生理学报Acta Physiologica Sinica, April 25, 2003, 55(2): 206-212

Received 2002-08-09

Accepted 2002-10-10

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30070254).

*Corresponding author. Tel: +86-23-65429945; E-mail: tuyali2002@yahoo.com.cn

研究论文

大鼠视皮层神经元电生理和形态学特性在发育中的变化

涂娅莉1，*, 刘应兵2, 张莉3, 赵妍君2, 王蕾4, 胡志安1

1第三军医大学西南医院眼科, 重庆 400038;

四川大学华西医学院 2生理教研室, 3药理学教研室, 4组织胚胎学教研室, 成都 610041

摘要: 为研究大鼠不同发育阶段视皮层神经元电的生理学与形态学特性, 实验观察了神经元电生理和形态学特性的变化与年龄的同步化程度, 探讨视皮层视觉依赖性突触的形成和重新分布的细胞内机制。应用脑片膜片钳全细胞记录技术和细胞内生物素标记相结合的方法, 记录4-28 d SD大鼠视皮层神经元的突触后电流(postsynaptic currents, PSCs)。共记录156个大鼠视皮层神经元, 睁眼前与睁眼后组中无反应型细胞数量，多突触反应型细胞数量、细胞的输入阻抗有显著性差异。成功标记23例神经元, 不同年龄的神经元的形态学成熟度不同。低输入阻抗神经元在形态学上属成熟型, 高输入阻抗神经元属幼稚型。该结果表明, 大鼠在发育过程中, 视皮层神经元功能的成熟表现为在形觉刺激以及局部神经元网络的整合作用下的视觉依赖性突触的形成和重新分布。在视觉发育可塑性关键期内, 视皮层神经元形态和电生理特性的变化与年龄的同步化程度大于皮层下结构。

关键词: 全细胞记录; 膜片钳; 脑片; 视皮层; 生物素

中图分类号: Q426

Changes in electrophysiological and morphological properties of neurons during the development of the visual cortex in the rat

TU Ya-Li1，*, LIU Ying-Bing2, ZHANG Li3, ZHAO Yan-Jun2, WANG Lei4, HU Zhi-An1

1Department of Ophthalmology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, and Departments of 2Physiology, 3Pharmacology, and 4Histology and Embryology, West China University of Medical Science, Chengdu 610041

Abstract: To investigate the intracellular mechanism of activity-dependent synapses formation and redistribution, we studied the electrophysiological and morphological characteristics of neurons of the developing visual cortex, and observed the level of synchronism of age and changes in the properties. Whole cell patch-clamp recordings and intracellular biocytin staining were used to record postsynaptic currents (PSCs) from neurons in the visual cortex of Sprague-Dawley rats (postnatal d 4-28). The histological processing was made. There were three types of PSCs in 156 cells: silent response, monosynaptic response and polysynaptic response, during the first developmental month. Before eyes opened the number of the neurons with the silent response (57.3%) was significantly higher than that after the eyes opened (11.9%) (P<0.001). However, the incidence of polysynaptic PSCs increased from 12.4% before eyes opened to 28.9% after eyes opened (P<0.01). During postnatal week 1, all cells were classified as immature. The immature cells had very high input resistances (RN>1.0 GΩ), low amplitude (-0.87 mA) and short decay time (-0.98 ms). During postnatal week 4, all cells were mature with lower input resistance (RN<310 MΩ), larger amplitude (-66 mA), and longer decay time (-225 ms). From postnatal weeks 1 to 3, the cells had electrophysiological properties that were intermediate between the immature and mature types of cells. With biocytin intracellular staining, five types of neurons were obtained: pyramidal cells, satellite cells, basket cells, neuroglial cells and immature cells. On the basis of their electrophysiological and morphological characteristics, pyramidal cells were classified into three categories: immature, intermediate, and mature cell types. During postnatal week 1, cells were immature with very high input resistance. Morphologically immature cells had short simple dendritic arborizations which incompletely penetrated the layer where the cell body lies. From postnatal weeks 2 to 4, the cells were mature with low input resistance. They were morphologically more complex with dendritic arborizations which completely penetrated the whole layers of the visual cortex. From postnatal weeks 1 to 2, a third, intermediate cell type had electrophysiological properties that were intermediate between the immature and mature cell types. Three distinctive types of pyramidal cells in visual cortex only co-exist during postnatal weeks 1 to 2. Data show that activity-dependent synapes are formed and integrated into local neuronal networks with visual stimulation. In the critical period of visual development, the level of synchronism of age and changes in electrophysiological and morphological properties in the visual cortex is higher than that in the subcortex.

