生理学报Acta Physiologica Sinica, April 25, 2003, 55(2): 201-205
Received 2002-07-29
Accepted 2002-11-22
This work was supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province (No.302351).
*Corresponding author. Tel: +86-311-6052263; E-mail: lingyl20@sina.com
研究论文
八肽胆囊收缩素对家兔内毒素休克时肺动脉张力的影响
段国辰, 凌亦凌*, 谷振勇, 韦鹏, 牛志云, 杨世方
河北医科大学病理生理教研室, 石家庄 050017
摘要: 为探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)缓解内毒素休克(ES)时肺动脉血压(PAP)增高的机制, 观察了CCK-8对脂多糖(LPS)引起家兔ES时PAP变化以及离体肺动脉环(PARs)张力改变的影响。实验用新西兰大耳白雄性家兔40只, 分为颈静脉注入LPS (8 mg/kg i.v.)复制的家兔ES模型、 LPS注入前15 min给CCK-8 (15 μg/kg, i.v.)、 LPS注入前15 min给CCK受体拮抗剂丙谷胺(Pro 1 mg/kg, i.v.)、 单独注入CCK-8 (15 μg/kg, i.v.)和注射生理盐水(对照)共5组。用生理记录仪监测平均动脉压(MAP) 和PAP的变化; 5 h后制备PARs, 应用血管张力测定技术, 检测各组PARs张力。结果为: (1) ES时MAP降低、 PAP升高, CCK-8可完全翻转ES时PAP的增高, 而Pro加剧ES时PAP的增高; (2) LPS组的PARs对苯肾上腺素(PE)的收缩反应增强, 对ACh内皮依赖性舒张反应降低, 而CCK-8可逆转LPS的上述作用。上述结果提示CCK-8可缓解ES时的PAP升高, 这可能与其调节肺动脉张力改变有关。
关键词: 胆囊收缩素; 内毒素休克; 肺动脉; 血管张力
中图分类号: Q463.6; R363
Effects of
cholecystokinin-octapeptide on the tension of pulmonary artery in rabbits with
endotoxic shock
DUAN Guo-Chen, LING Yi-Ling*, GU Zhen-Yong, WEI Peng, NIU Zhi-Yun, YANG Shi-Fang
Department of Pathophysiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017
Abstract: For investigation of the regulatory mechanism of cholecystokinin-octapeptide (CCK-8) on pulmonary circulation in rabbits with endotoxic shock (ES) induced by lipopolysaccharides (LPS), mean arterial pressure (MAP) and pulmonary arterial pressure (PAP) were evaluated for 5 h in five groups of rabbits: group of LPS (8 mg/kg, i.v.)-induced ES, group of CCK-8 pretreatment (15 μg/kg, i.v.) 15 min before LPS administration (8 mg/kg, i.v.), group of proglumide pretreatment (1 mg/kg, i.v.) 15 min before LPS administration (8 mg/kg, i.v.), group of CCK (15 μg/kg, i.v.) only, and normal saline (control) group.The pulmonary arterial tension was measured with isolated vascular ring technique.The results showed that LPS-induced pulmonary arterial hypertension was abolished by CCK-8. In contrast, proglumide, a nonspecific antagonist of CCK-8 receptor, potentiated the deleterious effect of LPS. The contractile response of isolated pulmonary artery to α-adrenoceptor agonist phenylephrine (PE) was enhanced and the relaxation response to acetylcholine (ACh) was depressed significantly after LPS was injected, but the effect could be reversed by CCK-8. These results suggest that pulmonary circulation is improved by CCK-8 in ES, and the regulatory effects of CCK-8 may be brought about by modulating the pulmonary arterial tension.
