生理学报Acta Physiologica Sinica,  April  25, 2003, 55(2): 219-224

Received 2002-08-02

Accepted 2002-12-10

This work was supported by the  National Science Foundation of Hebei Province (No.302494).

*Corresponding author. Tel: +86-311-6265607, 6266837;  E-mail: liwbsjz@yahoo.com.cn

 

 研究论文

一氧化氮合酶抑制剂L-NAME对大鼠脑缺血耐受诱导的影响

刘惠卿, 李文斌*, 冯荣芳, 李清君, 陈晓玲, 周爱民, 赵红岗, 艾洁

河北医科大学基础医学研究所病理生理学研究室,  石家庄 050017

 

摘要:  采用大鼠四血管闭塞全脑缺血耐受模型和脑组织切片形态学方法, 观察应用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME对大鼠海马CA1区脑缺血耐受(BIT)诱导的影响, 在整体水平探讨一氧化氮(NO)在BIT诱导中的作用。54只Wistar大鼠凝闭双侧椎动脉后分为6组:(1)假手术组(n=6): 分离双侧颈总动脉, 但不阻断脑血流; (2)损伤性缺血组(n=6): 全脑缺血10 min; (3)预缺血+损伤性缺血组(n=6): 脑缺血预处理(CIP)3 min, 再灌注72 h后行全脑缺血10 min; (4)L-NAME组: 分别于CIP前1 h和后1、  12及36 h腹腔注射L-NAME (5 mg/kg),每个时间点6只动物, 其余步骤同预缺血+损伤性缺血组; (5)L-NAME+L-精氨酸组(n=6): 于CIP前1 h腹腔注射L-NAME (5 mg/kg)和L-精氨酸(300 mg/kg), 其它步骤同L-NAME组; (6)L-NAME+损伤性缺血组(n=6): 于腹腔注射L-NAME (5 mg/kg) 72 h后行全脑缺血10 min。实验结果表明, (1)单纯10 min全脑缺血可使海马CA1区组织学分级增加(表明损伤加重), 神经元密度降低(P<0.01); (2)预缺血+损伤性缺血组的海马CA1区组织学分级、 神经元密度与假手术组相比, 无显著性差别(P>0.05); (3) L-NAME组中, 应用L-NAME后海马CA1区组织学分级增加, 神经元密度降低, 与预缺血+损伤性缺血组相比有显著性差异(P<0.05), 表明L-NAME可阻断CIP对神经元的保护作用; (4)  L-NAME+L-精氨酸组与L-NAME组相比, 海马CA1区组织损伤明显减轻(P<0.05), 但与预缺血+损伤性缺血组相比仍有显著性差别(P<0.05), 提示L-精氨酸可部分逆转L-NAME的作用; (5) L-NAME+损伤性缺血组的组织学表现与损伤性缺血组相同(P>0.05)。这些结果表明， 在整体情况下NO参与BIT的诱导。与CIP前1 h及后1、 12 h给予L-NAME组相比, CIP后36 h给予L-NAME对CIP保护作用的阻断效应明显减弱, 提示NO在CIP后较早阶段即开始参与BIT的诱导。

 

关键词: 神经生物学; 脑缺血预处理; 一氧化氮; L-硝基-精氨酸甲酯; 海马; 大鼠

中图分类号: Q426; R338

 

Effect of nitric oxide synthase  inhibitor L-NAME on the induction of brain ischemic  tolerance in rats

LIU Hui-Qing, LI Wen-Bin*, FENG Rong-Fang, LI Qing-Jun, CHEN Xiao-Ling, ZHOU Ai-Min, ZHAO Hong-Gang, AI Jie

Department of Pathophysiology, Institute of Basic Medicine, Hebei Medical University,  Shijiazhuang 050017

 

