生理学报Acta Physiologica Sinica, June 25, 2003, 55(3): 273-277
研究论文
铁对血管收缩活动的影响及其机制
况炜1,2, 陈莹莹1, 沈岳良1, 夏强1,*
1浙江大学医学院生理学教研室, 杭州 310031; 2宁波卫生高等职业技术学院, 宁波 315000
摘要: 动脉粥样硬化的发生和铁引起的氧化应激密切相关。铁对血管的直接效应及其对血管收缩功能的影响尚不明确。本文采用血管环灌流装置, 观察铁对离体SD大鼠去内皮胸主动脉环的直接效应, 及对去内皮主动脉环KCl和苯肾上腺素(PE)引发的收缩效应的影响。结果显示: (1)100 μmol/L 枸橼酸铁(FAC)引起大鼠血管环发生相位性收缩, 最大收缩幅度可达KCl诱发的最大收缩的24.02±2.37%。当[Ca2+]o增加1倍时, 铁所致的血管环收缩幅度明显增加(P<0.01)。阻断L-型钙通道后, 铁所致的血管环收缩幅度明显降低(P<0.01)。在无钙液中, 用佛波酯收缩血管环, 待收缩稳定后给予FAC, 此时收缩幅度增加49.18±3.75%。(2) 铁孵育30 min后, KCl引起血管环收缩的幅度显著降低(P<0.01)。铁孵育可使PE引起的收缩量-效曲线右移(P<0.05)。(3)二甲基亚砜、过氧化氢酶和谷胱甘肽可明显降低铁对PE血管收缩反应的抑制作用(P<0.05)。从这些结果可得到以下结论: 铁可引起胸主动脉发生相位性收缩, 其机制可能与L-型钙通道短暂开放导致钙离子内流, 及平滑肌对钙的敏感性增加有关; 较长时间与铁孵育后, 可对血管收缩功能产生损伤, 氧自由基的生成增加和细胞内GSH的水平降低可能参与铁对收缩功能的损害。
关键词: 铁; 胸主动脉; 收缩; L-型钙通道; 活性氧
中图分类号: Q463
Effect of iron on
vasoconstriction in the isolated rat aorta
KUANG Wei1, 2, CHEN Ying-Ying1, SHEN Yue-Liang1, XIA Qiang1，
1Department
of Physiology,
Abstract: The present study was to examine the effect of iron on isolated rat aortic rings, and to elucidate the underlying mechanism. The thoracic aortic rings without endothelium of male Sprague-Dawley rats were mounted on a bath system. Isometric contractions of aortic rings were measured. The results obtained are as follows. (1) Ferric ammonium citrate (FAC) (100 μmol/L) caused a phasic response with an initial transient contraction followed by a relaxation in thoracic aortic ring. The maximal contractile amplitude was 24.02±2.37% of the maximal contraction induced by KCl, the duration of phasic contraction lasted for about 20 min. (2) In high Ca2+ Krebs-Henseleit (K-H) solution (twice of the normal concentration), the contractile amplitude induced by FAC was enhanced. After the aortic rings were incubated with nifedipine for 15 min to block the L-type Ca2+ channel, the iron-induced contraction was attenuated. (3) In Ca2+-free K-H solution, addition of FAC caused a strong and sustained contraction in the presence of PDBu. (4) Pretreatment of FAC for 30 min decreased the KCl-induced contraction and also caused a significant reduction in the contractile response to phenylephrine (PE). Pretreatment of the arteries with DMSO, catalase or glutathione before FAC exposure prevented the decrease in contraction responses to PE (P<0.05). It is therefore concluded that iron causes phasic contraction of vascular smooth muscle, in which both extracellular Ca2+ entry through L-type Ca2+ channel and increase in Ca2+ sensitivity of smooth muscle cells are involved. Exposure to iron causes inhibitory effects on KCl- or PE-induced contractions in isolated thoracic arteries. Reactive oxygen species and glutathione may be involved in iron-induced contraction dysfunction.
