生理学报Acta Physiologica Sinica,  April  25, 2003, 55(2): 213-218

Received 2002-08-05

Accepted 2002-11-24

This work was supported by a  grant from Guangdong Provincial Natural Science Foundation (NO.013141).

*Corresponding author.  Tel: +86-20-87330647;  E-mail: thwang@gzsums.edu.cn 

 

 研究论文

膜雌激素受体介导一氧化氮合酶活性增高的快速非基因效应

王庭槐*,  付晓东,  杨丹,  谈智,  潘敬运

中山大学医学院生理学教研室,  广州 510080

 

摘要:  实验利用新生小牛胸主动脉内皮细胞(BAECs)作为模型,  观察17β-雌二醇(E2)、 E2BSA对BAECs中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的快速激活作用,  并探讨了丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在其中的作用。结果显示,  不同浓度的E2 (0.001-1 μmol/L)作用于BAECs 15 min均能快速激活eNOS;  0.01 μmol/L浓度的E2作用于BAECs, 5 min即能激活eNOS,  15 min达到最大效应,  随后eNOS快速失活;  E2BSA (17.5 ng/ml)作用于BAECs, 15 min同样可激活eNOS。E2、 E2BSA激活eNOS的作用均能被雌激素受体(ER)拮抗剂tamoxifen (0.1 μmol/L)或MAPK激酶特异抑制剂PD98059 (50 μmol/L)所阻断。放线菌素D (25  μg/ml)不能阻断E2、 E2BSA对eNOS的激活作用。E2 (0.01 μmol/L)、 E2BSA (17.5 ng/ml)作用于BAECs 15  min后可明显促进p42/p44磷酸化MAPK蛋白表达, 而对p42/p44 MAPK总蛋白表达无影响。Tamoxifen可部分阻断E2、 E2BSA激活p42/p44磷酸化MAPK的作用。这些结果提示,  BAECs膜上可能存在膜雌激素受体(membrane estrogen receptor, mER),  E2、 E2BSA作用于mER后可通过MAPK信号途径快速激活eNOS。

 

关键词: 雌激素;  膜雌激素受体;  一氧化氮合酶;  丝裂素活化蛋白激酶;  血管内皮细胞

中图分类号: Q463; R331.36

 

Membrane estrogen receptor mediates the rapid  nongenomic activation of endothelial nitric oxide synthase by estrogen

WANG Ting-Huai*, FU Xiao-Dong, YANG Dan, TAN Zhi, PAN Jing-Yun

Department of Physiology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080

 

Abstract:  In the present study,  confluent bovine aortic endothelial cells (BAECs) were used to study the rapid nongenomic effects of 17β-estradiol and the membrane impermeable conjugated 17β-estradiol (E2BSA) on the activation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and mitogen activated protein kinase (MAPK). eNOS activation was assessed in whole cells by measuring [3H]L-arginine conversion to [3H]L-citrulline. MAPK activity was determined by Western blotting. The results obtained show that the addition of various concentrations of E2 (0.001-1 μmol/L) resulted in 122±29,  186±17,  83±20 and 157±29% increases in eNOS activity,  respectively,  in BAECs within 15 min of exposure to the hormone. E2  (0.01 μmol/L)-stimulated eNOS activity was detectable during 5-,  15- and 30- min incubation which yielded increases of 37±6,  56±9 and 38±8%,  respectively. The increase reached a plateau from 15 through 30 min and rapidly declined thereafter.  E2BSA （17.5  ng/ml） also enhanced eNOS activity by an increase of 35±9% above the basal activity. The effect of E2 and E2BSA on eNOS activation was unaffected by actinomycin D （25 μg/ml） but was obviously inhibited by tamoxifen (0.1 μmol/L) and PD98059 (50 μmol/L). Compared with control， E2 and E2BSA stimulation of  BAECs for 15 min caused an increase in MAPK activity by 428±17 and 360±14% respectively. This effect was blocked by tamoxifen. These results suggest that there might be the membrane estrogen receptor localized on BAECs,  which mediates the rapid  nongenomic effect of estrogen on eNOS activation through MAPK pathways.