Abstract: To explore the role of NO in the induction of brain ischemic tolerance (BIT) in vivo, the effect of nitric oxide synthase (NOS) inhibitor L-NAME on the induction of BIT induced by cerebral ischemic preconditioning (CIP) was investigated in the hippocampal CA1 subfield in  CIP and ischemic insult models established by  rat four-vessel occlusion using brain tissue section and thionine staining methods. Fifty-four male Wistar rats were divided into 6 groups: (1) sham-operated group (n=6): bilateral common arteries were separated without occluding the cerebral blood flow; (2) ischemia group (n=6): an ischemic insult for 10 min was given; (3) CIP+ischemia group (n=6): 3-min CIP was preformed 72 h prior to 10-min ischemic insult; (4) L-NAME group (total n=24, n=6 for each subgroup): L-NAME (5 mg/kg, i.p.) was administered 1 h prior to CIP and 1, 12  and 36 h after CIP, respectively. Other procedures were the same as those for the CIP+ischemia  group; (5) L-NAME+L-Arg group (n=6): L-NAME (5 mg/kg, i.p.) and L-Arg (300 mg/kg, i.p.) were administered 1 h prior to CIP, other procedures were the same as those for the L-NAME group; (6)  L-NAME+ischemia group (n=6): L-NAME (5  mg/kg, i.p.) was administered 72 h before the 10-min ischemic insult. The results showed that (1)10-min ischemic insult resulted in an increase in the histological grade (indicating a more serious tissue injury) and a decrease in pyramidal neuronal density (P<0.01); (2) the histological grade and neuronal density in hippocampal CA1 in the CIP+ischemia group were similar to those in the sham-operated group (P>0.05); (3) in the L-NAME group, administration of L-NAME brought about an increase in the histological grade and a decrease in neuronal density (P<0.01), suggesting that L-NAME blocked the protection of CIP; (4) the  neuronal damage in L-NAME+L-Arg group was slighter than that in the L-NAME group, but still more serious than that in the CIP+ischemia group, suggesting that L-Arg partly reversed the blocking effect of L-NAME; (5)   the morphological representations in L-NAME+ischemia group were basically similar to those in the ischemia group. The results mentioned above indicate that NO is involved in the induction of BIT in vivo. The blocking effect of L-NAME administered at 36 h after CIP was obviously weaker than the effects of L-NAME administered 1 h prior to CIP, and 1 or  12 h after CIP. It is suggested that NO is involved  in the induction of BIT at  an early stage and that the  involvement might  take place via activating cascades of the events.

 

Key words: neurobiology; ischemic preconditioning; nitric oxide; L-NAME; hippocampus; rats

 

预先给动物轻微、 短时、 不致引起神经元死亡的脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning, CIP), 可以在后续较严重的脑缺血损伤中对神经元产生保护作用, 这一现象被称为脑缺血耐受(brain ischemic tolerance, BIT)[1]。这一现象的发现为研究动物机体内源性抗缺血缺氧性损害的保护机制提供了新的思路, 因此倍受关注。研究表明, BIT的产生涉及神经介质、 受体及基因的表达等一系列过程。在BIT的诱导过程中, 细胞在信号启动与转导, 基因复制与转录, 蛋白合成与修饰等环节发生相应的变化。在信号的启动环节, 腺苷机制受到众多学者的重视[2, 3]。我室新近研究表明, 在BIT诱导过程中, 腺苷受体的数量及亲和力均增加, 进一步丰富了BIT诱导腺苷机制的研究[4]。但腺苷受体激动剂预处理对神经元所产生的保护作用较CIP所诱导的保护作用弱[2], 说明还有其它机制参与这一过程。近年来, 一氧化氮(NO)在缺血缺氧耐受诱导中的作用引起了人们的兴趣。Bilinska等[5]首先在心脏证实了NO在缺血耐受诱导中的作用。之后, 学者们应用大鼠离体脑片、 脑细胞培养及幼鼠缺氧耐受模型验证了NO在脑缺血缺氧耐受诱导中的重要作用[6-8]。但尚未见NO在整体状态下参与BIT诱导的报道。本研究利用大鼠全脑缺血耐受模型, 观察NO合酶(NOS)抑制剂L-NAME对BIT诱导的影响, 试图在整体水平探讨NO在BIT诱导中的作用, 为脑缺血性疾病的治疗提供新思路。

 

1  材料和方法

1.1 动物模型及分组

采用四血管闭塞法(4VO)制造大鼠全脑缺血模型[9]。健康雄性Wistar大鼠(250-320 g) 54只, 由河北医科大学实验动物中心提供。所有动物均首先进行双侧椎动脉凝闭, 方法如下: 10%水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉, 在颈部背侧纵切口约1.5 cm, 分离颈旁肌暴露第一颈椎横突, 在体式显微镜下寻找翼状孔, 插入电烙针凝闭双侧椎动脉。于颅骨钻孔、 包埋、 固定银制电极以供脑电监测。术后恢复48 h, 选用恢复良好的动物制作以下模型。 (1) CIP模型: 在乙醚麻醉下, 游离双侧颈总动脉, 待动物清醒后夹闭双侧颈总动脉3 min后恢复再灌流。(2)全脑缺血模型: 夹闭双侧颈总动脉10 min后恢复再灌流, 其余步骤同CIP模型。(3)脑缺血耐受模型[10]: 先给动物3 min CIP, 72 h后夹闭双侧颈总动脉10 min, 恢复再灌流。其余同CIP 模型。NOS抑制剂选用L-NAME (购自Sigma), 腹腔注射。实验过程中, 用白炽灯照射动物以维持直肠温度在37℃左右, 直到恢复活动。4VO前后观察动物脑电、 翻正反射及瞳孔变化等, 以判断是否发生脑缺血。