Key words: iron; thoracic aorta; vasoconstriction; L-type Ca2+ channel; reactive oxygen species
目前已证明, 低密度脂蛋白(low-density
lipoprotein, LDL)和脂质过氧化是导致脉管系统粥样斑块形成的关键。1981年, Sullivan提出“铁假说”机制, 即铁催化LDL氧化, 引发巨噬细胞将脂质大量内吞, 产生泡沫细胞, 在血管内皮下聚集并形成斑块, 引起血管损伤[1]。组织学研究也提供了相关例证[2,
3]。此外, 铁作为一种过渡型金属离子在活性氧所致的损伤中发挥着重要作用。而血管是活性氧主要的靶组织之一, 多种氧代谢产物(H2O2、·O-2、 HOCl、·OH)均被报道可增加体循环和肺循环血管的阻力[4－6]。另一方面,
在心脏上的研究发现, 急性铁过负荷可致心肌收缩功能受损, 其原因可能与心肌肌膜和溶酶体膜损伤, 以及含巯基的蛋白质对铁敏感有关[7,8], 本实验室亦曾观察到铁对心肌细胞具有损伤作用[9]。然而,
铁对血管收缩功能的急性作用目前仍不明了, 故本研究将观察铁对大鼠胸主动脉收缩功能的急性作用, 并探讨细胞膜钙离子通道和细胞内钙池在铁对血管收缩功能损伤中的作用,
明确活性氧等因素参与了铁的血管效应, 从而加深对铁过负荷所致血管的病理生理改变及其发展过程的全面认识。况炜等: 铁对血管收缩活动的影响及其机制生理学报Acta
Physiol. Sin.,
1 材料和方法
1．1 动物和材料
雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠由浙江大学医学院实验动物中心提供。枸橼酸铁(Ferric ammonium citrate, FAC)、 苯肾上腺素(Phenylephrine, PE)、 ACh、 佛波酯(Phorbol 12,13-dibutyrate, PDBu)、 硝苯吡啶(Nifedipine, Nif)、 二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)均为Sigma产品。过氧化氢酶(Catalase, CAT)购自Worthington公司。还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione, GSH)为上海酵母厂产品。MedLab生物信号采集处理系统由南京美易科技公司生产。
1．2 主动脉环的制备
取220－270 g雄性SD大鼠, 用木锤击晕后行颈部脱臼, 剪开胸腔, 迅速取出胸主动脉条上段, 置于4℃的Krebs-Henseleit (K-H)液中。小心剔除其周围结缔组织后, 将血管剪成3 mm长的主动脉环, 用机械法去除血管内皮, 迅速悬挂至离体灌流装置中。主动脉环稳定于37℃的K-H液中, K-H液成分(mmol/L): NaCl 120、 NaHCO3 25、 KH2PO4 1.2、 MgSO4 1.2、 KCl 4.5、 CaCl2 1.25和葡萄糖 11.1, pH 7.4。溶液以95% O2+5% CO2饱和。在20－30 min内逐步调节主动脉环张力， 从0 g至2 g, 主动脉环在此张力作用下于K-H液中继续稳定60 min; 其间每隔15 min更换1次K-H液。稳定后, 用60 mmol/L浓度的KCl刺激, 待稳定后洗脱, 重复3次, 以激发最大收缩。1 μmol/L PE预收缩后, 用10 μmol/L ACh舒张主动脉环以检查血管内皮的完整性, 已完全去内皮的血管, 不产生舒张或舒张幅度小于10%。FAC或PE引起的收缩幅度均以第三次KCl引起的最大收缩幅度为相对标准值, 用百分比值来表示[10]。
1．3 实验分组
观察铁的直接血管效应。(1)铁剂组(n=6): 主动脉环稳定后直接给予FAC (100 μmol/L), 记录加铁前后主动脉环张力的变化。(2)高钙+铁组(n=7): 主动脉环在高钙K-H液(含CaCl2 2.5 mmol/L)中孵育15 min后, 给予FAC。(3)Nif+铁组(n=6): 用Nif (10 μmol/L)孵育15 min后, 给予FAC。(4)高钙+Nif+铁组(n=7): 主动脉环在含Nif的高钙K-H液中孵育15 min后, 给予FAC。(5)PDBu+铁组(n=4): 主动脉环以无钙液(K-H液中未加CaCl2, 含1 mmol/L EGTA)冲洗3次并浴于无钙液中, 以1 μmol/L PDBu刺激主动脉环收缩, 当收缩稳定后给以FAC。
观察铁对血管收缩功能的影响。(1)单纯KCl组(n=8): 主动脉环稳定后, 加入60 mmol/L KCl收缩血管环。(2)铁+KCl组(n=7): 主动脉环用FAC (100 μmol/L)孵育30 min, 给予60 mmol/L KCl。(3)单纯PE组(n=8): 主动脉环累加PE (浓度分别为0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 μmol/L), 观察血管收缩的量-效曲线。(4)铁+PE组(n=8): 主动脉环用FAC孵育30 min后, 累加PE。(5)DMSO+铁组(n=8): 主动脉环用FAC孵育前, 先用DMSO (6 mmol/L)孵育30 min, 再累加PE。(6)CAT+铁组(n=8): 主动脉环用FAC孵育前, 先用CAT (1000 U/ml)孵育30 min, 再累加PE。(7)GSH+铁组(n=8): 主动脉环用FAC孵育前, 先用GSH (0.5 mmol/L)孵育30 min, 累加PE。
1．4 统计学处理
各组资料以mean±SD表示, 采用one-way ANOVA以及Newman-Keuls post hoc test做统计学分析。P<0.05认为有显著差异。
2 结果
2．1 铁引起血管的相位性收缩效应