Key words: whole cell recording; patch clamp; brain slice; visual cortex; biocytin

20世纪60年代以来的视觉发育研究发现, 儿童弱视的发生发展过程与视觉系统突触结构的可塑性过程密切相关。视觉发育可塑性关键期内这种活动依赖性的神经机制, 一直是眼科学和神经科学研究的前沿。视皮层在出生后相当一段时间内尚处在发育过程中, 无论在解剖学还是生理学方面均未成熟, 因而表现出很大程度的可塑性, 而视皮层在这个特定、早期的发育期(关键期)中对视觉环境的改变相当敏感。以往探讨视皮层发育的可塑性机制多以形态学的方法研究递质和受体的变化, 而对视觉发育中突触联系的功能状态了解很少。近年来, 脑片膜片钳技术与生物素细胞内标记相结合的方法使在中枢神经系统的细胞水平研究中将功能变化与形态特征结合起来成为可能。Hirsch[1]应用该项技术研究了雪貂视皮层神经元的突触整合作用。另外, Tarczy-Hornoch K[2] 亦在猫离体视皮层脑片中也观察到平滑细胞与棘状细胞之间的内在突触联系。刘应兵等[3]的研究表明, 幼年大鼠海马颗粒细胞在出生后2-4周内, 即使同一日龄的细胞在形态学和电生理特性上存在着明显不同发育阶段的特征性改变。不同成熟状态的细胞在整个发育阶段都混合存在。越接近成熟的大鼠, 其成熟型细胞愈多而幼稚型细胞愈少。因此, 在发育过程中, 中枢神经元的成熟状态并不是一致的, 也不能用出生后的天数来同步衡量细胞的成熟状态, 然而目前尚未见研究不同发育阶段视皮层神经元电生理特性与形态学特征相互关系的报道。本研究应用脑片膜片钳技术和细胞内标记相结合的方法, 研究大鼠视皮层神经元发育的被动膜学特性和突触传递特性, 探讨视觉经验在视皮层发育过程中对神经元突触的修饰作用, 观察视皮层神经元的形态学特征, 探讨神经元电生理和形态学的成熟与年龄的同步化程度, 为视皮层可塑性细胞内机制的研究奠定基础。

1材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

EGTA、 HEPES 、葡萄糖酸钾购于美国Sigma公司, ATP购于上海华生公司, 玻璃微电极(tw150F-4型微玻管)购于美国WPI公司。膜片钳放大器为中国科学院上海生理研究所产品和美国Axon公司Axopatch 200B, 微操作器、定向推进器、刺激器、隔离器为日本Taiyo Koeki公司产品, 振动切片机1000为美国Ted Pella公司产品, 电极拉制器为日本Narishige公司产品以及美国Sutter公司P-97, A/D转换器为美国Axon公司产品。

将大鼠按照记录时的年龄分为4组: 1周龄组(≤7 d); 2周龄组(8-14 d); 3周龄组, (15-21 d); 4周龄组(22-28 d)。

1.2 视皮层脑片及电极的制备

实验用57只出生后4-30 d的正常Sprague-Dawley大鼠。乙醚麻醉, 断头后迅速取脑置于人工脑脊液(ACSF)中。ACSF中各种离子成分及浓度(mmol/L): CaCl2 2.4、 NaCl 124、 KCl 3、 NaH2PO4 1.25、 MgSO4 1.3、 NaHCO3 26和葡萄糖16.6。在ACSF中持续通以95% O2和5% CO2, 用振动切片机在冠状平面上将视皮层脑块切成厚度为400 μm的薄片, 室温(18-25℃)孵育1 h备用。用电极拉制器拉制玻璃毛细管微电极。电极尖端直径约1-2 μm, 阻抗为5-10 MΩ, 电极内液成分及浓度(mmol/L): 葡萄糖酸钾117.5、 MgCl 2、 HEPES 5、 EGTA 0.5和ATP 2, 并灌注0.5%生物素(biocytin)。

