生理学报Acta Physiologica Sinica, June 25, 2003, 55(3):278-283
研究论文
胚胎大鼠脑和脊髓神经干细胞的分离和培养
富赛里1, 马政文1, 尹岚1, 陆佩华1，, 徐晓明1,2
1上海第二医科大学神经生物学实验室, 上海 200025; 2美国肯塔基脊髓损伤研究中心, 美国路易斯威尔大学
神经解剖实验室, 肯塔基州 40292, 美国
摘要: 研究采用显微解剖、 无血清细胞培养和免疫荧光细胞化学染色等实验技术, 成功地建立了胚胎大鼠脑和脊髓神经干细胞(NSCs)的分离和培养方法。结果显示, (1)在含成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2)和表皮生长因子(EGF)的无血清培养液中, 两种来源的NSCs经体外培养8－10代后, 其细胞数呈指数级增加, 其中脑来源的NSCs数由原代培养时的1×106增加至1×1012, 脊髓来源的NSCs数从1×106增加至1×1011。增殖的细胞表达神经上皮干细胞蛋白(nestin); (2)在含1%胎牛血清(FBS)的培养条件下, 它们都能被诱导分化为神经元、 少突胶质细胞和星型胶质细胞。但其分化比例可随细胞传代次数的增加而改变, 其中, 大脑来源的NSCs分化为神经元的比例从第二代(P2)的11.95±2.5%下降至第五代(P5)的1.97±1.16% (P<0.01), 而少突胶质细胞的分化比例则基本保持不变, 这一分化格局同样可在脊髓来源的NSCs中发现。结果表明, 我们所分离和培养的细胞在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能, 它们都表达nestin, 属于中枢神经系统的干细胞。
关键词: 中枢神经系统; 神经干细胞; 胚胎; 成纤维细胞生长因子－2; 表皮细胞生长因子
中图分类号: Q78
Isolation and
cultivation of neural stem cells from the embryonic rat brain and spinal cord
FU Sai-Li1, MA Zheng-Wen1, YIN Lan1, LU Pei-Hua1, XU Xiao-Ming1,2
1Department
of Neurobiology,
Abstract:The aim of this study was to establish the culture system of isolation and cultivation of the neural stem cells (NSCs) from the embryonic rat brain and spinal cord. The methods of microscopic dissection, cell culture and immunofluorescence cytochemistry were used. The results are as follows. (1) In the presence of fibroblast growth factor-2 (FGF-2) and epidermal growth factor (EGF), both brain- and spinal cord-derived stem cells proliferated and expanded in vitro for 8－10 passages (over 60 d). The period of expansion resulted in a 106- fold increase in brain-derived NSCs and 105- fold increase in spinal cord-derived NSCs. These proliferating cells expressed nestin. (2) In the medium containing 1% FBS, the two NSCs populations could be induced to differentiate into neurons, astrocytes and oligodentrocytes. The percentage of neurons (β-tubulinⅢ-ir) differentiated from brain-derived NSCs decreased rapidly from 11.95±2.5% at passage 2 (P2) to 1.97±1.16% at passage 5 (P5). Significant difference was shown between P2 and P5 (P<0.01). The percentage of oligodentrocytes (Rip-ir) differentiated from brain-derived NSCs remained mostly unchanged from 8.66±2.93% at P2 to 9.12±1.13% at P5. The same differentiation patterns were found in spinal cord-derived NSCs. All these results indicate that both embryonic rat brain- and spinal cord-derived NSCs can expand and proliferate in vitro through multiple passages, and retain the capacity to differentiate into all three major types of cells in the central nervous system.