100 μmol/L FAC可引起大鼠主动脉环发生相位性收缩。首先出现快速收缩期, 最大收缩幅度可达KCl诱发的最大收缩的24.02±2.37%, 与未加FAC前相比有显著性差异(P<0.01); 随后数分钟收缩幅度维持于平台期, 之后血管舒张并回到静息水平, 整个过程约20 min, 持续至10 min时与未加FAC前相比仍有显著差异(P<0.01)(图1)。
图1. 铁引起的血管相位性收缩曲线
Fig. 1. Phasic contraction induced by FAC in rat aortic ring
图2.细胞外钙对铁的相位性收缩效应的影响
Fig. 2.Role of extracellular calcium in the FAC-induced phasic contraction in rat aortic rings. **P<0.01 compared with FAC group; ##P<0.01 compared with high Ca2++FAC group; $P<0.05 compared with Nif+FAC group. 2．2 细胞外钙、钙离子通道阻断剂对铁的血管效应的影响
细胞外Ca2+浓度为生理水平时(1.25 mmol/L), 100 μmol/L FAC引起的相位性收缩持续时间约20 min; 当细胞外液Ca2+的浓度增加至2.5 mmol/L时, 血管环的基础张力未发生明显改变, 但100 μmol/L FAC所致的血管环收缩幅度则明显增加(图2, P<0.01), 持续时间亦明显延长(>60 min)。主动脉环与Nif孵育15 min后再给予铁刺激, 与未加Nif组相比, 铁所致的收缩幅度均明显降低(图2, 均P<0.01), 且高钙液中铁引起的相位性收缩幅度明显高于正常钙组。
图3.铁对PDBu收缩血管作用的影响
Fig. 3.Effect of FAC on PDBu-induced contraction in rat aortic ring.
图4.铁对PE所致血管收缩的影响
Fig. 4.Effect of FAC on phenylephrine (PE)-induced contraction of rat aortic rings. *P<0.05, **P<0.01 compared with control group． 2．4 铁对KCl和PE诱发的血管收缩效应的影响
铁使KCl所致的血管环收缩幅度显著降低。即未用铁孵育组KCl引起血管环收缩为93.57±3.95%; 而铁孵育30 min后, KCl引起血管环收缩幅度降低为82.25±2.12%, 两者有显著差异(P<0.01)。而铁孵育30 min后, 使PE引起的收缩量-效曲线右移, 除0.01 μmol/L外各个浓度PE所致的收缩幅度均明显降低(图4, P<0.05)。
2．5 DMSO、CAT和GSH在铁对PE诱发的血管收缩效应中的作用
DMSO、CAT分别作为羟自由基和过氧化氢的清除剂, 可使铁作用下的PE收缩曲线左移, 最大收缩幅度显著升高, 除高浓度PE(30、100 μmol/L)外, 其余浓度所致的收缩幅度均较单纯铁孵育组有显著升高(表1, P<0.05)。GSH亦可明显降低铁对PE血管收缩反应的抑制作用, 使PE所致的收缩曲线左移, 收缩幅度增高(表1, P<0.05)。
表1. DMSO、 CAT和GSH在铁对PE诱发的血管收缩效应中的作用
Table 1. Roles of DMSO, catalase and GSH in effect of iron on PE-induced contraction in aortic rings
|
PE(μmol/L) |
Contractile amplitude (% of KCl-induced contraction) |
||||
|
Control |
FAC |
DMSO+FAC |
CAT+FAC |
GSH+FAC |
|
|
0.01 |
2.89±0.63 |
2.68±1.36 |
9.66±5.69## |
20.24±6.94## |
5.05±2.19# |
|
0.03 |
33.10±6.65 |
22.82±10.70* |
36.36±13.09#* |
37.08±10.93# |
35.52±8.66# |
|
0.1 |
64.81±12.3 |
51.01±6.41* |
64.70±10.37## |
61.62±6.94## |
65.30±14.32# |
|
0.3 |
83.52±11.75 |
69.22±12.36* |
88.01±7.33## |
80.91±11.27# |
87.72±5.94## |
|
1 |
102.21±15.42 |
88.85±8.3* |
101.11±5.53## |
102.71±16.46## |
104.55±16.84# |
|
3 |
112.35±13.87 |
92.28±7.92** |
106.21±6.87## |
106.04±14.95# |
110.73±13.87## |
|
10 |
117.08±17.33 |
90.73±8.18** |
95.59±7.58 |
102.21±13.71## |
114.90±11.78## |
|
30 |
112.71±19.37 |
90.64±7.11** |
90.57±6.39 |
96.79±15.34 |
109.27±11.77## |
|
100 |
111.13±19.07 |
88.21±9.43** |
87.20±6.58 |
88.52±18.03 |
105.16±9.79## |
*P<0.05, **P<0.01, compared with group control; #P<0.05, ##P<0.01 compared with group FAC.
