生理学报Acta Physiologica Sinica, June 25, 2003, 55(3): 290－295
研究论文
兔血管外膜对血管重构及收缩功能影响的初步观察
牟华明, 祝之明*, 王海燕, 王利娟
第三军医大学大坪医院高血压内分泌科, 重庆市高血压病研究所, 重庆 400042
摘要: 本文研究血管外膜在血管重塑及功能调控中的作用。实验采用在体去除兔颈动脉外膜的方法, 于术后即刻、1周及2周取出动脉作组织学、免疫组织化学染色及血管反应性测定。结果显示: (1)去除颈动脉局部外膜对内皮及中层平滑肌无明显损伤; (2)去除外膜后血管平滑肌细胞增殖, 并有新生内膜形成; (3)与对照侧比较, 去外膜侧血管对去甲肾上腺素的收缩反应在术后即刻及1周时减弱(P<0.05)。上述研究结果提示: 去除动脉外膜可导致血管内膜增殖及血管平滑肌收缩功能的改变, 表明外膜可能参与血管重塑及对血管功能的调控。
关键词: 外膜去除; 内膜增生; 血管反应性
中图分类号: Q463
Effect of removal
of the adventitia on vascular remodeling and vasoconstriction in rabbits
MU Hua-Ming, ZHU Zhi-Ming*, WANG Hai-Yan, WANG Li-Juan
Department of Hypertension and Endocrinology, Chongqing Hypertension Institute, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042
Abstract:The
aim of the present study was to investigate the effect of removal of the
adventitia on vascular remodeling and vasoconstriction of the carotid artery in
Key words: adventitia; carotid artery; rabbit
在血管壁的三层结构中, 内皮和中层的结构及功能特性已较为清楚, 而对外膜尚缺乏系统研究。外膜的组织学特性虽已完全明了, 但对其功能特性的认识则仅认为它是血管壁的支持结构, 本身不对血管的其它功能构成影响。最近有研究发现, 外膜在血管收缩及内皮源性的舒张反应中起作用[1], 外膜成纤维细胞向内膜及中膜移行参与动脉粥样硬化形成 [2], 这似乎表明外膜在维持血管正常功能和血管性疾病的发生中都起作用。本实验在在体状态下去除兔颈动脉部分外膜, 观察血管结构及收缩功能改变情况，以探讨外膜在血管重塑及功能调控中的作用。
1 材料和方法
1.1 模型建立及取材
实验用雄性新西兰白兔26只(2.4－3.0 kg)。速眠宁0.3 ml/kg肌注麻醉后, 颈前正中切口暴露双侧颈动脉, 钝性分离动脉周围结缔组织及脂肪。用刀片刮除右侧(外膜去除侧)颈动脉外膜, 长约4 cm。左侧颈动脉(对照侧)行假手术, 即以相同力度及时间牵拉血管, 但不刮外膜。逐层缝合皮肤。术后3 d连续肌注青霉素40万U/d预防感染。其中6只在完成外膜刮除术后立即取出双侧颈动脉, 光镜及电镜检查判断血管外膜去除程度、内皮及中层损伤情况。其余20只于普通饲料喂养1周及2周后取材, 切片后作显示弹力纤维及胶原纤维的双重组合染色、免疫组化染色和血管张力测试, 观察外膜去除后的结构及功能重构情况。
1.2 形态学检查
1.2.1 组织固定及切片
将取出的颈动脉迅速浸泡在4%多聚甲醛液中, 固定24 h以上, 冰冻截面切片。
1.2.2 HE染色
冰冻切片, 苏木精染色10 min, 伊红染色5 min, 再经酒精梯度脱水干燥后透明封片。光镜观察血管三层结构。
1.2.3 台盼蓝染色
截取一段长约1 cm的颈动脉, 纵形切开后用0.4%台盼蓝染内皮30 s, 体视显微镜观察内皮完整性。
1.2.4 电镜检查
颈动脉组织经2.5%戍二醛固定2 h, 再以1%锇酸固定, 不同浓度酒精脱水, Epson812包埋, 超薄切片, 醋酸铀染色, 扫描电镜观察外膜去除程度及内皮完整性, 透射电镜观察中层平滑肌有无受损。
1.2.5 组织学分析