Key words: central neural system; neural stem cell; embryo; fibroblast growth factor-2; epidermal growth factor
近年来, 很多研究表明, 在胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统(CNS)的不同部位都存在神经干细胞(NSCs)[1－4]。NSCs是一群具有自我更新﹑自我增殖和多向分化潜能的细胞,
它的发现为人们深入研究中枢神经系统的发育、 分化以及探索治疗神经系统疾病的新途径开辟了新的思路。因此, NSCs的基础研究和临床应用现已成为脑科学研究中的一个重要领域,
而中枢神经系统不同部位NSCs的分离和培养技术的成功建立, 将为人们更好地研究和使用NSCs提供有力的实验手段和丰富的细胞来源。
本文介绍了胚胎大鼠脑和脊髓NSCs的分离和体外培养方法, 并通过NSCs的增殖曲线、 NSCs的分化诱导以及免疫荧光细胞化学染色等方面的实验结果证实, 我们分离和培养的NSCs在体外有很强的增殖能力, 并且在自然分化的条件下具有多向分化潜能。
1 材料和方法
1.1 实验动物与试剂
怀孕Wistar大鼠(14－16胚龄), 由上海第二医科大学动物实验中心提供。
细胞培养液采用DMEM/F12无血清培养液, 另添加N2、 葡萄糖、 谷氨酰胺(均来源于GiBCO公司)和肝素(Sigma公司), 该培养液为NSCs基础培养液(DFNG); 在DFNG中加入成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2, GiBCO公司)和表皮生长因子(EGF, Sigma公司), 即为NSCs生长液; 在DFNG中加入1% 胎牛血清(FBS, GiBCO公司)为NSCs分化诱导的培养液。以Leibovitz's L-15 medium (L-15, GiBCO公司)作为洗涤液。多聚鸟氨酸、 多聚甲醛均来源于Sigma公司。抗nestin单抗来自Pharmingen公司, 抗β-Tubulin Ⅲ单抗、 抗GFAP单抗、 FITC标记的羊抗鼠IgG多肽以及Hoechst等均由Sigma公司提供, 抗RiP单抗由美国徐晓明教授惠赠。
1.2 细胞分离和培养
将怀孕鼠解剖后, 取出胚胎置于含有L-15的平皿中。于手术显微镜下剥离硬脑膜, 分离出大脑半球; 同时剥离硬脊膜和背根神经节, 分离出脊髓组织。随后分别将它们移至另一个含有L-15的平皿中, 剪成1mm3小块, 用抛光的直头细滴管轻轻吹打后, 使之成为细胞悬液, 并通过尼龙筛网过滤, 以去除粘连的组织纤维, 将收集到的细胞悬液离心后, 重悬于DFNG中, 用滴管再次吹打, 如此反复两次, 就可获得脑和脊髓的单个细胞悬液。经计数和活力观察, 将细胞密度调至1×106 /ml, 并以1×105/ml细胞密度种入T25细胞培养瓶(Falcon)中, 同时加入 FGF-2和 EGF, 于5% CO2、 37℃环境中培养, 直到NSCs分裂、 增殖形成较大的神经细胞球后再作传代处理。
1.3 细胞传代
当神经细胞球逐渐增大至50－200个细胞/球时, 即可传代。传代时将神经细胞球悬液移至离心管, 经低速离心后, 吸弃上清液, 加入200 μl DFNG培养液, 用200 μl Pipette 吹打100次, 使之成为单个细胞悬液, 定量加入DFNG后, 进行细胞计数和活力观察。经传代后的细胞既可用来诱导分化, 也可以继续种瓶培养, 还可以冷冻保存以备后用。
1.4 NSCs的分化和鉴定
取第二代(P2)和第五代(P5)培养的神经细胞球吹打成单细胞以后, 以5×104/片细胞密度种于经多聚鸟氨酸包被的玻璃盖玻片(Fisher)上, 在1%FBS-DFNG中分化培养5 d后, 做免疫细胞化学染色。如需要作神经细胞球的nestin染色, 则直接将培养中的神经细胞球种于盖玻片上, 待培养过夜后, 固定染色。用抗nestin单抗来标记NSCs; 而神经元、 星型胶质细胞和少突胶质细胞则分别用抗β-Tubulin Ⅲ单抗、 抗GFAP单抗和抗RiP单抗来标记。所采用的荧光抗体为FITC标记的羊抗鼠IgG多抗。同时以Hoechst作核染。
2 结果
2.1
NSCs的分离和培养
采用上述分离方法所获得的大脑和脊髓的原代(P0)细胞, 其活力分别为70%和40%左右, 所以在原代培养的初期, 可见到不少组织细胞碎片和灰暗的死细胞, 而活细胞则透亮、 胞体完整, 并分散沉于瓶底, 大约2－3 d以后, 在神经生长因子的作用下, 存活的单个细胞因细胞分裂能各自形成细胞小球(细胞簇)。 随着培养时间的延长, 细胞簇渐渐增多并脱离瓶底, 形成漂浮的神经细胞球。 这些细胞球球体透亮, 边缘整齐, 细胞排列紧密。 在位于球边缘的细胞膜上, 还可见到睫毛状小突起, 以后神经细胞球逐渐变大, NSCs 得以大量扩增。有趣的是脊髓来源的NSCs所形成的神经细胞球在早期呈贴壁生长, 这一点与以上所描述的脑来源的神经细胞球有所不同(图1A)。如果将这两种来源的NSCs所形成神经细胞球固定后作免疫荧光细胞化学染色, 发现它们均表达NSCs的特有标志nestin (图3A)。
图1.神经干细胞在体外培养中增殖形成神经细胞球
Fig. 1.Phase-contrast photograph of undifferentiated rat neural spheres growing in serum-free medium supplemented with FGF-2 and EGF (20 ng/ml) after three passages. A: Brain-derived neural spheres. B: Spinal cord-derived neural spheres. Scale bar, 200 μm.
