生理学报Acta Physiologica Sinica, June 25, 2003, 55(3): 251－254
研究论文
β2-肾上腺素受体在新生大鼠心肌成纤维细胞中的分布及其促增殖作用
尹峰, 吕志珍, 韩启德, 张幼怡*
北京大学第三医院血管医学研究所, 分子心血管学教育部重点实验室, 北京 100083
摘要: 为了明确β-肾上腺素受体(AR) 亚型在新生大鼠心肌成纤维细胞中的分布及其在成纤维细胞增殖反应中的作用, 采用放射配体结合实验和[3H]-thymidine掺入法检测了新生大鼠心肌成纤维细胞的β-AR密度和DNA合成速率。结果显示, 在培养心肌细胞和心肌成纤维细胞中β-AR密度(Bmax)和解离常数(KD)无显著性差异; 竞争抑制曲线分析结果提示, 心肌成纤维细胞对CGP 20712A和ICI 118551单位点拟合均显著优于两位点拟合(P<0.01), 表现为对选择性β1-AR拮抗剂CGP 20712A的低亲和性(IC50值: 10.1 μmol/L)和对选择性β2-AR拮抗剂ICI 118551的高亲和性(IC50值: 0.147 μmol/L)。异丙肾上腺素(ISO)促心肌成纤维细胞增殖作用可被ICI 118551和心得安(非选择性β-AR拮抗剂)完全抑制, 而CGP 20712A则无此作用。上述结果提示, 在培养心肌成纤维细胞中β2-AR亚型占绝对优势, 并且ISO引起的心肌成纤维细胞增殖反应是由β2-AR介导的。
关键词: β-肾上腺素受体; 放射配体结合实验; 心肌成纤维细胞; 增殖
中图分类号: Q463
Expression of β2-adrenergic receptor and its effect on the proliferation of neonatal rat
cardiac fibroblasts
YIN Feng, LU Zhi-Zhen, HAN Qi-De, ZHANG You-Yi*
Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital , The Reference Laboratory of Ministry of Education for Molecular Cardiovasology, Beijing 100083
Abstract: The expression of β-adrenergic receptor subtypes and its effect on neonatal rat cardiac fibroblast proliferation were investigated by radioligand binding assay and [3H]-thymidine incorporation analysis, respectively. The results indicated that there was no significant difference in the β-adrenergic receptor density (Bmax) and affinity (KD) between cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. The [125I]-pindolol competitive inhibition curves (ICI 118551 and CGP 20712A) were significantly better fit in a one-site model in membrane preparation of cardiac fibroblasts. In cultured cardiac fibroblasts, 0.1 μmol/L isoproterenol-induced [3H]-thymidine incorporation was completely inhibited by a selective β2-AR antagonist ICI 118551, or a non-selective β-AR antagonist propranolol, but not by CGP 20712A, a selective β1-AR antagonist. These results suggest that isoproterenol-induced cardiac fibroblast proliferation is mediated by β2-AR, the preponderant β-AR subtype in cardiac fibroblasts.