 

Key words: estrogen; membrane estrogen receptor; nitric oxide synthase; mitogen-activated protein

 kinase; vascular endothelial cell

 

近年来的研究提示,  雌激素的心血管保护作用可能与一氧化氮(nitric oxide, NO)有关[1]。NO可以调节血管张力,  抑制血管平滑肌细胞增殖迁移。我们以往的研究表明: 雌激素可以促进血管内皮细胞eNOS mRNA表达,  促进NO释放[2]。其作用机制,  传统上用“基因表达学说”来阐述,  称为雌激素的基因效应(genomic- effects)。新近的研究发现,  雌激素可以快速诱发血管舒张,  此作用由NO介导,  不涉及到基因转录和蛋白合成,  由此认为血管内皮细胞膜上可能存在有膜雌激素受体(membrane estrogen receptor, mER),  雌激素可以与mER结合而发挥其快速非基因效应(nongenomic effects)[3-5]。目前对mER的结构和功能尚不十分清楚, 其介导的心血管保护效应与NO的关系以及细胞内信号转导途径还未完全阐明[6]。本研究旨在培养的牛主动脉内皮细胞(BAECs)上,  观察17β-雌二醇(E2)对eNOS活性的快速影响,  从功能上证实BAECs 上mER的存在,  并进一步探讨MAPK信号途径在其中的作用,  从而为雌激素的心血管保护作用途径提供新的见解。

 

1材料和方法

1.1 BAECs的培养

在无菌条件下取新生小牛胸主动脉(广州市奶牛研究所提供),  按照Ishikawa等[7]的方法分离、 培养BAECs, 原代BAECs呈铺路石状,  VⅢ因子染色阳性。实验采用传代培养第3-5代的细胞,  培养液为含10%小牛血清的无酚红DMEM,  处理前24 h换用无血清而加入转铁蛋白等补充营养的无酚红DMEM。

1.2 eNOS活性测定[8]

采用NOS Assay Kit进行测定。测定原理: eNOS在氧分子和NADPH以及Ca2+等辅助因子存在时,  催化[3H]L-精氨酸(L-Arg)生成[3H]L-瓜氨酸(L-Cit)和NO,  分离标记的L-Arg 和L-Cit,  用液闪烁记数仪测定eNOS催化生成的L-Cit放射强度(cpm), 以生成的L-Cit cpm数反映eNOS活性。以每孔1×106个细胞接种细胞于六孔板,  含1 mmol/L EDTA的PBS液消化收集细胞后,  加入匀浆缓冲液,  超声破碎细胞,  用Bradford法测定蛋白浓度。调节蛋白浓度至5-10 μg/ml。每10 μl蛋白提取液中加入40 μl反应混合液(其中含25 μl反应缓冲液,  5 μl 10 mmol/L NADPH,  1 μl 37 kBq/ μl  [3H]L-精氨酸,  5 μl 6 mmol/L CaCl2, 4 μl dH2O), 同时加入5 μl 1 μmol/L 钙调素,  在22-37℃孵育1 h后,  加入400 μl反应终止液终止反应,  100 μl平衡树脂充分悬浮混合液,  将上述混合液转入试剂盒提供的旋转杯中,  离心(12000 r/min, 30 s), 收集洗脱液,  加入8 ml闪烁液,  摇匀放置在液闪烁记数仪上进行放射性活性记数测定。