1.3 视皮层脑片膜片钳全细胞记录

用双极刺激电极插入脑片皮层下方的白质中, 将记录微电极插入脑片的Ⅱ-Ⅵ层中, 利用特定的测试方波电脉冲以盲法寻找细胞, 获得视皮层脑片全细胞记录[4]后, 再将细胞膜两侧电位差固定在钳制电压, 由电子刺激器产生单脉冲刺激(幅度0.1-1.0 mA, 时程100 μs), 经刺激隔离器加到刺激电极上,记录神经元突触后电流(postsynaptic currents, PSCs)的变化。用Axon公司的pClamp6软件进行数据分析。

1.4 视皮层神经元的生物素染色

在视皮层脑片膜片钳电生理记录的同时, 将0.5%生物素通过记录电极尖端灌注到所记录的细胞内, 染色5-20 min后, 将脑片转移至4℃固定液中, 次日进行ABC法组织学染色。

1.5统计学处理

采用SPSS计算机统计软件进行统计处理。所有计数资料用χ2检验进行率的比较; 计量资料用t检验作两个均数的比较, 方差分析作多个均数的两两比较, 并用mean±SD表示。P<0.05表示相差显著, P<0.01表示相差非常显著。

2 结果

2.1 PSCs的反应类型

在Ⅱ-Ⅵ层记录到156个神经元的PSCs, 根据其反应波形的特点, 可大致分为三种类型: 无反应型、单突触反应型和多突触反应型(图1A-C)。出生后2周内, 无反应型视皮层神经元所占的比例较高, 当发育进行时, 无反应型神经元的数量逐渐减少, 大部分神经元表现为单突触反应, 同时多突触反应型神经元的数量逐渐增多。

图1.视皮层神经元三种类型的PSCs曲线

Fig. 1.Types of postsynaptic currents (PSCs). A: The PSCs of a silent responsive cell. B: The PSCs of a monosynaptic response cell. C: The PSCs of polysynaptic response cells (two types of synaptic response).

2.2 无反应型PSCs的变化规律

出生后1-4周龄视皮层神经元的PSCs均有部分表现为无反应型, 睁眼前、后组所记录的神经元分别为89个和67个, 其中无反应型细胞的百分率分别为57.3%和11.94%。两组间比较有非常显著性差异(P<0.001), 见表1。

2.3 多突触反应型PSCs的变化规律

出生后1-4周龄视皮层神经元的PSCs均有部分表现为多突触反应, 睁眼前组中多突触反应型细胞的百分率为12.36%,睁眼后组中则为31.34%。两组间比较有非常显著性差异(P<0.01), 见表2。

表1. 睁眼前后组PSCs为无反应型的细胞计数

Table 1. Distribution of silent responsive cells before and after eyes opening

	Postnatal d 4-14	Postnatal d 15-28
Silent responsive cells	51	8*
Responsive cells	38	59
n	89	67

*P<0.001, compared with postnatal d 4-14.

表2. 睁眼前后组中PSCs为多突触反应型细胞的计数

Table 2.Distribution of polysynaptic responsive cells before and after postnatal d 14

	Postnatal d 4-14	Postnatal d 15-28
Polysynaptic responsive cells	11	21*
Monosynaptic responsive cells	27	38
n	38	59

*P<0.01 compared with postnatal d 4-14.

2.4 不同发育阶段视皮层神经元PSCs各项指标之间的比较

4-7 d龄的细胞PSCs多表现为无反应型, 细胞的PSCs延迟时间随日龄增长明显延长。在同一刺激强度下(0.4 mA), 将PSCs的各指标进行组间比较,见表3。(1)输入阻抗: 睁眼前各组之间(即1周龄组与2周龄组)无显著性差异, 睁眼后各组之间(即3周龄组与4周龄组)有显著性差异。睁眼前、后组之间有显著性差异, P<0.05。随着年龄增长, 输入阻抗值逐渐减小。(2) PSCs的峰值、到达峰值的时间、 10-90%上升时间、 10-90%延迟时间、半波宽、潜伏期: 1周龄组分别与2周龄、 3周龄、 4周龄组之间有非常显著性差异。

表3. 不同年龄组神经元在-70 mV时PSCs各项指标之间的比较

Table 3. Electrophysiological properties at -70 mV in neurons at different postnatal days