用冰冻切片作显示弹力纤维及胶原纤维的双重组合染色, 可清楚显示内外弹力层。用数码显微镜将图像传输至微机, 利用图像分析软件(Motic image advance 3.0)进行分析。在微机显示屏上描出动脉环的内腔、内、外弹力层的完整轮廓后即可自动得出动脉腔横截面积(LA)、内弹力层围绕面积(IELA)、外弹力层围绕面积(EELA)。内膜增生面积=IELA－LA、中膜面积=EELA－IELA。计算内膜增生面积与中膜面积的比值作为衡量内膜增殖程度的指标。每份标本各取2张切片, 每张切片选5个血管环测定各层面积, 最后计算10个血管环所得数据均值作为该标本的最终数值。
1.3 免疫组化染色
切片用3% H2O2灭活内源性过氧化物酶, 经抗原修复后加二抗, 同种动物正常血清封闭, 然后分别加入一抗: 小鼠抗兔α-sm-actin单克隆抗体(博士德公司, 即用型, 检测血管平滑肌细胞)、小鼠抗兔巨噬细胞单克隆抗体(RAM-11, DAKO公司, 抗体稀释度1∶50)、小鼠抗增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体(博士德公司, 即用型), 生物素化二抗及链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物, DAB显色, 苏木素复染。胞浆内见棕黄色颗粒为α-sm-actin、RAM-11阳性。PCNA以胞核黄染为阳性, 计算细胞增殖指数: 每个目标血管各取2张切片, 通过图像分析仪, 在高倍视野(×40物镜)下统计阳性细胞的数目和总的细胞数目, 计算每张切片5个高倍视野阳性细胞比率。
1.4 血管张力测试
迅速取出双侧颈动脉, 冲洗残血, 剔除血管周围脂肪, 截取长2 mm的血管环。用自制金属钩将动脉环垂直悬挂于张力换能器与容积为10 ml的水浴槽底部的固定钩之间, 水浴槽内灌满95% O2+5% CO2饱和的PBS液(37℃)。调节静息张力为2 g, 平衡60 min, 每15 min换液1次。Norepinephrine (NE, 100 pmol/L)预激2次, 生理盐水冲洗5 min×2次。加入NE(10－100 pmol/L)刺激。NE引起的收缩反应以张力增加的绝对值(g)表示。同一动物两侧血管环置于同一浴槽内, 并使用型号相同的两个张力换能器同时进行张力测定。
1.5 统计学处理
数据以mean±SD表示, 采用t检验方法作统计学分析(应用PEMS软件), P<0.05为具有显著差异, P<0.01为具有极显著差异。为排除动物个体间差异带来的误差, 所有比较均在同一动物左右侧颈动脉间进行。
2 结果
2.1 外膜去除程度及对内皮完整性的损伤情况观察
手术后即刻取出的双侧颈动脉切片染色后光镜检查, 可见对照侧血管壁三层结构完整; 去外膜侧外膜结构已被去除, 中层裸露(图1)。扫描电镜观察到对照侧外膜面粗糙, 有交错的结缔组织包绕, 表明外膜尚存在; 去外膜侧外膜面光滑, 平滑肌细胞裸露于外(图2), 表明外膜已被去除。扫描电镜观察到对照侧及去外膜侧内皮细胞紧密排列, 无细胞脱失(图3), 双侧颈动脉内皮台盼蓝染色, 着色极少, 两侧几乎无差异, 表明手术中未造成内皮损伤。透射电镜观察见双侧平滑肌细胞各种细胞器完好, 无明显损伤。
2.2 内膜增生状况
术后1周及2周时去外膜侧新生内膜形成, 切片光镜观察内弹力层内梭形细胞沿血管长轴排列; 对照侧无新生内膜形成(图4)。2周时去外膜侧内膜面积增大, 内膜面积与中膜面积之比均较1周时有明显增高趋势, 但均无显著性差异 (表1)。
2.3 内膜及中膜细胞增殖指数
术后去外膜侧内膜及中膜可见PCNA的阳性细胞着色, 内膜及中膜2周时细胞增殖指数较1周时增高(表2)。
图1.颈动脉切片
Fig. 1.Left panel: Light micrograph of the control rabbit carotid artery showing the media (M) and the adventitia (A). Right panel: The carotid artery after surgical excision of the adventitial layer, showing the naked media and no adventitia (H﹠E).