1.3 免疫印迹法检测磷酸化MAPK蛋白(磷酸化p42/p44)表达

细胞经处理后,  每孔加入100 μl蛋白提取液,  其组成为(mmol/L):β磷酸甘油 20、  焦磷酸钠50、  氟化钠(NaF) 50、  乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 5、  乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA) 5、  氯化钠(NaCl)50、  亮肽素(leupeptin)0.02和β-巯基乙醇0.3% (v/v)。收集提取液,  于4℃离心 (13000 r/min, 10 min), 取上清液,  按Bradford法测定蛋白浓度。将上述蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳,  以电印迹转移法转至硝酸纤维素膜上,  对含2%小牛血清白蛋白(BSA)的TBST溶液室温封闭1 h,  分别与一抗(p42/p44磷酸化抗MAPK抗体,  其稀释度为1∶5000) 4℃孵育过夜和二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG抗体)室温孵育1 h,  与ECL试剂反应1 min, X线压片曝光10 s-1 min,  以IBAS图像处理系统对胶片进行扫描测定感光区带的感光密度,  并进行积分处理。

1.4  试剂

NOS Assay Kit购自Cayman公司;  17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)、 E2BSA (≈38 mol E2: mol BSA)、  tamoxifen、 PD98059、 actinomycin D、 抗磷酸化p42/p44单克隆抗体、 NADPH均购自Sigma公司;  [3H]L-Arginine购自Amersham公司,  化学发光增强剂(ECL)购自New England Biolabs公司,  其他试剂均为国产分析纯。

1.5  统计处理

结果用mean±SD表示,  以单因素方差分析、 组间t检验作统计学处理,  P<0.05被认为有统计学差异。

 

2结果

2.1  E2、 E2BSA对eNOS活性的影响

eNOS活性以生成的L-Cit cpm数来反映。与对照组(124.38±5.94 pmol L-Cit /mg protein/min)比较,  分别以0.001、 0.01、 0.1、 1 μmol/L的E2处理BAECs 15 min,  可使eNOS活性分别增加(122±29)%、  (186±17)%、  (83±20)%和(157±29)%, 以0.01 μmol/L的作用最强(n=4,  P<0.05, 图1)。以0.01 μmol/L的E2分别作用于BAECs 5、 15、 30 min,  与对照组(163.18±6.40 pmol L-Cit /mg protein/min)相比,  eNOS活性分别增高(37±6)%、  (56±9)%、  (38±8)%,  其作用有明显差异(n=4,  P<0.01, 图2), 而作用1和4 h后eNOS活性与对照组相比无明显差异(n=4,  P>0.05, 图2)。分别以雌激素受体拮抗剂tamoxifen(0.1 μmol/L)或MAPK激酶特异抑制剂PD98059 (50 μmol/L)预处理BAECs 1 h 后,  再以0.01 μmol/L E2作用于BAECs 15 min,  其增高eNOS活性的作用与单纯E2 (0.01 μmol/L)处理组相比,  分别减少 (48±8)%及(43±12)% (n=4, P<0.01, 图3),  用转录抑制剂放线菌素D (25 mg/L)预处理BAECs 2 h不能阻断E2的作用(n=4, P>0.05, 图3)。E2BSA (17.5 ng/ml,  相当于游离的E2浓度为0.01 μmol/L)作用于BAECs 15 min后,  与对照组(120.16±4.21 pmol L-Cit /mg protein/min)相比,  eNOS活性增高(35±9)%,  其增高eNOS活性的作用同样可被tamoxifen (0.1 μmol/L)或PD98059所阻断(n=4,  P<0.01, 图 4),  而放线菌素 D (25 mg/L) 不能阻断该作用(n=4, P>0.05, 图3)。单纯的tamoxifen、 PD981059、 放线菌素D处理组中eNOS活性与对照组相比无明显差异(n=4, P>0.05, 图3、4)。

图1.17β-雌二醇作用于BAECs 15 min后对eNOS活性的影响

Fig. 1.Effect of E2 on the eNOS activity in BAECs in 15 min. **P<0.01 vs control,  ***P<0.001 vs control.

图2.17β-雌二醇作用于BAECs不同时间后对eNOS活性的影响

Fig. 2.Effect of E2 on the eNOS activity in BAECs at  indicated times. E2, 0.01 μmol/L.  ***P<0.001 vs control, **P<0.01 vs control.