3 讨论
铁催化LDL的氧化是动脉粥样硬化形成的主要原因[1]。铁在活性氧所致的损伤中亦发挥着重要的作用。
文献报道, 活性氧可使处于静息状态下的离体大鼠主动脉[11]、兔主动脉[12]产生收缩, 并可使血管对血管活性物质的反应性明显下降[13], 而铁通过参与Fenton反应可能使活性氧的损伤作用变得更强;
此外, 有文献报道, 富含巯基的蛋白质对铁非常敏感, 往往造成细胞内与收缩有关的酶失活, 在心肌细胞造成电生理及收缩功能异常[7]。本实验中, 我们观察到铁可引起血管的相位性收缩,
而铁孵育后, 可使血管对缩血管物质如高钾、α-受体激动剂的反应性明显降低。
目前一致认为, 引起血管平滑肌收缩的机制主要通过细胞外Ca2+内流和细胞内Ca2+贮库的释放,
从而增加[Ca2+]i而诱发的[14]。本实验结果提示, 铁所引起的细胞膜上L-型钙通道开放, 导致钙离子内流是铁引起血管收缩的主要原因。加入L-型钙通道阻滞剂后,
铁仍可引起血管发生微弱的收缩, 说明铁收缩血管的作用还存在其他机制。Stoyanovsky等人在实验中发现抗坏血酸/铁可引起心肌肌质网钙通道开放, 但维持时间较短[15]。许多研究还发现,
大多数缩血管物质和其相应的受体结合后, 可增加细胞膜磷脂降解, 通过其产物甘油二酯, 激活PKC[16]。业已证实, 氧化型LDL通过增加钙非依赖性PKC-ε的活性, 诱发冠脉收缩[17]。在无钙条件下, 用PDBu持续激活PKC, 仍能产生血管张力并维持血管平滑肌的收缩[18], 但不明显改变[Ca2+]i的浓度[19,
20]。这些研究提示, 缩血管物质可通过PKC, 增加肌丝对Ca2+的敏感性或其它钙非依赖性的途径调节血管平滑肌的收缩反应。本实验中, 我们在无钙液中用PKC的激活剂PDBu对血管环进行预处理后再加入铁,
发现铁使血管在PDBu所致收缩的基础上进一步收缩, 且铁的缩血管作用在前期的高峰后尚持续较长时间, 提示铁可能可增强PKC的活性, 从而使平滑肌对钙的敏感性亦大大提高。
在本实验中, 我们观察到铁可使源于激活电压依赖性钙通道及其后的肌质网释放钙的KCl所致的收缩幅度减小,
同时血管对PE的反应性亦明显降低。为分析其机制, 我们分别用自由基清除剂、巯基保护剂来对抗铁的毒性作用, 发现DMSO、CAT可显著减弱铁的毒性作用, 提示铁对血管的损伤和自由基,
包括过氧化氢和羟自由基的损伤作用有关, 另巯基保护剂谷胱甘肽亦有同样作用, 说明铁对血管的损伤作用和含巯基的蛋白质相关。
从本实验可以得出以下结论, 铁可致大鼠动脉平滑肌收缩和收缩功能失调, 两者机制不同。在前者， 铁直接刺激可引起血管产生一持续约二十分钟的相位性收缩, 此作用主要是通过促进胞外的钙离子内流而引起的, 此外还涉及胞内肌质网中钙的释放和平滑肌对钙离子的敏感性的增加。而在后者， 较长时间的铁孵育使KCl和PE引发的血管收缩功能失调, 其机制可能与自由基的氧化损伤、含巯基的蛋白质受损有关。
参考文献
[1] Holvoet P, Collen D. Oxidation of low density lipoproteins in the pathogenesis of atherosclerosis. Atherosclerosis 1998;137(Suppl):S33－S38.
