protein synthesis/degradation

AI044870

EF-1-alpha

2.0

0.41

0.82

 

AA819765

Ribosomal protein L21

2.19

0.37

0.81

 

AA818273

Proteasome component C8 mRNA, complete cds

0.36

2.19

0.80

Metabolism

AA925091

Adipocyte fatty acid binding protein (A-FABP)

2.37

0.43

1.03

 

AA925752

FAT

2.46

0.31

0.76

 

AA875221

NAD+-isocitrate dehydrogenase, gamma subunit

1.88

0.55

1.04

 

AA899443

CDK110, cytochrome B

1.95

0.51

1.00

 

AA997886

Cytochrome P450 2D18

6.20

0.35

2.16

 

AA858952

Adenine phosphoribosyltransferase (APRT)

2.99

0.46

1.38

 

AA964367

Adrenodoxin reductase

2.82

0.47

1.34

Signaling

AI044003

Ca2+-ATPase

5.60

0.29

1.61

 

AI137736

Calmodulin (RCM3)

1.99

0.37

0.74

 

AA858764

MAP kinase kinase (MKK2)

4.49

0.31

1.41

 

AA859586

Cain

2.86

0.50

1.42

 

AA901391

SH3 domain-containing adapter protein (Ruk)

2.48

0.48

1.18

 

AA964037

Ca2+-independent phospholipase A2

2.43

0.43

1.05

 

AI044049

Prepronociceptin

4.24

0.39

1.67

 

AA874884

Heme oxygenase

4.72

0.28

1.34

 

AA858510

Prostaglandin E receptor 1 (subtype EP1)

3.23

0.47

1.51

 

AI060206

cdc25A

4.29

0.36

1.54

 

AI145187

Neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 4 (cell adhesion kinase)

2.39

0.41

0.98

Oxidative stress

AA900218

Metallothionein

2.86

0.43

1.22

 

AA818827

Plasma glutathione peroxidase precursor

2.79

0.41

1.13

 

AA818422

Glutathione S-transferase

1.78

0.58

1.03

 

AA963644

Superoxide dimutase 3

0.39

1.91

0.74

Division

AA962997

DNA topoisomerase II

1.63

0.54

0.88

 

AI045794

H3 histone gene

2.08

0.47

0.97

Transcription

AA926277

CCAAT/enhancer binding, protein(C/EBP)delta

3.07

0.56

1.71

 

AA874828

Fos like antigen 2

4.43

0.36

1.58

 

AI136950

Delta1

3.38

0.58

1.96

ESTs

AA819087

ESTs, highly similar to SCOT_HUMAN SUCCINYL-COA:3-KETOACID-COENZYME A TRANSFERASE PRECURSOR [H.sapiens]

2.80

0.39

1.10

 

AI030987

EST, highly similar to protein tyrosine phosphatase 20 [R.norvegicus]

2.72

0.40

1.09

 

AA899702

ESTs, highly similar to VEGC MOUSE VASCU-LAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR C PRECURSOR [M.musculus]

1.77

0.56

0.97

 

AA819777

ESTs, moderately similar to HEAT SHOCK PROTEIN HSP 90-BETA [R.norvegicus]

3.84

0.41

1.56

 

AA900396

ESTs, weakly similar to ANNEXIN IV [R.norvegicus]

1.76

0.46

0.81

 

AA901306

ESTs, weakly similar to AIPL_RAT ARYL-HY-DROCARBON INTERACTING PROTEIN-LIKE 1 [R.norvegicus]

0.31

2.49

0.78

 

AA818434

ESTs, weakly similar to Hox-4.6 [M.musculus]

3.87

0.42

1.64

 

AA901304

EST

0.29

2.39

0.70

 

AA858873

EST

2.90

0.51

1.48

 

AA818886

EST

3.23

0.47

1.53

 

AA875348

EST

6.08

0.41

2.52

 

AA900068

ESTs

3.11

0.42

1.29

 

AA901410

ESTs

3.56

0.40

1.41

Ratio: averaged ratio of duplicated array-pairs from separated experiment, each of which was calculated by dividing the normalized intensities from one sample by ones from other sample, that is 10 W/8 W, 12 W/10 W and 12 W/8 W.

 

3讨论

大鼠出生以后,生长发育迅速, 心脏根据负荷变化适应性地发生形态和结构改变。一般认为心肌细胞是终末分化细胞, 其代偿以肥大反应为主, 而幼年期大鼠心脏各种细胞增殖和分化过程相对可能仍比较旺盛, 因此我们选择接近成年期的8、 10、 12周龄大鼠进行研究。大鼠从8周龄长到12周龄, 体重增加约45%, 适应性地发生左心室室壁增厚、 心脏重量增加等生理性变化。本研究表明, 大鼠在这一发育成熟过程中, 前2周和后2周体重增加幅度相似, 然而左心室室壁厚度及重量在前2周增加幅度明显大于后2周。

以往的研究显示, 这种发育成熟相关的生理性肥厚心脏与病理性肥厚心脏比较, 在组织结构上能维持更好的平衡[5]。我们的实验结果证实, 伴随这一时段大鼠左心室的表型改变, 其基因表达谱也相应地发生了显著的变化。10周龄与8周龄比较, 结果显示表达变化的基因多数上调, 包括一些结构蛋白的基因如网格蛋白(plectin), Ⅳ型原肌球蛋白, 核膜蛋白thymopoietin 等, 以及编码心肌收缩蛋白的基因如α肌球蛋白重链和肌钙蛋白。相应的, 与蛋白合成有关的基因如核糖体蛋白和翻译延长因子的表达上调, 而与蛋白降解相关的蛋白酶体组分蛋白的基因表达下调。这些基因的表达改变与心肌肥厚生长和收缩能力加强的特点相适应。为了维持相应的能量供应, 能量代谢相关基因的表达水平亦表现为上调, 如脂肪酸结合蛋白及胞膜脂肪酸转运体蛋白(FAT)的基因, 说明心肌对脂肪酸的摄取能力增强, 而成年大鼠心脏正是主要利用脂肪酸供能的。此外, 三羧酸循环和氧化磷酸化过程相关的基因表达水平也有升高, 如异柠檬酸脱氢酶和细胞色素B。可见, 心肌在生理性生长肥厚过程中, 从物质结构和能量代谢较全面地调动了基因表达的变化, 以适应发育生长所增加的负荷, 维持正常的心功能。

