生理学报Acta Physiologica Sinica,  April  25, 2003, 55(2): 197-200

Received 2002-08-02

Accepted 2002-09-29

This work was supported by the Natural Science Foundation of Zhejiang for Talent (No. RC99038).

*Corresponding author. Tel: +86-571-87217146;  Fax: 0571-87217147; E-mail: xiaqiang@zju.edu.cn

 

 研究论文

哌替啶对心室肌收缩的抑制作用及其机制

张雄, 曹春梅, 王琳琳, 丁悦敏, 夏强*

浙江大学医学院生理教研室, 杭州  310031

摘要:  为明确哌替啶对心脏收缩的直接效应, 并探讨其相关机制。采用Langendorff灌流心脏模型, 观察了哌替啶对大鼠心室收缩功能的影响, 并用荧光测钙技术和膜片钳技术探讨了哌替啶作用的钙离子机制。结果显示, 哌替啶剂量依赖性地降低离体灌流心脏的LVDP×HR、 +dP/dt和-dP/dt, 而升高LVEDP。在酶解分离的心室肌细胞上, 哌替啶剂量依赖性地降低细胞收缩时的钙瞬变幅度, 并升高舒张末期的钙水平。哌替啶不影响高浓度咖啡因诱导的内钙释放。哌替啶使L-型钙电流强度降低到给药前的67.4±10.1%, 而不改变钙通道的激活和失活电位。哌替啶减弱钙电流的作用并不能被阿片受体阻断剂纳洛酮所阻断。以上结果表明, 哌替啶能通过非阿片受体介导的途径阻断细胞外钙离子的内流, 对心室收缩产生直接的抑制作用。

 

关键词: 生理学; 心肌收缩; 膜片钳技术; 哌替啶

中图分类号: Q463

 

Negative inotropic effect of meperidine in rat ventricular muscle and the underlying mechanism

ZHANG Xiong, CAO Chun-Mei, WANG Lin-Lin, DING Yue-Min, XIA Qiang*

Department of Physiology, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310031

 

Abstract:  The purpose of the present study was to investigate the effect of meperidine on rat ventricular muscle. Cardiac function was assessed in Langendorff-perfused rat hearts and intracellular calcium level was recorded in enzymatically isolated rat ventricular myocytes using spectrofluorometric techniques. To explore the underlying mechanism, whole-cell configuration of patch-clamp technique was used to record L-type Ca2+ current. The results showed that meperidine decreased the product of heart rate and left ventricular developed pressure (LVDP×HR), maximal rate of the left ventricular pressure increase (LV +dP/dtmax) and decrease (LV -dP/dtmax), but increased left ventricular end-diastolic pressure in a dose-dependent manner (0-1000  μmol/L). Meperidine also produced a dose-dependent reduction in electrically induced [Ca2+]i transient amplitude and an increase in diastolic [Ca2+]i baseline level, but did not alter the caffeine (20 mmol/L) induced Ca2+ release from intracellular ryanodine-sensitive Ca2+ stores. Meperidine at 100  μmol/L inhibited L-type Ca2+ current to  67.4±10.1% of control but did not affect the voltage dependency of activation and inactivation. The inhibitory effect of meperidine on Ca2+ current could not be prevented by pretreatment with the opioid receptor antagonist naloxone. These data suggest that meperidine exerts a negative inotropic effect by inhibiting L-type Ca2+ current. The lack of effect of naloxone implies that the action is independent of the opioid receptor.

 

Key words: physiology; myocardial contraction; patch-clamp techniques; meperidine

 

哌替啶是一种人工合成的阿片类镇痛剂和局部麻醉剂, 在临床上, 被大剂量使用于癌性镇痛和外科手术的局部麻醉。然而, 大剂量的哌替啶会影响心脏的收缩功能。Helgesen等人发现哌替啶能显著增强离体大鼠心房和在体豚鼠心室的收缩力[1,2]。而另有报道认为, 哌替啶能抑制心脏收缩, 降低心输出量[3,4]。这些不一致的结果可能是因为哌替啶有多种作用途径以及心血管系统存在复杂的神经体液调节造成的[4]。基于此, 本实验在离体灌流的大鼠心脏上观察了哌替啶对心脏收缩的直接作用, 并在细胞水平探讨了其中的机制。

 