图3.Tamoxifen、 PD98059和Act D对17β-雌二醇作用于BAECs 15 min提高eNOS活性作用的影响

Fig. 3.Influence of Ta,  PD98059 and Act D on the effect of E2 on eNOS activation in 15 min. E2, 0.01 μmol/L; tamoxifen, 0.1 μmol/L; PD98059, 50 μmol/L; Act D,  25  μg/ml. ***P<0.001 vs control,  **P<0.01 vs control, ##P<0.01 vs E2.

图4.Tamoxifen、 PD98059和Act D对E2BSA作用于BAECs 15 min提高eNOS活性作用的影响

Fig. 4.Influence of Ta, PD98059 and Act D on the effect of E2BSA on eNOS activation in 15 min. E2BSA, 17.5 ng/ml; tamoxifen,  0.1 μmol/L; PD98059,  50 μmol/L; Act D,  25  μg/ml. **P<0.01 vs control,  ###P<0.001 vs E2BSA.

 

2.2 E2、 E2BSA对p42/p44磷酸化MAPK蛋白表达及p42/p44总蛋白表达的影响

用磷酸化p42/p44 MAPK蛋白的表达量来表示MAPK活性的变化。与对照组相比,   E2 (0.01 μmol/L)、 E2BSA (17.5 ng/ml)作用于BAECs 15 min后,  分别使p42/p44磷酸化MAPK蛋白表达增加了(428±17)%及(360±14)% (n=4,  P<0.001,  图5、 6)。用雌激素受体拮抗剂tamoxifen (0.1 μmol/L)预处理BAECs 1 h后,  可明显抑制E2、 E2BSA作用(n=4,  P<0.01,  图5、 6)。E2 (0.01 μmol/L)、 E2BSA (17.5 ng/ml)作用于BAECs 15 min后,  与对照组相比,  p42/p44总蛋白表达无明显改变。

图5.Tamoxifen对E2诱导BAECs ERK活化的影响

Fig. 5.Influence of tamoxifen on the ERK activity induced by E2 in BAECs.  E2,  0.01 μmol/L; tamoxifen,  0.1 μmol/L. ***P<0.001 vs control, ##P<0.01 vs E2.

图6.Tamoxifen对E2BSA诱导BAECs ERK活化的影响

Fig. 6.Influence of tamoxifen on the ERK activity induced by E2BSA in BAECs. E2BSA,  17.5 ng/ml; tamoxifen,  0.1 μmol/L. **P<0.01 vs control,  ##P<0.01 vs E2BSA.

 

3 讨论

近年来,  许多研究认为雌激素的心血管保护作用与NO有关,  但其作用机制尚未完全阐明。NO在体内由L-精氨酸和分子氧在NOS催化下产生,  血管内皮细胞存在的NOS以eNOS为主。本研究结果显示,  不同浓度的E2作用于BAECs 15 min, 均能激活eNOS,  以0.01 μmol/L E2作用最强。E2 (0.01 μmol/L)作用于BAECs 5 min即能使eNOS活性增高,   15 min达到最大效应,  随后30 min内此作用逐渐消失。Hong等人报道 E2作用于BAECs 5 min后NO产生增多,  随后30 min内NO产生逐渐减少[9]。这与本实验的结果相符,  表明雌激素可以通过快速激活eNOS而促进BAECs中NO的合成和释放。NO可弥散至血管平滑肌细胞,  与胞浆可溶性鸟苷酸环化酶结合,  升高cGMP水平,  继之胞浆中Ca2+减少,  肌球蛋白轻链去磷酸化而导致血管舒张。这可能是雌激素快速诱发冠状动脉血管舒张的机制[10]。