Key words: β-adrenergic receptor; radioligand binding assay; cardiac fibroblasts; proliferation
心肌组织存在β-肾上腺素受体(adrenergic
receptor, AR)的两种主要亚型, 即β1-AR和β2-AR, 对在正常和多种病理状态时两种亚型受体在心肌组织中的分布及功能效应已有文献报道[1]。一般认为, β1-AR和β2-AR共同表达于心肌细胞(myocyte, MC)膜表面并介导心肌收缩功能[2]。然而对在心肌成纤维细胞(fibroblast,
FB)中β-AR的亚型分布及其功能至今尚未取得统一认识。
心肌间质FB过度增殖可导致心肌纤维化, 心肌间质重塑, 致使心肌舒缩功能异常[3]。有文献报道, β-AR在介导心肌FB增殖反应中发挥重要作用[4], 但尚不清楚哪种受体亚型参与该过程。为此, 本工作采用放射配体结合实验观察了β-AR及其亚型在新生大鼠心肌FB中的分布, 并对各亚型受体在介导心肌FB增殖反应中的作用进行了分析。
1 材料和方法
1.1 新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞培养
取1－3日龄新生Wistar大鼠(北京大学医学部实验动物中心提供), 无菌开胸取心室, 用Hank's液冲洗、 剪碎, 0.1%胰蛋白酶消化(37℃, 8 min), 分别收集各次消化液并加入等量含10%小牛血清的DMEM培养基, 离心(1000 r/min, 5 min), 弃上清, 重复离心一次, 取沉淀制成细胞悬液, 置于37℃, 5% CO2培养箱2 h, 分离悬浮的MC与贴壁的FB, 分别培养, 实验选用原代MC和第二代心肌FB。经细胞形态及免疫组织化学鉴定, 培养的MC和FB纯度均超过90%。
1.2 [125I] pindolol放射配体结合实验
用氯胺T法标记非亚型选择性β-AR拮抗剂pindolol, 其 125I标记物简称IPIN。按本研究所曾经报道过的方法[5]制备细胞粗制膜标本, 并获得IPIN结合的饱和曲线及CGP 20712A和ICI 118551对IPIN的竞争抑制曲线。前者作Scatchard分析, 求出受体与IPIN结合的密度(Bmax)和解离常数(KD); 对竞争抑制曲线进行两位点与单位点计算机拟合, 采用F检验决定两位点拟合是否显著优于单位点拟合, 并根据Hill作图, 求出IC50值。
1.3 DNA合成速率的测定
取心肌FB悬液种植于24孔培养板, 待细胞生长至90%汇聚后换用无血清培养基培养24 h, 加入异丙肾上腺素(0.1 μmol/L) 18 h后再加入[3H]-thymidine (37 MBq/ml/well), 继续孵育6 h, PBS液冲洗3遍, 每孔加入0.2 ml裂解液(0.1 mol/L NaOH, 0.1% SDS) 30 min, 然后加入0.5 ml 10%TCA收集蛋白质, 用多头微量细胞收集器收集于玻璃纤维滤膜, 滤膜烘干后置于闪烁液中, 测定dpm值反映细胞DNA合成速率。
1.4 材料和试剂
异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO)、 心得安(propranolol, PROP)、 心得静(pindolol)和CGP20712A均购自Sigma公司, ICI 118551购自Research Biochemical Inc, USA; [3H]-thymidine和Na 125I购自中国科学院原子能研究所。
1.5 数据统计
各组实验结果均用mean±SD表示, 两组间或多组间数据分别采用组间t检验或One way ANOVA进行统计学分析。
2 结果
2.1 新生大鼠MC和心肌FB中β-AR密度和解离常数
新生大鼠MC的β-AR的Bmax为156.7±34.8 fmol/mg蛋白, 心肌FB的Bmax 值为139.3±13.9 fmol/mg蛋白, 两组相比无显著性差异(P=0.28, n=6)。KD值在两组间亦无显著差异(MC: 93.1±29.5 pmol/L, FB: 107.9±13.1 pmol/L, P=0.29, n=6) (图1)。
图1.MC和心肌FB β-AR与125I-pindolol特异性结合饱和曲线和Scatchard分析
Fig. 1.Scatchard analysis of 125I-pindolol specific binding with β-AR in membrane preparations from myocyte and cardiac fibroblasts. FB, fibroblast; MC, myocyte.
2.2 新生大鼠心肌FB β-AR亚型竞争抑制曲线
CGP 20712A和ICI 118551对IPIN与受体的结合成浓度依赖性竞争抑制, 抑制曲线经计算机分析均显示单位点拟合显著优于两位点拟合(P<0.01)。两组曲线IC50值分别为: 0.147 μmol/L(ICI 118551)和10.1 μmol/L(CGP 20712A) (图2)。
图2.选择性β-AR亚型拮抗剂对心肌FB 125I-pindolol 特异结合的竞争抑制曲线
Fig. 2.Competitive inhibition of 125I-pindolol specific binding by selective β-AR subtype antagonists (CGP 20712A and ICI 118551) in membrane preparations from cardiac fibroblasts. Data are expressed as mean±SD from four separate experiments.