2.2 NSCs传代
取原代培养所形成的神经细胞球进行传代处理, 并将这些传代后单个细胞悬液按原代种瓶的细胞密度再种瓶培养,同时加入NSCs生长液, 此即为第一代(P1), 按照此方法, 4个不同个体孕鼠的胚胎脑和脊髓的NSCs都分别被成功传代8－10代, 而且每一次传代后细胞均通过相差显微镜观察活力并计数。其细胞的增殖数是通过计数每一次传代后所获得的活细胞数后由下列公式计算而得:
细胞增殖数= 本代细胞收获数×上代细胞总数/种瓶细胞数
图2.神经干细胞体外生长曲线
Fig. 2.Growth rate of embryonic rat brain (Br)- and spinal cord (SC)-derived NSCs in vitro. Four “cell lines” have successfully amplified for 8-10 passages (over 60 d) and maintained in growth medium supplemented with FGF-2 and EGF (20 ng/ml) (E+F). Each date point represents a consecutive expansion and proliferating cell numbers shows on the ordinate. A: Growth rate for four “cell lines” of brain-derived NSCs. B: Growth rate for four “cell lines” of spinal cord-derived NSCs.
图2显示的是来源于4个不同个体孕鼠的脑和脊髓NSCs在体外的生长曲线, 尽管两种来源的NSCs在含有FGF-2和 EGF的培养条件下, 都呈现了相同的增殖趋势, 但存在个体差异。
2.3
NSCs的分化诱导和鉴定
将传代后的NSCs培养于1%FBS-DFNG中, 以观察它们自然分化的能力。在细胞接种后几小时内, 细胞贴壁并开始分化, 5 d后, 分化的细胞呈现出三种典型的神经细胞形态, 即具有一个或两个长突起, 胞体呈圆形或椭圆形的神经元样细胞; 具有多个细突起且不断分枝的少突胶质细胞样细胞; 具有多个粗长突起和多角形胞体的星形胶质细胞样细胞。免疫荧光细胞化学染色的结果也证实, 在自然分化的条件下, 这两种来源的NSCs都能分化成表达各种相应的特异性标志的终末细胞: 神经元(表达β-Tubulin Ⅲ)、 少突胶质细胞(表达Rip)和星形胶质细胞(表达GFAP)(图3B、C、D)。表1所显示的是脑来源的NSCs(P2和P5), 在1%FBS-DFNG中培养5 d后, 分化为β-tubulin Ⅲ和Rip免疫阳性细胞的比例, 从表1结果中我们可以看出, 随着细胞传代次数的增加, 神经元的分化比例从P2代的11.95±2.5%显著下降至P5代的1.97±1.16%; 而少突胶质细胞的分化比例基本上不受细胞传代次数的影响; 星形胶质细胞的分化比例在本文中未能给出, 是因为NSCs经诱导培养后所形成的GFAP免疫阳性细胞比例为最高, 加上该细胞在培养液中大都是成片生长, 使细胞间突起绞缠, 以至难以准确计数。
图3.神经干细胞及其三种分化细胞的免疫荧光细胞化学染色结果
Fig. 3.Identification of NSCs and three major differentiated cells. A: Brain-derived neural spheres stained against nesting (1∶800). B: GFAP (1∶200) positive cells represent astrocytes (Br-derived NSCs). C: β-tubulin Ⅲ (1∶800) positive cells represent neuron (Br-derived NSCs). D: Rip (1∶50) positive cells represent oligodendrocytes (SC-derived NSCs). immunofluorescence cytochemistry staining. Cell nuclei are labeled with Hoechst 33342. Scale bar, 50 μm.
表1. 脑来源神经干细胞(P2和P5)的分化比例 (n=4－6)
Table 1. Quantitative analysis of differentiation of brain-derived NSCs at P2 and P5
|
Passage Number |
Positive cells (%) |
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% β-tubulin III |
% Rip |
|
|
P2 |
11.95± 2.5% |
8.66±2.93% |
|
P5 |
1.97±1.16%* |
9.12±1.13% |
Data are presented as mean±SEM of four to six independent experiments. The asterisk (*) represents the passage which was significantly different from the preceding one (P<0.01).