将实验动物随机分为6组: (1)假手术组(Sham, n=6): 只暴露双侧颈总动脉, 不阻断血流; (2)损伤性缺血组(Ischemia, n=6): 全脑缺血10 min; (3)预缺血+损伤性缺血组(CIP+ischemia, n=6):  CIP后72 h行全脑缺血10 min; (4)L-NAME组: 分别于CIP前1 h和后1、 12、 及36 h腹腔注射L-NAME (5 mg/kg), 每个时间点6只动物, 其它步骤同预缺血+损伤性缺血组; (5)L-NAME+L-arginine (L-Arg)组: 于CIP前1 h腹腔注射L-NAME (5 mg/kg)和L-Arg (300 mg/kg), 其它步骤同L-NAME组; (6)L-NAME+损伤性缺血组(L-NAME+ischemia): 于腹腔注射L-NAME (5 mg/kg)72 h后行全脑缺血10 min。

1.2 观察指标及方法

各组动物均在假手术后或末次缺血再灌后常温饲养7 d, 断头取材。常规脑组织切片, 硫堇染色观察海马组织学改变。

参照Kato[11]分级方法, 在光学显微镜下对海马CA1区组织学改变进行分级。 标准如下: 0级, 无神经元死亡; 1级, 散在神经元死亡; 2级, 成片神经元死亡; 3级, 几乎全部的神经元死亡。取双侧平均等级作为统计值。高倍镜下计数海马CA1区每1 mm区段内细胞膜完整、 胞核饱满、 核仁清晰的锥体细胞数目, 每张切片双侧海马各计数7个区段, 取平均数为神经元密度(neuronal density, ND)。

1.3 数据处理及统计学检验

组织学分级采用多样本等级资料的秩和检验; 神经元密度以means±SD表示, 并采用ANOVA及Scheffe法进行统计学分析(Stata软件4.0)。

 

2  结果

4VO过程中, 随着血管闭塞时间延长, 观察到翻正反射消失, 瞳孔散大、 固定, 脑电波频率变慢, 波幅逐渐变小甚至成等电位线, 说明已产生全脑缺血。再灌注后, 脑电异常仍持续一定时间, 约2-4 h基本恢复正常。之后， 除两只动物死亡予以剔除外, 其余均未发现明显的神经功能异常。将各只动物不同脑区组织切片进行比较, 结果发现组内及组间差别均不大。

海马组织学切片显示, 假手术组海马CA1区锥体细胞排列整齐、 形态完整、 胞核饱满、 核仁清晰、 尼氏体丰富, 偶见胞核固缩、 核膜凹陷、 核质浓染、 核仁模糊不清、 胞体及胞核形态不规则的神经元(图1-a1, a2)。组织学分级为0-1级(表1), ND值为195±10.72(表2)。在损伤性缺血组, 可见两种典型形态学表现: 一种表现为海马CA1区锥体细胞稀疏, 排列紊乱, 残存的锥体细胞周围可见大量细胞碎片, 其中伴有胶质细胞浸润; 另一种表现为海马CA1区锥体细胞数量无明显减少, 但细胞形态发生明显改变, 可见胞体缩小, 形态不规则, 呈多角型或梭型, 胞膜皱缩, 胞核固缩、 浓染, 核膜凹陷, 核仁模糊不清或消失, 突起明显深染变长(图1-b1, b2)。组织学分级为2-3级(表1), ND值为58±15.54(表2), 与假手术组相比有显著性差异(P<0.01)。预缺血+损伤性缺血组的组织学特征与假手术组相似, (图1-c1, c2), 组织学分级多为0-1级(表1), ND值为187±12.47(表2), 表明CIP可保护脑细胞, 使其对缺血性损害的耐受增强。在L-NAME组中发现, 应用L-NAME后, 除CIP后36 h给药组, 其余时间点给药组大鼠海马均出现显著损伤性变化, 表现为海马CA1区锥体细胞缺失明显, 细胞稀疏, 排列紊乱, 伴有胶质细胞浸润, 锥体细胞体积缩小, 形态不规则, 呈多角型或梭型, 胞膜皱缩, 胞核固缩、 浓染, 核膜凹陷, 核仁模糊不清或消失, 突起明显深染变长(图1-d1, d2)。与预缺血+损伤性缺血和假手术组相比, 组织学分级显著升高(表1, P<0.05), ND值显著下降(表2, P<0.01)。CIP后36 h腹腔注射L-NAME组动物海马CA1区组织损伤程度比其它时间点给药组及损伤性缺血组明显减轻, 仅仅表现为在正常锥体细胞之间散在分布着胞核固缩浓染、 突起清晰变长且浓染的细胞, 细胞碎片及胶质细胞浸润少见(图1-e1, e2), 组织学分级多为1-2级(表1), ND值为100±8.77(表2), 与其它时间点给药组有显著差异(P<0.01), 提示CIP再灌注后期腹腔注射L-NAME只能