1材料和方法

1.1 离体心脏灌流实验

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠, 体重200-250 g, 由本校实验动物中心提供。大鼠被击昏后, 迅速取出心脏, 按Langendorff灌流方法, 用改良的Krebs-Henseleit (K-H)液进行37℃恒温和76 mmHg恒压灌流, K-H液中通以95％ O2和5％ CO2。改良的K-H液成分为(mmol/L): NaCl 118.0、  KCl 4.7、  KH2PO4 1.2、  MgSO4 1.2、  NaHCO3 25.0、  CaCl2 1.25和葡萄糖 10.0, pH 调整到7.4。灌流稳定后, 将充水的乳胶水囊经左心房切口插入至左心室内固定, 经压力传感器, 由MedLab生物信号采集系统(南京美易公司)记录左心室室内压, 同时记录心电图。调整左心室舒张末压力(LVEDP)为8-10 mmHg, 平衡20 min。心率(HR)小于220 次/min或左心室发展压(LVDP)小于70 mmHg的心脏弃去不用[5]。分别记录给药前(pre-drug)、 给药后及洗脱后(washout)的LVDP×HR、 LVEDP、 左心室收缩的最大压力变化率(+dP/dt)和左心室舒张的最大压力变化率(-dP/dt)。

1.2 心室肌细胞分离

取SD大鼠心脏固定于Langendorff灌流装置上, 用37℃恒温氧饱和的无钙Tyrode溶液以10 ml/min的速度恒流灌流。Tyrode溶液的成分为(mmol/L): NaCl 100.0、 KCl 10.0、 KH2PO4 1.2、 MgSO4 5.0、 葡萄糖 20.0、 牛磺酸 10.0和MOPS 10.0, pH调整到7.2。灌流5 min后, 再用含I型胶原酶0.3 g/L的无钙Tyrode溶液灌流11-12 min。剪碎心室肌并在37℃下孵育8-10 min。细胞悬液经尼龙网过滤, 在室温下逐步恢复溶液的钙离子浓度到1.25 mmol/L。获得的心室肌细胞在室温下静置2 h后备用[6,7]。

1.3 细胞内游离钙和肌浆网内储钙释放的测定

用1  μmol/L的Fura-2/AM孵育心室肌细胞, 30 min后离心去除孵育液, 并洗涤3次。用95％O2＋5％ CO2饱和的K-H液持续灌流细胞, 施加频率为0.2 Hz、 强度为50 V的电场刺激诱发细胞收缩。同时用双波长荧光测钙系统(TILL, 德国)测定340 nm/380 nm波长激发下的荧光比值, 此比值可反映细胞内游离钙离子的浓度。在溶液中加入20 mmol/L的咖啡因, 测定咖啡因诱导的内储钙的释放[6]。

1.4 膜片钳记录L-型钙电流

把分离的心室肌细胞置于2 ml灌流槽中, 细胞外液以2-3 ml/min的速度持续灌流。细胞外液成分为(mmol/L): NaCl 135.0、 CsCl 5.0、 MgCl2 1.0、 CaCl2 1.5、 HEPES 10.0和葡萄糖10.0, 用TEAOH调整pH值到7.3-7.4。用电极内液充灌经热抛光的玻璃微电极, 电极内液成分为(mmol/L): CsCl 135.0、 MgCl2 2.0、 EGTA 10.0、 HEPES 10.0、 MgATP 2.0和cAMP 0.5, 用TEAOH调整pH值到7.2-7.3。玻璃微电极接触细胞膜后, 负压轻吸细胞膜, 可形成大于1 GΩ的封接, 再以脉冲式负压或电脉冲击穿电极与细胞间的膜片, 使串联电阻在4-10 MΩ之间, 形成全细胞记录。利用Axon公司的膜片钳放大器(Axopatch 200B, 美国), 串联电阻补偿到80％, 4孔Bessel滤波器2 kHz低通滤波, 按预先设定的刺激程序用pCLAMP 7.0软件记录L-型钙电流。

1.5 统计学处理

实验数据以给药前值作为100％, 给药后或洗脱后值与给药前值相比经百分化处理, 用mean±SD表示。用可重复的单因素方差分析及Bonferroni t检验进行统计学分析, P<0.05表示差异有显著性。

 

2结果

2.1 哌替啶对离体心脏收缩的影响

在离体灌流的大鼠心脏上, 哌替啶呈剂量依赖地降低LVDP×HR、 +dP/dt和-dP/dt, 并呈剂量依赖地升高LVEDP, 所有指标在洗脱后均可恢复。见图1。

图1.哌替啶对左心室收缩功能的影响

Fig. 1.Effects of meperidine on contractility of left ventricles. n=7.*P<0.05, vs pre-drug (concentration 0).2.2 哌替啶对细胞内钙离子浓度的影响

利用电场刺激诱发单个心肌细胞产生收缩, 可分别观察哌替啶对心肌细胞收缩和舒张时胞内钙离子水平的影响。哌替啶呈剂量依赖地降低收缩时钙瞬变的幅度, 升高舒张末期的钙水平, 与未经哌替啶处理的平行对照组相比, 差异显著。见图2。

图2.哌替啶对心室肌细胞内钙离子水平的影响

Fig. 2.Effects of meperidine on [Ca2+]i of isolated ventricular myocytes.  The original recordings of fura-2 fluorescence ratio (340/380 nm) from field-stimulated myocyte twitch in the absence and presence of meperidine (A).  Systolic [Ca2+]i transient amplitude (B) and  diastolic [Ca2+]i baseline level (C) were measured from fura-2 fluorescence ratio. n=8. *P<0.05  vs pre-drug (concentration 0); #P<0.05  vs control.