[2]Vlad M, Caseanu E, Uza G, Petrescu M. Concentration of copper, zinc, chromium, iron and nickel in the abdominal aorta of patients decreased with coronary heart disease. J Trace Elem Electrolytes Health Dis 1994;8(2):111－114.
[3]Lee FY, Lee TS, Pan CC, Huang AL, Chau LY. Colocalization of iron and ceroid in human atherosclerotic lesions. Atherosclerosis 1998;138(2):281－288.
[4]Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev 2002;82(1):47－95.
[5]Prasad K, Kalra J, Chaudhary AK, Debnath D. Effect of polymorphonuclear leukocyte-derived oxygen free radicals and hypochlorous acid on cardiac function and some biochemical parameters. Am Heart J 1990;119(3 Pt 1):538－550.
[6]Az-ma T, Fujii K, Yuge O. Self-limiting enhancement by nitric oxide of oxygen free radical-induced endothelial cell injury: evidence against the dual action of NO as hydro-xyl radical donor/scavenger. Br J Pharmacol 1996;119(3):455－462.
[7]Link G, Hershko C. Rat heart cells in culture: a model of iron toxicity and chelation. J Lab Clin Med 1993;122(1):14－15.
[8]Oubidar M, Marie C, Mossiat C, Bralet J. Effects of increasing intracellular reactive iron level on cardiac function and oxidative injury in the isolated rat heart. J Mol Cell Cardiol 1996;28(8):1769－1776.
[9]Chen YY (陈莹莹), Shen YL, Cao CM, Xu WH, Qian ZM, Xia Q. Hydrogen peroxide augments the injury effect of iron on the isolated rat heart and cardiomyocytes. Acta Physiol Sin (生理学报) 2001; 53(3):175－182 (Chinese, English abstract).
[10]Ba ZF, Wang P, Kuebler JF, Rue LW 3rd, Bland KI, Chaudry IH. Flutamide induces relaxation in large and small blood vessels. Arch Surg 2002;137(10):1180－1186.
[11]Shen JZ, Zheng XF, Kwan CY. Differential contractile actions of reactive oxygen species on rat aorta: selective activation of ATP receptor by H2O2. Life Sci 2000;66(21):L291－L296.
[12]Mehta JL, Lawson DL, Yang BC, Haught WH, Hintze T. Role of superoxide radicals in anoxia reoxygenation-mediated vascular contraction. Life Sci 1991;49(23):1739－1746.
[13]Jin N, Rhoades RA. Activation of tyrosine kinases in H2O2-induced contraction in pulmonary artery. Am J Physiol 1997;272(6 Pt 2):H2686－H2692.
[14]Horowitz A, Menice CB, Laporte R, Morgan KG. Mechanisms of smooth muscle contraction. Physiol Rev 1996;76(4):967－1003.
[15]Stoyanovsky DA, Salama G, Kagan VE. Ascorbate/iron activates Ca2+-release channels of skeletal sarcoplasmic reticulum vesicles reconstituted in lipid bilayers. Arch Biochem Biophys 1994;308(1):214－221.
[16]Nishizuka Y. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science 1992;258(5082):607－614.
[17]Giardina JB, Tanner DJ, Khalil RA. Oxidized-LDL enhances coronary vasoconstriction by increasing the activity of protein kinase C isoforms alpha and epsilon. Hypertension 2001;37(2 Part 2):561－568.
[18]Khalil RA, van Breemen C. Sustained contraction of vascular smooth muscle: calcium influx or C-kinase activation? J Pharmacol Exp Ther 1988;244(2):537－542.
[19]Jiang MJ, Morgan KG. Intracellular calcium levels in phorbol ester-induced contractions of vascular muscle. Am J Physiol 1987;253(6 Pt 2):H1365－H1371.
[20]Nishimura J, Khalil RA, Drenth JP, van Breemen C. Evidence for increased myofilament Ca2+ sensitivity in norepinephrine-activated vascular smooth muscle. Am J Physiol 1990;259(1 Pt 2):H2－H8.