 

表1. 腹腔注射L-NAME后海马CA1区组织学分级的改变

Table 1. Changes in histological grades in the hippocampal CA1 subfield after intraperitoneal administration of

L-NAME

			Grade
Group		n	0-	Ⅰ-	Ⅱ-	Ⅲ
Sham		6	6	0	0	0
Ischemia		6	0	0	4	2*
CIP+ischemia		6	4	2	0	0*
L-NAME
1 h  pre-CIP		6	0	0	4	2*
1 h  post-CIP		6	0	0	2	4*
12 h post-CIP		6	0	0	4	2*
36 h post-CIP		6	0	4	2	0*
L-NAME+Arg		6	0	5	1	0△
L-NAME+ischemia		6	0	0	4	2*

*P<0.05 vs sham and CIP+ischemia  group, △P<0.05 vs ischemia group and each subgroup in L-NAME group except  36 h post-CIP  subgroup．

图1.腹腔注射L-NAME后脑缺血预处理大鼠海马CA1区组织学的变化

Fig. 1.Histological changes in the hippocampal CA1 subfield in ischemia preconditioned rats after intraperitoneal administration of L-NAME. a1 and  a2, sham; b1 and b2, ischemia; c1 and  c2, CIP+ischemia; d1 and  d2, L-NAME 1 h pre-CIP; e1 and  e2, L-NAME 36 h pre-CIP; f 1 and  f 2, L-NAME+L-Arg (thionine staining, a2-f 2. ×400).

 

部分阻断 CIP 对神经元产生的保护作用。 L-NAME+L-Arg组的大鼠海马CA1区锥体细胞损伤较L-NAME组减轻, 仅见散在锥体细胞胞核固缩, 细胞缺失较少 (图1-f1,  f2), 组织学分级多为1级(表1),  ND值为120±14.07 (表2), 与 L-NAME组相比(除L-NAME-post-36 h组), 明显增高(P<0.01), 但比假手术组与预缺血+损伤性缺血组低(P<0.01), 表明L-Arg可在一定程度上逆转L-NAME阻断CIP的神经元保护作用。 L-NAME+损伤性缺血组的组织学改变同损伤性缺血组, 组织学分级为2-3级 (表1), ND值为67.2±11.8 (表2),  提示 L-NAME本身不直接影响脑缺血对神经元的损伤作用。

 

表2. 腹腔注射L-NAME后海马CA1区锥体神经元密度的变化

Table 2. Changes in neuronal density of the hippocampal CA1 subfield after intraperitoneal administration of L-NAME (means±SD)

Group	n	Neuronal density
Sham	6	195±10.73
Ischemia	6	58±15.54*
CIP+ischemia	6	187±12.49
L-NAME
1 h   pre-CIP	6	70±11.13*
1 h  post-CIP	6	58±13.15*
12 h  post-CIP	6	68±12.34*
36 h post-CIP	6	100±8.77*△
L-NAME+Arg	6	120±14.07*△
L-NAME+ischemia	6	67.2±11.80*

*P<0.01 vs sham and  CIP+ischemia group, △P<0.01 vs ischemia group and each subgroup in L-NAME group except 36 h post-CIP  subgroup.