3 讨论
由于NSCs具有广阔的应用前景而备受国内外研究者的关注, 而中枢神经系统各个不同部位NSCs的分离和培养方法的建立, 无疑为人们深入研究NSCs的细胞学特性, 阐明神经系统的发育机制提供一个先决条件, 同时更为进行细胞移植、 实现神经退行性疾病功能重建和神经再生提供合适的细胞来源[1,3]。近年来, 有关NSCs分离培养的方法已有不少报道, 但大都取自于成年或胚胎中枢神经系统的某一部位, 且方法上也以酶消化方法居多[2,3,5－7]。本文所报道的是胚胎大鼠脑和脊髓两种来源的NSCs的分离和培养的方法。该方法的特点是首先通过显微解剖、 吸管吹打和筛网过滤等步骤来获得大脑和脊髓组织的细胞, 然后利用无血清培养液中FGF-2和EGF的选择培养作用来纯化和培养NSCs。我们曾经参考国外实验室方法, 尝试采用酶消化法来分离这两种细胞, 然而效果却不理想。由于酶作用效力受多种因素的影响, 对于不同个体、 不同胎龄以及不同来源的组织, 酶作用的时间有可能都不同, 所以, 在实际操作中其实很难准确地把握酶作用的最佳时间点。 消化不足, 不易获得单细胞悬液; 消化过度则易造成细胞受损而导致细胞活力下降。其次, 所有用于分离NSCs的消化酶对细胞都存在潜在的损害作用, 而在NSCs表面具有针对许多神经生长因子的受体[8], 当采用酶消化法来获取NSCs时, 还可能会引起细胞表面受损而致使一部分受体丢失, 而这些受体对于NSCs维持其干细胞的未分化状态是必需的。所以, 从这个意义上来说, 采用显微解剖和吸管吹打等分离方法来制备NSCs悬液为NSCs的纯化培养和体内外实验提供了健康的细胞来源。
实际上, 从组织刚分离的细胞所含有的NSCs比例很小, 主要是因为在原代细胞中存有大量非神经干细胞和组织细胞碎片所致, 因此原代细胞中真正的NSCs数量是非常少的, 但这并不影响以后的培养及NSCs的纯度, 因培养液中所含的FGF-2和 EFG仅对NSCs具有促进分裂和增殖作用[9,10], 而非NSCs的其他细胞在该培养液中无法生长, 因此, 原代细胞中大部分非NSCs的其他细胞会发生死亡, 而NSCs不仅可以存活, 而且还可以分裂和增殖, 形成神经细胞球。随着培养的继续, NSCs会不断得以纯化并且在生长液中会越长越好, 越长越快。这一点我们可以从图2所显示的NSCs体外增殖曲线中看到, 在含有FGF-2和EGF的培养液中, 4个不同个体孕鼠的脑和脊髓来源的NSCs经体外培养60 d后, 其细胞数呈指数级增加。这一结果表明我们所分离的两种来源NSCs在体外均具有明显的增殖能力, 而且, 这一分裂、 增殖的特性不因细胞传代而改变。虽然4个不同个体的脑和脊髓NSCs 在体外生长中都表现出一致向上的增殖趋势, 但存在个体差异, 造成这种个体差异的原因可能与细胞对神经生长因子的敏感性及其受体的表达有关, 也可能与怀孕鼠的胎龄有关, 这些都将有待于进一步的研究[9, 10]。
另外, 在细胞换液时, 我们采用的方法是只加入而不吸弃。我们发现, 这样的换液方法较之于常规换液法更适合NSCs。原因一, 培养中的NSCs呈悬浮生长, 如果在换液时吸弃一部分液体, 可能会丢失一部分尚未开始增殖形成细胞簇的单个的NSCs而导致细胞获得率的下降; 原因二, 不排除增殖中的NSCs可能会自分泌一些神经生长因子及其他细胞因子的可能性, 而这些因子的存在, 对于NSCs的生长和增殖也许是有利的, 因为有不少实验室就曾尝试过在对NSCs换液时, 加入少量的NSCs培养上清来替代细胞培养液, 提示NSCs的培养上清中, 可能含有NSCs所释放的各种未知的细胞因子, 这些因子也许能和外源性神经生长因子协同作用于NSCs, 促使其更好的分裂和增殖[9,10]。
综上所述, 采用神经生长因子FGF-2和EGF, 我们已成功分离和培养了来源于胚胎大鼠脑和脊髓的NSCs, 并由实验证明: 两种来源的细胞, 尽管在培养特性上存在某些差异, 但它们都具备了NSCs的基本特征: (1)表达神经干细胞标志性蛋白nestin; (2)在培养中存活的NSCs可由单个细胞形成神经细胞球, 表明NSCs能自我更新、 自我增殖; (3)在自然分化条件下具有形成神经元、 少突胶质细胞和星形胶质细胞的能力。而且NSCs的自我增殖特性和多向分化潜能不因细胞传代而改变, 但随着传代次数的增加, 神经元的分化比例显著下降, 而少突胶质细胞的分化比例则维持不变, 这一分化格局同样可在脊髓来源的NSCs中发现。这一实验方法的建立, 将为在体外研究大脑和脊髓来源NSCs的生长特性及其分化规律提供一个很好的细胞模型, 同时也为进行NSCs移植时选用合适的供体细胞来治疗CNS特定部位的病变和损伤奠定了基础。
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