图2.颈动脉扫描电镜观察
Fig. 2.Left panel: Scanning electron micrographs showing connective tissue around the control carotid artery. Right panel: Arteries without adventitia with connective tissue removed and vascular smooth muscle cell exposed.
图3.扫描电镜显示外膜去除侧颈动脉内皮层完整
Fig. 3.Scanning electron micrograph showing intact endothelial layer in the artery without adventitia.
表1. 术后1周及2周内膜面积、中膜面积及内膜面积/中膜面积比较
Table 1. Comparison of cross-sectional areas (mm2) of carotid artery after adventitia removed (n=7)
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|
1 week |
2 weeks |
||
|
Control |
AR |
Control |
AR |
|
|
Intima area |
－ |
0.04±0.03 |
－ |
0.08±0.02 |
|
Media area |
0.31±0.04 |
0.35±0.05 |
0.39±0.05 |
0.50±0.17 |
|
Intima/media ratio |
－ |
0.13±0.08 |
－ |
0.17±0.05 |
Control: intact; AR: adventitia removal.
图4.术后1周及2周时外膜去除侧颈动脉新生内膜形成
Fig. 4.Intimal hyperplasia can be seen 1 week and 2 weeks after removal of the adventitia (A), but not seen after pseudo-operation (B) (double stain of elastic and collagen fibers).
表2. 术后外膜去除侧内膜及中膜细胞增殖指数比较
Table 2. Comparison of rates of proliferation in intima and media (n=7)
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|
Intima |
Media |
|
1 week |
31.67±4.76 |
43.67±4.37 |
|
2 weeks |
42.17±5.27** |
57.00±4.47** |
**P<0.01 vs 1 week.
图5.颈动脉切片α-sm-actin免疫组织化学切片
Fig. 5.Intimal proliferative lesion on the adventitia-removed side, stained with α-sm-actin, a monoclonal antibody for smooth muscle cell actin (counterstained with haematoxylin). The antibody has stained the medial and intimal smooth muscle cells brown.The intimal cells are orientated in the direction of blood flow within the main vessel lumen, whereas the medial smooth muscle cell are arranged circumferentially. The endothelial cell nuclei have counterstained blue.
2.4 α-sm-actin、RAM-11免疫组化染色
术后去外膜侧内膜及中膜有α-sm-actin阳性着色, 表明增殖的内膜成分为血管平滑肌细胞(图5)。RAM-11组化染色阳性部位仅在对照侧与去外膜侧血管的局部外膜面(图6), 表明手术后引起外膜面少许炎症反应, 但增殖的内膜成分中尚无巨噬细胞浸润。
图6.颈动脉切片RAM-11免疫组织化学切片
Fig. 6.Intimal proliferative lesion on the adventitia-removed side, stained with RAM-11, a monoclonal antibody for macrophage (counterstained with haematoxylin). The antibody has stained macrophage in adventitia.