研究表明,  eNOS蛋白表达增加或其羧基端丝氨酸残基磷酸化,  均可使eNOS活性上升, NO产生增多[11]。如本研究室的前期工作表明,  E2作用于BAECs 48 h,  能促进eNOS mRNA表达,  进而NO释放增加[2]。此作用由于涉及到基因转录和蛋白合成,  所需时间较长,  Lantin等人报道E2促进eNOS mRNA表达的作用最少需要1 h以上 [12]。本实验观察到雌激素作用于BAECs 5 min即能激活eNOS,  在时间效应上显然与雌激素的传统作用机制不相符合。放线菌素D (25  μg/ml)作为转录抑制剂,  不能阻断E2快速激活eNOS的作用,  表明E2的此种作用不依赖基因转录,  是一种快速非基因效应, eNOS在激活30 min后快速失活,  可能为eNOS蛋白磷酸化和去磷酸化作用的结果。为了进一步排除核内ER的作用,  我们观察了E2BSA作用于BAECs后对eNOS活性的影响。E2BSA为不能通透细胞膜的雌激素大分子复合物, 不包含游离E2,  不能作用于雌激素反应元件(ERE)而影响转录[13]。结果表明,  E2BSA作用于BAECs 15 min, 同样可激活eNOS,  放线菌素D不能阻断该作用。以上结果提示, 在BAECs上可能存在mER,  E2通过mER介导eNOS的快速激活。目前mER的分子结构尚未阐明。Pappas等人应用共聚焦显微镜技术研究发现,  核ER的单克隆抗体H222、 H226以及多克隆抗体ER21均能与GH3/B6大鼠垂体瘤细胞膜上的蛋白相结合,  由此认为细胞膜上有mER,  其分子结构与核ER相近[14]。此外,  Razandi等人的研究表明,  将ERα和ERβ的cDNA转染入卵巢细胞后,  在膜上有少量ERα和ERβ表达[15]。但Das等人的研究表明,  mER的分子结构不同于核ER,  且对雌激素受体拮抗剂ICI182780不敏感[16] 。本研究结果显示,  雌激素受体拮抗剂tamoxifen (0.1 μmol/L)明显抑制E2、 E2BSA激活eNOS的作用,  表明mER与核ER结构上有相近之处, 支持Pappas等人的观点。

为了探讨雌激素通过mER快速激活eNOS的信号转导途径,  我们观察了MAPK信号途径在其中的作用。MAPK为多种细胞外信号(压力超负荷、 激素、 神经递质、 细胞因子和生长因子等)从细胞表面受体传向细胞内的一条重要信号转导通路。本研究发现,  E2、 E2BSA作用于BAECs 15 min,  p42/p44磷酸化MAPK蛋白含量明显增多。雌激素受体拮抗剂tamoxifen可抑制E2的作用。MAPK特异抑制剂PD98059预处理BAECs后可明显抑制E2、 E2BSA对eNOS的激活作用。以上结果表明,  雌激素快速激活eNOS的作用可由MAPK信号通路所介导。很多研究表明MAPK可通过促进eNOS基因转录和蛋白表达而使eNOS活性上升[17],  但对MAPK磷酸化eNOS而导致其激活的报道较少。目前还不清楚MAPK是通过直接磷酸化eNOS还是通过其他信号途径间接磷酸化eNOS而导致其激活。Bernier等人的研究表明,  缓激肽作用于内皮细胞后可激活MAPK,  后者可直接磷酸化eNOS,  但具体的磷酸化位点尚未明确[18]。最近有研究认为,  雌激素通过mER而快速激活eNOS的作用可由PI3-kinase-Akt信号通路所介导[19]。在这个过程中,  MAPK信号转导通路与PI3-kinase-Akt信号通路之间有无联系目前尚不清楚,  是我们下一步将要研究的问题。此外,  Bunone等人的研究表明MAPK激活后可以促进核内ER的转录活性[20],  雌激素是否能够通过此途径实现mER和核内ER之间的相互作用,  需要进一步探讨。

 

参考文献

[1]Binko J, Majewski H. 17 beta-Estradiol reduces vasoconstriction in endothelium-denuded rat aortas through inducible NOS. Am J Physiol 1998;274(3 Pt 2):H853-H859.

[2]Wang TH (王庭槐),  Yang D,  Liu PQ, Gong SZ,  Lu W,  Pan JY. 17β-estradiol induced nitric oxide release in vascular endothelial cells. Acta Physiol Sin (生理学报)  2000;52(6): 479-482 (Chinese,   English abstract).