Key words: cholecystokinin-octapeptide; endotoxic shock; pulmonary artery; vascular tension
内毒素休克(endotoxic shock, ES)是临床上常见的危重病理过程, 死亡率很高。肺动脉压(pulmonary arterial pressure, PAP)增高是ES时常见的并发症, PAP增高的程度及其持续的时间是休克并发急性呼吸窘迫综合征导致休克难治的重要因素之一[1]。以往本室及其他学者的研究显示[2,3], 八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide, CCK-8)具有抗内毒素性休克、 抗失血性休克的作用。新近我们发现, CCK-8对ES发病时PAP增高有拮抗作用。然而, CCK-8对缓解ES时PAP增高的作用机制迄今尚不清楚。本实验在整体及离体水平同步观察了CCK-8对家兔ES时PAP变化以及肺动脉张力改变的影响, 以探讨CCK-8在ES时缓解PAP增高的作用机制。
1材料和方法
1.1 主要试剂
大肠杆菌内毒素主要活性成分脂多糖(E.coli LPS, serotype O111∶B4)、 硫酸化CCK-8、 CCK受体非特异性拮抗剂丙谷胺(proglumide, Pro)、 苯肾上腺素(phenylephrine, PE)、 ACh及消炎痛(indomethacin, Indo)均为Sigma公司产品。 其它试剂均为国产分析纯。
1.2 ES模型复制与实验分组
健康雄性纯种新西兰大耳白家兔由河北医科大学动物实验中心提供。家兔ES模型复制: 兔40只(2-2.1 kg), 25%氨基甲酸乙酯(1 g/kg)耳缘静脉缓慢注射进行麻醉。行颈部手术分离左侧颈总动脉和右侧颈静脉, 血液肝素化(1250 U/kg, i.v.)后, 分别插入特制的聚乙烯管至升主动脉弓处和经右心室至肺动脉入口处, 导管经压力传感器与八道生理记录仪(日本光电株式会社)相连, 用于监测平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)和PAP变化。根据显示屏上压力波形可判断肺动脉导管的位置。动物稳定15 min后, 经颈静脉导管弹丸式给药并动态描记PAP。实验分为5组(每组8只动物): (1)溶剂对照组:静脉注入等量生理盐水; (2) LPS组: 经静脉导管缓慢(10 min)注射LPS (8 mg/0.8 ml·kg-１); (3) CCK+LPS组: 静脉注入CCK-8 (15 μg/·kg-１) 后15 min再注入LPS; (4)Pro+LPS组: 静脉注入Pro (1 mg /ml·kg-１) 后15 min再注入LPS; (5) CCK组: 注入同剂量的CCK。每次注入药物后再缓慢注入2 ml生理盐水, 以确保药物全部进入体内。
1.3肺动脉环的制备
上述各组的实验动物放血处死后, 迅速联合取出心脏、 肺脏置于4℃并通有混合气(95% O2+5% CO2)的Krebs液中, 其成分(mmol/L): NaCl 118、 KCl 4.7、 CaCl2 2.5、 MgSO4 1.2、 NaH2PO4 1.2、 NaHCO3 20.0、 葡萄糖11.1, pH 7.2-7.4。 仔细分离肺动脉, 去除附着其周围的脂肪和结缔组织, 避免损伤内皮, 剪成2-3 mm长的肺动脉环(pulmonary artery rings, PARs)。
1.4 PARs的张力检测
将血管环垂直悬挂于盛有6 ml Krebs液(含10 μmol/L的Indo以消除环氧酶产物作用)的浴槽中, 温度保持37℃, 并持续通以上述混合气。血管环一端固定于浴槽底部, 另一端通过张力换能器(T-1型)与3066型平台记录仪(四川仪表厂)相连。PARs分别在2 g的基础张力下平衡1 h, 期间每隔15 min换１次液。用PE (1 μmol/L)检测血管环的反应性, 待收缩反应曲线至平台后冲洗, 确认其反应性稳定后, 依次做: ⑴血管环对PE (1 μmol/L)的收缩反应以及1 μmol/L PE预收缩后对0.01-10 μmol/L ACh的内皮依赖性舒张反应; (2) 0.01-10 μmol/L ACh累积浓度舒张反应; (3) 0.01-10 μmol/L PE累积浓度收缩反应。每步之间用Krebs液反复冲洗3-5次, 至张力回到基线水平。实验结束后, 将血管环置于恒温干燥箱烘烤(温度为60-70℃)至恒重。用电子分析天平称量每个血管环的干重。收缩反应结果用克张力/毫克干重(g tension /mg dw)表示, 舒张反应以血管舒张张力占1 μmol/L PE收缩张力的百分比表示。
1.5统计学处理
数据用mean±SE表示, 采用SPSS统计软件处理, 组间差异用单因素方差分析(one-way ANOVA), 有显著差异者用Newman-Keuls q检验进行两两比较。
2 结果
2.1 CCK-8对ES发生过程中PAP变化的影响