 

3讨论

离体研究表明, NO在神经元缺血缺氧预处理保护机制中发挥重要作用。如观察缺氧预处理的离体大鼠海马脑片的电活动, 发现第二次缺氧复氧后诱发电位波幅得到明显恢复, NOS阻断剂7-NI抑制脑片神经细胞电活动的恢复[6], 提示cNOS产生的NO参与了缺氧预处理对神经元的保护作用。近来, 有人应用体外神经细胞培养氧-葡萄糖剥夺(OGD)耐受模型, 系统地研究了NO在神经元OGD耐受诱导中的作用, 发现给与NOS抑制剂阻断了OGD耐受的诱导, NO供体可替代OGD诱导耐受, 表明NO的产生既是神经元OGD耐受形成的必要条件, 又是充分条件[7]。这些研究结果为研究整体状态下NO在BIT诱导中的作用提供了线索。

    关于整体状态下NO是否参与BIT的诱导, 目前尚无明确的报道。在大鼠脑局灶型缺血耐受模型中发现,  预先给大鼠小剂量LPS腹腔注射, 可以减小后续较严重脑缺血再灌注24 h的脑梗塞面积, L-NAME能阻断LPS预处理对脑的保护作用, 但不能阻断CIP所产生的脑保护作用[13]。这一结果不支持NO参与整体状态下BIT诱导的观点。但据此而否定NO在脑缺血耐受中的作用, 理由尚不够充分。因其对损伤性缺血再灌注后脑梗塞面积观察时间较短(24 h), L-NAME是否能阻断CIP对延迟性神经元死亡的抑制作用尚不能确定。延迟性神经元死亡(主要是凋亡)的高峰期在缺血后2-3 d。因此, 我们认为, 仅凭24 h的观察结果就否认NO在整体缺血耐受诱导中的作用证据不足。有学者对在全脑单纯CIP、 6 min缺血和BIT模型上大鼠海马CA1区锥体细胞NADPH-黄递酶活性的表达情况进行了比较, 发现在三种情况下NADPH-黄递酶表达的变化基本一致, 即在未损伤的与损伤的大鼠海马CA1区锥体细胞中均可见NADPH-黄递酶活性表达增高, 并且增高的时相也一致。说明NO的存在不一定与损伤相关联, 而有可能与BIT的诱导有关[12]。在新生鼠缺氧预处理模型中, 应用非特异性NOS抑制剂L-NNA完全阻断了缺氧预处理对神经元的保护作用, 而对nNOS及iNOS特异的阻断剂7-NI和氨基胍则无效。提示由eNOS产生的NO介导了保护作用[8]。

    我们应用大鼠全脑缺血耐受模型及NOS的阻断剂L-NAME, 在整体水平上观察NO是否参与BIT的诱导过程。结果表明, 3 min的CIP可以诱导大鼠海马CA1区神经元对后续10 min缺血性损伤产生耐受性; 于CIP前后一定时间内给大鼠腹腔注射L-NAME, 可阻断这种保护作用; 而腹腔注射L-Arg则可部分逆转L-NAME的作用; L-NAME本身不直接影响脑缺血对神经元的损伤作用, 其作用是通过阻断CIP对BIT的诱导实现的。这些结果表明NO参与了整体情况下BIT的诱导过程。

L-NAME作用的时效关系为判断NO参与BIT诱导的时相提供了依据。在CIP前1 h和后1、 12 h给与L-NAME, 均可阻断BIT的诱导。结合药物代谢半衰期, 提示NO在BIT诱导的早期阶段就开始发挥作用。预处理后36 h给药只表现部分阻断效应, 推测在L-NAME起作用之前CIP已经使NOS活性升高, NO生成增多, 增多的NO已经激活了一系列级联反应通路, 而L-NAME对这些级联反应通路并无影响。本研究还发现, L-Arg只部分逆转了L-NAME的作用, 这可能是因为L-NAME对不同类型的NOS作用不同所致。iNOS可被非特异性NOS阻断剂可逆性抑制, 而此种阻断剂对nNOS的抑制作用则相对不可逆[15]。据此分析, 本实验中应用的L-Arg可能只逆转了L-NAME对iNOS或／和eNOS的作用, 而未能逆转L-NAME对nNOS的作用, 从而导致L-Arg只能部分逆转L-NAME对BIT诱导的阻断作用。同时, 这一结果也提示, 在BIT诱导过程中, iNOS或／和eNOS及nNOS可能均发挥作用。

    我们的实验在整体水平证实, NO参与大鼠海马CA1区锥体细胞BIT的诱导过程, 为阐明与完善BIT的诱导机制提供了有力的实验依据。应用交叉诱导的方法, 以NO供体代替CIP提供脑保护, 可能会为脑缺血性疾病提供新的治疗思路。参考文献

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