	Postnatal d 4-7	Postnatal d 8-14	Postnatal d 15-21	Postnatal d 22-28
n	39	50	35	32
Input resistance (MΩ)	1493.35±504.30	712.30±569. 45	390.37±157.39*△△	271.18±118.00**##△△△
Amplitude (pA)	-0.87±3.63	-24.21±39.65**	-52.26±68.57**	-121.55±87.45***△△△#
Latency to peak (ms)	0.88±3.70	15.18±13.57***	21.55±17.48***	19.86±20.42***
10-90% rising time (ms)	0.58±0.23	6.57±6.75***	7.56±7.89**	10.68±14.98**
10-90% decay time (ms)	0.98±4.11	63.23±108.22**	84.90±100.96**	125.22±118.62***
Half-width (ms)	0.50±2.20	20.05±27.85**	28.83±31.62**	36.53±39.77***
Latency to onset (ms)	0.38±1.60	6.22±4.83***	6.24±4.23***	4.25±3.54***

*P<0.05, **P<0.01， ***P<0.001, compared with postnatal d 4-14; △P<0.05, △△P<0.01, △△△P<0.001 compared with postnatal d 8-14; #P<0.05, ##P<0.01 1 compared with postnatal d 15-21．

2.5 大鼠发育阶段视皮层神经元的形态学观察

成功标记23例细胞, 其大致类型可分为锥体细胞、非锥体细胞、神经胶质细胞和未分化细胞(图2A-E)。锥体细胞的树突分枝较分散, 除主树突向浅层走行, 与浅层的神经元建立轴突联系外, 其水平方向的树突又与邻近细胞柱的神经元之间形成广泛的侧枝联系。星形细胞的突起较多, 轴突大多较短。篮状细胞的轴突分支呈水平方向伸展。未分化细胞表现为仅有致密着染的胞体, 无树突及轴突。神经胶质细胞则有一个非常致密的局部轴突区域, 这3例神经胶质细胞均为1周龄, 其PSCs均表现为无反应型。

2.6 视皮层神经元成熟状态的分布及形态学特征

2.6.1视皮层不同成熟状态神经元与年龄的关系

根据细胞的形态学特征, 从成熟度的角度将锥体细胞分为3类: 幼稚型、中间型和成熟型神经元(图3A-C)。成熟型神经元的树突分支丰富并跨过整个皮层厚度, 广泛的侧枝与各层神经元建立突触联系。中间型神经元的树突分支也向其他层次延伸, 但分支较少。幼稚型神经元的胞体最小, 只有一个短树突。不同成熟程度的神经元在各组的分布情况为: 1周龄组中幼稚型占100%, 2周龄以后成熟者占100%, 而1-2周龄组中三种成熟程度的细胞混合存在, 其中中间型神经元所占的百分率最高, 为57.14%。

2.6.2 不同成熟度神经元的形态特征及被动膜学特性的比较

随着年龄增长, 神经元胞体增大, 呈圆、椭圆形或多边形。轴突出现较早, P4天即可见到, 轴突自胞体或主树突近胞体处发出, P7天内即可观察到轴突侧枝的形成,树突的发育相对较晚,但随着动物年龄的增长变化更为明显, 表现为树突增粗增长, 分支增多, 树突野范围增大, 以及树突棘的出现。在树突上尚可见到膨体或串珠样物质。成熟型神经元的输入阻抗最低, 树突分支丰富。幼稚型神经元的输入阻抗最高, 没有树突分支(表4)。

图2.大鼠发育阶段视皮层神经细胞照片

Fig. 2.Photographs of biocytin staining of neurons in the visual cortex of developing rats. A: A 17-day-old pyramidal cell in layer Ⅲ of the visual cortex. B: A 17-day-old satellite cell in layer Ⅲ of the visual cortex. C: A 12-day-old basket cell in layer Ⅴ of the visual cortex. D: A 5-day-old neuroglial cell in layer Ⅲ of the visual cortex. E: A 7-day-old undifferentiated cell in layer Ⅳ of the visual cortex. Scale bar, 50 μm.