钙离子是心肌细胞收缩重要的信号分子, 表达谱中钙泵和钙调素基因表达的升高说明心肌对钙离子的调动和利用能力加强。而心衰的心肌钙泵表达往往下降, 导致心肌细胞内钙超载, 并影响胞内正常的钙信号波动而累及收缩功能[6]。此外, 表达谱中还有MKK2、 cain、 Ruk基因的表达升高, 前者是erk激酶, 后两者分别是calcineurin和PI3K的抑制因子[7-9]。提示MAPK、 calcineurin、  PI3K途径均可能是心肌生长过程中的信号转导途径, 而这些信号途径在病理性心肌肥厚中的作用已被广泛研究 [10], 并已得到公认, 由此可见, 这些途径在生理性和病理性心肌肥厚过程中是共同涉及的信号转导途径。当然, 它们在不同肥厚过程中的激活模式和调控机制可能是不同的, 因此进一步比较研究这些信号途径在生理性和病理性心肌肥厚过程中的差异和相互关系颇有意义。同时也提示, 仅仅试图通过抑制这些信号转导途径来治疗病理性心肌肥厚, 并不是一种明智的方法。

细胞内多种反应可以产生氧自由基, 而氧自由基本身的作用是两面性的, 适合的低浓度可以表现为信号分子, 如激活酪氨酸激酶, 高浓度对细胞则有毒性作用。心肌在迅速的生长过程中, 各种代谢反应旺盛, 必然产生较多的氧自由基, 为了维持氧自由基水平的平衡, 心肌还调动了一些抗氧化基因的表达, 如金属硫蛋白、 谷胱苷肽过氧化物酶、 谷胱苷肽S转移酶(GST )等。除了上述提及的基因, 大鼠生长期心脏还涉及其它一些基因表达的改变, 如钙非依赖性PLA2, nociceptin前体, 与合成甾体类激素相关的酶(adrenodoxin reductase)等, 还有一些未知基因的EST序列。对这些分子在心脏作用的进一步研究可能为我们提供新的线索。

有趣的是, 大鼠继续从10周龄长到12周龄, 心肌生长程度显著减弱, 而在基因表达谱中, 这些在10周龄大鼠左心室相对于8周龄大鼠表达改变的基因, 到12周龄基本又回到了8周龄的水平。显然, 在大鼠从8周龄长到12周龄的过程中, 左心室基因表达的确发生了较大的变化, 但是, 如果直接比较8周龄和12周龄大鼠, 虽然可以观察到左心室明显的表型改变, 多数基因表达水平却没有显著变化。这个现象提示， 通过基因表达, 翻译合成蛋白质, 心脏一旦达到代偿状态后, 由于蛋白质本身有一定代谢周期, 基因只需一个相对稳定的表达水平就可维持新的代谢平衡。而基因的表达改变不必或者不可以持续存在, 可见心脏的基因表达是严密地按需要进行调控和自律的, 这可能对维持正常的心功能非常重要。短短4周时间内, 大鼠心脏左室的基因表达谱就发生如此显著的改变, 也对心血管实验研究采用大鼠的周龄提出了一个问题, 通常实验都用250 g左右体重的大鼠, 正好处于这个生长发育时段。显然, 即使采用严格的分组和对照, 也会由于较小的周龄差别导致实验大鼠基因表达背景不同而使个体差异增大, 故在得出结论时必须谨慎。

有报道在大鼠出生后心脏中一些基因如钙泵表达水平升高[11], 和本实验结果相似, 但在本实验中其表达水平在较短时间内又出现回降。推测是否心肌生长相关基因的表达改变模式是一种按需要调节的波动形式。此外, 心脏细胞成分复杂, 该阶段观察到的基因表达变化是否与细胞构成改变有关？由于目前对大鼠出生后心脏生长发育的研究多为胚胎、新生、成年和老年之间的比较, 而对于接近成熟期的短期内心脏结构和基因表达变化的研究尚未见报道, 因此, 对这些问题的证实需要进一步的深入研究。

***

感谢本院冯新恒和李昭屏医师对动物的超声心动图检查和数学科学学院李金辉老师对实验数据的处理。

 

参考文献

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[2]Chang KC, Figueredo VM, Schreur JH, Kariya K, Weiner MW, Simpson PC, Camacho SA. Thyroid hormone improves function and Ca2+ handling in pressure overload hypertrophy. Association with increased sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase and alpha-myosin heavy chain in rat hearts. J Clin Invest 1997;100:1742-1749.

[3]Du XJ, Gao XM, Jennings GL, Dart AM, Woodcock EA. Preserved ventricular contractility in infarcted mouse heart overexpressing beta(2)-adrenergic receptors. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000;279:H2456-2463.

[4]McCormick SM, Eskin SG, McIntire LV, Teng CL, Lu CM, Russell CG, Chittur KK. DNA microarray reveals changes in gene expression of shear stressed human umbilical vein endothelial ce