 

2.3 哌替啶对细胞内储钙释放的影响

哌替啶100  μmol/L孵育心肌细胞5 min后, 加入咖啡因20 mmol/L, 发现咖啡因诱导的钙瞬变幅度是电场刺激诱导的114.6±9.5%, 与未加哌替啶组113.9±16.6%相比, 差异不显著。

图3.哌替啶对L-型钙电流的影响

Fig. 3.Effects of meperidine on L-type calcium current.A: The original current traces elicited by depolarizing pulses applied at 10 mV increments from a holding potential of-40 mV to +50 mV in the absence and presence of meperidine and washout. B: The I-V relationship of L-type calcium current in the absence and presence of meperidine and washout. n=7. C: Normalized voltage-dependent steady-state inactivation curve in the absence and presence of meperidine.*P<0.05 vs pre-drug; #P<0.05 vs washout.

 

2.4 哌替啶对L-型钙电流的影响

如图3所示, 哌替啶100  μmol/L显著抑制了L-型钙电流的强度, 使钙电流强度减少到给药前的67.4±10.1%(P<0.05)。I-V曲线显示, 哌替啶并不影响L-型钙通道的激活电位, 失活曲线经Boltzmann方程拟合, 得出哌替啶作用前的钙电流50％灭活的条件电压和斜率因子分别为-20.87±0.30 mV和4.69±0.28, 哌替啶作用后则分别为-19.97±0.42 mV和4.57±0.40, 两者相比均无显著差异。

2.5 纳洛酮对哌替啶作用的影响

预先加入纳洛酮1  μmol/L, 不影响L-型钙电流的强度, 在此基础上加入哌替啶100  μmol/L, 可使钙电流的电流强度减少到给药前的65.7±11.7％, 与未加纳洛酮组相比, 差异不显著。

 

3讨论

从离体灌流心脏的实验结果可知, 哌替啶能显著地抑制大鼠左心室的收缩和舒张功能, 说明在排除神经体液因素后, 哌替啶对心室肌的收缩有直接的抑制作用。这些结果与哌替啶对单个心肌细胞内钙离子水平影响的结果非常一致。由于钙离子与肌细胞的收缩密切相关, 胞浆内的钙离子浓度直接影响了肌细胞的收缩强度和舒张程度。本实验的钙荧光测量结果说明, 哌替啶能分别通过抑制收缩时胞浆钙浓度的升高和舒张时胞浆钙的回摄取来影响心室的收缩和舒张功能。心室肌细胞收缩时, 胞浆钙离子浓度首先升高, 此钙离子主要来源于外钙内流和内储钙的释放, 即肌细胞在去极化电流的作用下, L-型钙通道开放, 细胞外的钙离子顺浓度差和电位差流入细胞内, 再通过钙诱导的钙释放机制引起细胞内ryanodine敏感的钙池释放钙, 从而共同升高胞浆钙引起收缩[8,9]。高浓度的咖啡因能持续开放ryanodine敏感的钙池, 所以在没有去极化电流的情况下, 咖啡因主要通过诱导ryanodine敏感钙池的钙释放升高胞浆钙。哌替啶不影响咖啡因诱导的内钙释放的能力, 说明哌替啶可能不是通过影响内储钙的途径起作用。全细胞膜片钳的结果显示, 哌替啶能减弱L-型钙电流强度, 抑制外钙的内流, 而不影响L-型钙通道的激活和失活电位, 说明哌替啶可能影响了钙通道的电导、 钙通道的开放数目或开放持续时间, 从而减小了细胞内钙浓度, 抑制了收缩。对于哌替啶是否能阻断钙通道或影响钙通道的开放时间或是否减少了处于磷酸化活化状态的钙通道数目[9,10], 尚待进一步探讨。哌替啶能抑制心室肌舒张末的舒张程度和升高舒张期的钙水平, 说明哌替啶影响了胞内钙离子的回摄取功能, 这可能与心肌细胞膜的Na+-Ca2+交换、 Ca2+泵以及肌浆网上的Ca2+泵活动受影响有关, 相关机制有待进一步的探讨。哌替啶是一种阿片受体激动剂, 在本研究中, 非特异性的阿片受体阻断剂纳洛酮不能阻断哌替啶的作用, 说明哌替啶并非是通过阿片受体途径抑制钙电流。以往的报道发现, 哌替啶无论是增强还是抑制心肌的收缩, 纳洛酮均不能阻断其效应[1,10,11], 所以, 本研究认为, 哌替啶能通过非阿片受体介导的途径, 阻断细胞外的钙离子内流, 从而对心室肌收缩产生直接的抑制作用。

 

参考文献

 

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