在5 h的实验中, 对照组PAP维持在26.33±2.55-20.93±1.65 mmHg 的范围内, CCK组家兔的PAP无明显变化。LPS组MAP呈持续性降低, 0.5 h时为80.93±3.23 mmHg, 明显低于对照组(100.65±1.80 mmHg, P<0.01); 1 h时为75.53±0.90 mmHg, 2 h时降到更低水平(61.80±3.68 mmHg), 一直维持到5 h, 均明显低于对照组(P<0.01)。LPS组的PAP迅速升高, 0.5 h达高峰, PAP 为37.73±2.40 mmHg, 明显高于对照组(26.33±2.55 mmHg, P<0.01); 1和1.5 h后PAP稍下降, 但均显著高于对照组(P<0.01和P<0.05); 2 h后PAP有所回落, 但仍高于对照组。CCK+LPS组, 在最初的1 h内PAP有所升高, 但与对照组(25.43±0.83 mmHg)相比无显著差异; 1.5 h后PAP降低, 接近对照组; 在整个实验过程中, 本组PAP均低于LPS组相应时间点的PAP值。而Pro+LPS组0.5 h时PAP明显升高, 1 h达到高峰, PAP 为47.78±2.33 mmHg, 随后维持在41.70±2.48 mmHg, 明显高于LPS组(P均﹤0.01) (图1)。
图1.CCK-8逆转LPS所致家兔肺动脉压的增高
Fig. 1.CCK-8 reversed pulmonary arterial hypertension induced by LPS in rabbits. Mean±SE, n=8 in each group. *P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs LPS.
2.2 CCK-8对ES时PARs张力变化的影响
LPS组PARs对PE的收缩反应张力(3.47±0.25 g tension/mg dw)明显高于对照组(2.31±0.32 g tension/mg dw, P<0.01), PE的累积剂量收缩反应曲线明显左移, 与对照组有非常显著差异(P<0.01); CCK+LPS组的PARs对PE的收缩反应张力(2.62±0.28 g tension /mg dw)明显低于LPS组(P<0.05), 并接近对照组水平, 累积剂量收缩反应曲线与LPS组相比右移(P<0.05); Pro+LPS组及CCK组的PARs对PE的收缩反应张力与对照组相比, 虽有升高但均无显著差异(图2、 3)。
图2.CCK-8逆转LPS诱导兔肺动脉环对PE (1 μmol/L)收缩反应的增强反应
Fig. 2.CCK-8 reversed contractive response to PE (1 μmol/L) in PARs from rabbits. Mean±SE, n=8 in each group. **P<0.01 vs control; #P<0.05 vs LPS.
图3.CCK-8逆转LPS诱导兔肺动脉环对0.01-10 μmol/L浓度范围PE累积收缩反应的增强
Fig. 3.CCK-8 reversed LPS-induced increase in contraction responses to cumulative doses of PE in PARs from rabbits. Mean±SE, n=8 in each group. **P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs LPS.
图4.CCK-8逆转LPS诱导兔肺动脉环对1 μmol/L ACh 舒张反应张力的降低
Fig. 4.CCK-8 reversed LPS-induced decrease in endothelium-dependent relaxation to ACh (1 μmol/L) in PARs. Mean±SE, n=8 in each group. **P<0.01 vs control; #P<0.05 vs LPS.
LPS组的PARs对ACh内皮依赖性舒张反应(67.8±3.3%)明显低于对照组(85.1±3.0%, P<0.01), 累积剂量舒张反应曲线明显右移, 与对照组有显著差异(P<0.05); CCK+LPS组的PARs对ACh内皮依赖性舒张反应(76.9±1.2%)明显高于LPS组 (P<0.05), 累积剂量舒张反应曲线与LPS组相比明显左移(PE 0.1 μmol/L时, P<0.01); Pro+LPS组的PARs对ACh内皮依赖性舒张反应(58.5±3.3%)明显降低,与对照组相比有非常显著差异(P<0.01), 与LPS组相比也有显著差异(P<0.05), 累积剂量舒张反应曲线与LPS组、 对照组相比右移(P均<0.01)。CCK组的PARs对ACh内皮依赖性舒张反应与对照组相比无显著差异(图4、 5)。
图5.CCK-8逆转LPS诱导兔肺动脉环对0.01-10 μmol/L浓度范围ACh累积舒张反应张力的降低
Fig. 5.CCK-8 reversed LPS-induced decrease in endothelium-dependent relaxation responses to cumulative doses of ACh in pulmonary arterial rings from rabbits. Mean±SE, n=8 in each group. *P<0.05, **P<0.01 vs control; ##P<0 .01 vs LPS.