[3]Williams JK, Adams MR, Herringron DM, Clarkson TB. Short-term administration of estrogen and vascular responses of atherosclerotic coronary arteries.J Am Coll Cardiol  1992;20:452-457.

[4]Gilligan DM, Badar DM, Panza JA. Quyyumi AA, Cannon RO.Acute vascular effects of estrogen in  postmenopausal women. Circulation 1994;90:786-791.

[5]Farhat MY, Lavigne MC, Ramwell PW.The vascular protective effects of estrogen on the cardiovascular system.N Engl J Med 1999;340:1801-1811.

[6]Mendelsohn ME.Nongenomic, estrogen receptor-mediated activation of endothelial nitric oxide synthase. Cirs Res  2000;87:956-960.

[7]Ishikawa M, Ouchi Y, Akishita M, Kozaki K, Toba K, Namiki A, Yamaguchi T,  Orimo H.Immunocytochemical detection of parathyroid hormone-related protein in vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun  1994;199:547-551.

[8]Sessa WC, Harrison JK, Barber CM, Zeng D, Durieux ME, Dangelo DD, Lynch DD, Peach MJ. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding endothelial cell nitric oxide synthase.J Biol Chem 1992;267:15274-15276.

[9]Hong PK, Jee YL, Jeongmi KJ, Bae SW, Lee HK, Jo I.Nongenomic stimulation of nitric oxide release by estrogen receptor is mediated by estrogen receptor α localized in caveolae. Biochem Biophys Res Commun  1999;263(1):257-262.

[10]Gilligan DM, Quyyumi AA, Cannon RO III.Effects of physiological levels of estrogen on coronary vasomotor function in postmenopausal women. Circulation 1994;89:2545-2551.

[11]Wu KK.Regulation of endothelial nitric oxide synthase activity and gene expression. Ann N Y Acad Sci  2002;962:122-130.

[12]Lantin H, Regina L, Charles R,  German Z, Chen Z, Shaul PW.Estrogen acutely stimulates nitric oxide synthase activity in fetal pulmonary artery endothelium. Am J Physiol  1997;273:L119-L126.

[13]Razandi M, Pedram A, Levin ER.Plasma membrane estrogen receptors signal to antiapoptosis in breast cancer. Mol Endocrinol 2000;14:1434-1447.

[14]Pappas TC, Gametchu B, Watson CS.Membrane estrogen receptors identified by multiple antibody labeling and impeded-ligand binding. FASEB J  1995;9:404-410.

[15]Razandi M, Pedram A, Greene GL, Levin ER.Cell membrane and nuclear estrogen receptors derive from a single transcript:studies of ERα and ERβ  expressed in CHO cells. Mol Endocrinol  1999;13:307-319.

[16]Das SK,  Taylor JA, Korach KS, Paria BC, Dey SK, Lubahn DB.Estrogenic responses in estrogen receptor-αdeficient mice reveal a distinct estrogen signaling pathway. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:12786-12791.

[17]Davis ME,  Cai H,  Drummond GR,  Harrison DG. Shear stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circ Res 2001;89(11):1073-1080..

[18]Bernier SG,  Haldar S,  Michel T. Bradykinin-regulated interactions of the mitogen-activated protein kinase pathway with the endothelial nitric-oxide synthase. J Biol Chem 2000;275:30707-30715.

[19]Haynes MP, Sinha D, Strong RK, Collinge M, Fulton D, Morales-Ruiz M, Sessa WC, Bender JR.Membrane estrogen receptor engagement activates endothelial nitric oxide synthase via the PI3-Kinase-Akt pathway in human endothelial cells. Circ Res 2000;87:677-682.

[20]Bunone G, Briand PA, Miksicek RJ, Picard D.Activation of the unliganded estrogen receptor by EGF involves the MAP kinase pathway and direct phosphorylation. EMBO J 1996;15:2174-2183.