2.3
β2-AR在ISO促心肌FB增殖反应中的作用
培养的心肌FB在0.1 μmol/L ISO刺激24 h后可见[3H]-thymidine掺入量较对照增加约2倍(6620.5±689.2 dpm vs 3768.3±1176.4 dpm, P<0.05, n=8)。该作用可被选择性β2-AR拮抗剂ICI 118551 (0.1 μmol/L)和非选择性β-AR拮抗剂心得安(0.1 μmol/L)阻断(ICI: 3657±246.1 dpm; 心得安: 2813.5±170.3 dpm, n=6), 选择性β1-AR拮抗剂CGP 20712A(0.1 μmol/L)则无此作用(CGP: 6281.8±1628.4 dpm, n=8)(图3)。
图3.选择性β-AR亚型拮抗剂对isoproterenol促FB增殖效应的影响
Fig. 3.Effect of selective β-AR subtype antagonists on isoproterenol (ISO) induced cardiac fibroblast proliferation. *P<0.05, compared with control. n=8. CGP, CGP 20712A; ICI, ICI 118551; PROP, propranolol
3讨论
交感-儿茶酚胺系统通过肾上腺素受体在心脏和血管生理活动的调节中发挥着重要作用。早在60年代后期就已确定β-AR包含β1和β2-AR亚型, 近年来发现在心脏中尽管以β1-AR为主, 同时亦存在β2-AR的分布, 后者同样能介导cAMP生成和正性变力效应。在培养心肌细胞中, β1-AR和β2-AR共同表达于细胞膜表面, 然而各亚型与G蛋白的偶联存在不同特点。β1-AR仅与激动性G蛋白(Gs)偶联, 而β2-AR则可同时与Gs和抑制性G蛋白(Gi)偶联,
Gi通路对Gs信号向细胞内的扩散发挥屏蔽作用[6]。在慢性心力衰竭患者中观察到心肌β1-AR密度明显减少, 其介导的正性变力效应亦明显降低, 而心肌β2-AR的密度并无明显变化[7]。因此, β2-AR在心脏的分布, 功能和调节具有重要的生理和病理意义。
心脏主要由心肌细胞、 心肌成纤维细胞、 血管平滑肌细胞以及内皮细胞等多种细胞成分组成。其中心肌FB过度分裂可导致心肌纤维化, 引起心肌僵硬度增加、 舒缩功能受限, 是引发心力衰竭的关键病理过程。已有研究提示, 慢性激活β-AR在整体小鼠可引起心肌肥厚、 心肌坏死和心肌纤维化[8]。在培养心肌FB亦观察到ISO和血清对细胞增殖反应的协同效应[4], 然而由哪一种β-AR亚型介导此反应却尚未见报道。本工作的放射配体结合实验结果表明， 在培养的MC和心肌FB中β-AR的KD和Bmax无明显差异, 说明两种细胞中的总β-AR密度相近,然而竞争抑制曲线分析结果提示心肌成纤维细胞对CGP 20712A和ICI 118551单位点拟合均显著优于两位点拟合, 表现为对选择性β1-AR拮抗剂CGP 20712A低亲和性(IC50值: 10.1 μmol/L)和选择性β2-AR拮抗剂ICI 118551高亲和性(IC50值: 0.147 μmol/L),说明在心肌FB中是以β2-AR为主。为进一步从功能上证实心肌FB中β2-AR的地位, 判断β2-AR在心肌FB增殖反应中的作用, 本研究采用多种受体工具药观察对心肌FB的[3H]-thymidine掺入量的影响, 以明确是何种亚型介导心肌FB增殖效应。结果显示, 0.1 μmol/L ISO可显著促进心肌FB增殖, 该作用可被选择性β2-AR拮抗剂ICI 118551和非选择性β-AR拮抗剂心得安完全抑制, 而选择性β1-AR拮抗剂CGP20712A则无此作用, 说明ISO对心肌FB的促增殖作用是由β2-AR介导的。
结合其他实验室的研究, 可以认为β2-AR在心脏发挥着多样的生物学效应, 它和β1-AR一样能介导cAMP生成和心肌正性变力效应, 同时又介导了心肌FB增殖反应, 并可能与心肌局部分泌功能密切相关[9,10]。因此, 在心力衰竭等严重疾病的治疗中采用非亚型选择性β-AR拮抗剂, 可能更有助于改善心肌重塑和恢复心功能。
参考文献
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