3 讨论
本实验中, 家兔静脉注射LPS后MAP呈持续性降低, 成功地复制了家兔ES模型。并在LPS诱导MAP显著降低的同时, PAP明显增高, 这与我们以往的实验结果一致[4, 5]。PAP明显增高是ES发病时的重要病理现象, 合并与不合并PAP持续增高的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症患者相比, 其死亡率前者明显高于后者[1, 6], 因此缓解ES发病时PAP增高可能成为防治ES的新途径。
CCK-8是小分子脑肠肽,
它在胃肠道和中枢神经系统的分布及功能已有大量报道, 目前它的抗休克作用[2, 3, 7]已成为一个新的研究方向。 有作者发现, ES时CCK的血液含量增高[8],
肺脏对CCK的清除明显减少, 对机体具有一定的保护意义[9]。本实验结果显示,
静脉预先注射CCK-8可完全反转LPS入血引起的PAP增高,
而静脉预先注射CCK受体拮抗剂Pro可加剧LPS引起的PAP增高,
提示在ES发病时内外源性CCK对休克时PAP增高均有拮抗作用。CCK受体有A、 B两种亚型[10, 11], Pro为CCK受体的非特异性拮抗剂[12, 13], 故本实验结果无法明确哪种受体具体介导了CCK-8对肺动脉血压的调节作用。本室已证实肺组织中有CCK
A受体和CCK B受体的表达[14], 而硫酸化CCK-8与A受体的亲和力比与B受体的亲和力高600-1000倍
[15,16], 推测可能主要是A受体介导了CCK-8对ES时PAP的调节作用。
本室及其他学者的研究报道, CCK-8可部分缓解内毒素休克和出血性休克发病过程中的平均动脉压降低, 机制与其抗氧化作用、 改善血液成分构成比和体动脉血管反应性有关[2, 3, 17]。但CCK-8缓解ES时PAP增高的机制迄今尚未阐明。在动物整体水平, 血压的调节因素众多, 其中血管固有的对血管活性物质的反应性张力变化对血压具有重要的调节功能。为探讨肺动脉反应性张力变化在CCK-8缓解内毒素休克时PAP增高中的作用, 本实验在动物整体水平监测5 h肺动脉血压变化后, 摘取肺动脉, 制备PARs, 同步在离体血管水平观察了肺动脉的反应性张力变化,
以更接近疾病发生的病理生理过程进行研究。结果显示,
LPS所引起的PARs对PE的收缩反应张力明显增高, 对ACh的内皮依赖性舒张反应张力明显降低, 均被CCK-8所逆转, 这与本室以往发现的CCK-8可拮抗LPS直接孵育离体PARs (2 mg/ml, 2 h)引起血管的反应性张力异常变化是一致的[18]。提示, 在ES发病时肺动脉收缩反应增强、 而内皮依赖性舒张反应降低可以导致PAP增高。换而言之, LPS入血后引起肺动脉本身的反应性张力变化参与介导了内毒素休克时PAP的增高,
CCK-8改善内毒素休克时肺动脉的反应性张力变化可能是其缓解PAP增高的重要机制。研究证实, 一氧化氮(NO)是血管张力变化的关键调节因素。ACh为内皮依赖和受体依赖性舒张血管物质, 内皮源性NO介导其舒张血管作用, ACh可以反映血管内皮细胞的功能变化。本实验中, LPS组PARs对ACh引起的内皮依赖性舒张反应张力明显降低, 并为CCK-8逆转, 说明CCK对LPS引起的肺动脉内皮细胞功能损害具有减轻作用。而CCK-8抑制PE引起的肺动脉收缩反应增强的原因尚不清楚, 有待进一步研究。
综上所述, 本实验在整体动物和离体血管水平观察了CCK-8对家兔发生ES时PAP增高变化及肺动脉张力变化的影响, 揭示CCK-8缓解ES时PAP的增高可能是通过调节肺动脉张力的异常变化而实现的。
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