表4. 不同成熟度神经元的输入阻抗及形态学特性比较

Table 4. Input resistance and morphological properties of neurons of different mature degrees

	Immature cells (n=3)	Mid-mature cells (n=4)	Mature cells (n=8)
Main dendrite	1.1±0.3	4.5±1.1**	7.4±1.0**△△
Secondary dendrite	0	4.1±1.3**	8.2±1.8**△△
Terminal dendrite	0	3.2±1.0**	14.5±4.7**△△
Input resistance (MΩ)	1378.1±110.4	526.3±41.5**	241.0±25.1**△△

**P<0.01 compared with immature cells． △△P<0.01 compared with mid-mature cells．

图3. 视皮层不同成熟程度的细胞照片及其相应的PSCs (生物素染色)

Fig. 3.Photograph and postsynaptic currents of cells of different degrees of morphological maturity in the visual cortex (biocytin staining). A: A 7-day-old immature cell in layer Ⅳ of the visual cortex. Input resistance, 1512 MΩ, Scale bar, 50 μm. B: A 12-day-old mid-mature cell in layer Ⅲ of the visual cortex. Input resistance, 625 MΩ. Scale bar, 50 μm. C: A 12-day-old mature cell in layer Ⅴ of the visual cortex. input resistance, 196 MΩ. Scale bar, 100 μm.

3讨论

在一定的钳制电压下, 把刺激后不能诱导出反应的突触称为静息突触, 把刺激后可以诱导出反应的突触称为功能突触。本研究中无反应型和多突触反应型细胞各自的数量在大鼠睁眼前后有明显差异, 提示出生后视皮层神经元之间逐渐建立起广泛的突触联系, 视觉经验在神经元突触联系功能状态的改变中起重要作用[5], 静息突触向功能突触的转变可能是视觉依赖性突触联系修饰的一种形式。

我们发现, 大鼠在发育期间, PSCs的延迟时间随年龄增长而逐渐延长, 不同于海马PSCs的快波特点[6], 提示传入纤维传导兴奋到达细胞胞体或树突经历了较长的时间。PSCs的10-90%延迟时间取决于几个过程, 包括突触间隙神经递质的释放和清除以及突触后通道的动力学性质。实验和理论证据提示，神经递质的释放和清除相对于突触电流的时间过程而言相当快速, 故突触电流失活的速度快慢关键取决于神经递质和受体分离[7]或对受体失去敏感的过程, 而不是递质的扩散和清除。资料显示, 在海马中阻断γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)再摄取并不改变微小刺激引起的抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic currents, IPSCs)。因此, 1周龄与2、 3、 4周龄细胞的PSCs延迟时间有明显差异, 可能是突触后的兴奋性和抑制性受体和/或通道本身的功能同源异质性所造成, 提示在年长者的神经元中, 通道的平均开放时间较年幼者短和/或受体密度小。

在23例染色成功的细胞中, 我们记录到3例(13.04%)未分化细胞和3例(13.04%)神经胶质细胞, 其突触电流均表现为静息状态即无反应型。推测其机制之一可能是由于突触附近的胶质细胞突起收缩, 使细胞外K+水平局部增高, 导致突触后的神经元处于休眠状态[8, 9]。标记成功的细胞中锥体细胞占52.17%, 主要分布于视皮层Ⅱ-Ⅲ层和Ⅴ层-Ⅵ层。Ⅱ-Ⅴ层的锥体细胞发出轴突的远端部分构成各层神经元主要的突触前成分。在本研究中, 高输入阻抗的神经元在形态学上属幼稚型, 而低输入阻抗者为成熟型, 三种成熟状态的视皮层细胞只在2周龄的动物中混合存在, 这与文献报道大鼠海马不同成熟状态的颗粒细胞在生后2-4周内都混合存在有所不同[3], 提示在视皮层中年龄与细胞形态学成熟的同步化程度大于海马等皮层下结构。另外, 代表细胞成熟度的输入阻抗值在出生后逐渐减小, 睁眼前组与睁眼后组之间有显著性差异, 表明2周龄以前的细胞输入阻抗较高, 成熟度较低; 2周龄以后的细胞输入阻抗较低, 成熟度较高。3周龄组与4周龄组神经元的成熟度相差也非常显著, 说明到了大鼠视皮层可塑期高峰的始发阶段(第4周)神经元的膜学特性开始了较大变化。本研究中2周龄以后的细胞输入阻抗一般在660 MΩ以下, 未发现高输入阻抗者。对比刘应兵等报道海马的所有年龄组细胞中都存在高、低输入阻抗的神经元, 即同一年龄组中成熟、幼稚神经元并存, 本结果提示, 在视皮层年龄与细胞电生理特性成熟的同步化程度也大于海马等皮层下结构。

参考文献

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