2.5 外膜去除对血管收缩和舒张功能的影响
离体颈动脉血管环对NE及ACh的反应曲线图(图7)。
与对照侧血管比较, 去外膜血管对NE的收缩反应在术后即刻及1周时减弱(P<0.05), 而术后2周时有明显增强, 但无显著性差异。去外膜血管在术后即刻对ACh的舒张反应增强, 1周时减弱, 但均无显著性差异 (表3)。
表3. 颈动脉对NE的收缩反应及对ACh的舒张反应改变
Table 3. Changes in carotid artery contraction induced by norepinephrine (g) and relaxation induced by acetylcholine (% of NE contraction)
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|
n |
NE |
ACh |
||
|
Control |
AR |
Control |
AR |
||
|
Instant |
6 |
1.17±0.35 |
0.71±0.14* |
0.23±0.09 |
0.32±0.09 |
|
1 week |
7 |
1.18±0.32 |
0.73±0.24* |
0.24±0.09 |
0.19±0.09 |
|
2 weeks |
7 |
1.18±0.29 |
1.46±0.16 |
0.26±0.09 |
0.25±0.10 |
*P<0.05 vs control.
图7.NE与ACh引起的血管收缩与舒张反应曲线
Fig. 7.Curve of vasotension. contraction induced by norepinephrine and relaxation induced by acetylcholine. The basic tension is 2 gram.1: NE (10－ 1000 pmol/L), 2: Ach (10－1000 mmol/L).
3 讨论
对血管壁三层结构的研究早期主要局限于中层血管平滑肌及内膜, 高血压和动脉粥样硬化等病变过程的发生,
主要是因中层血管平滑肌细胞增殖及反应性增高, 以及血管内皮功能紊乱所致, 外膜基本不参与上述病程。Li虽发现球囊损伤后外膜成纤维细胞向内膜移行参与新生内膜形成[2],
但Leon却无相同发现 [3]。
外膜在血管壁整体功能调控中是否起作用, 这是目前较为关注的问题。为此我们设想, 若外膜不参与该调控过程, 则外膜存在与否对血管结构及功能不会有丝毫影响。所以本研究采取在体状态下将外膜去除,
观察无外膜存在情况下血管结构及功能会有何种改变。但去外膜过程必须保证去除的仅仅是外膜, 而对其它两层结构无影响。为此我们将术后去外膜与完整的颈动脉立即取出, 光镜及电镜检查显示去外膜侧外膜结构已去除,
去外膜侧与对照侧血管内皮无明显损伤。
本研究发现血管外膜去除后发生内膜增生, α-sm-actin组化染色证实增生成分为血管平滑肌细胞, 表明中层平滑肌细胞增殖并向内膜移行而导致血管重塑。以前的研究认为, 粥样硬化性病变形成的基础是内膜应有损伤,
而本实验已证实外膜去除不会对内膜构成损伤, 可见内膜增殖并非必有内膜损伤作为前提, Booth研究也得出过类似结论[4]。
本研究另一发现是血管外膜尚影响血管舒缩功能, 外膜去除后血管对收缩性物质的反应降低, 于术后1周尚未恢复。Gonzalez[1]研究发现外膜去除即刻血管内皮依赖性舒张反应增强。上述情况产生的原因可能与外膜去除后的血管力学特性改变、 交感神经末梢去除、 超氧阴离子产生、 血管重构后的内皮结构及功能改变、 血管平滑肌细胞表型改变有关[1, 5]。
本研究可能的疑问是手术方法本身是否可能造成局部炎症反应从而导致血管结构及功能改变？实验中两侧颈动脉均做了手术, 外膜去除侧与假手术侧血管外膜面有单核巨噬细胞少量积聚, 提示手术本身可能造成局部炎症反应, 但它不是引起外膜增殖的原因, 因假手术侧一直无内膜的增殖。
由于外膜结构复杂, 外膜去除后的血管重构结构及功能改变到底与哪些因素有关。Barker[6]在阻断外膜中的滋养动脉后该血管出现内膜增殖,
其产生原因与血管壁低氧有关。而低氧可导致氧化应激反应激活, 由此产生的活性氧不仅参与低氧性血管收缩和舒张, 也参与血管平滑肌细胞的生长、 移行和凋亡[7]。本实验中外膜去除必然引起滋养血液供应受损,
由此导致的血管壁低氧也可能是引起上述改变的原因之一。
以上结果表明, 外膜结构对血管结构及功能稳态的维持是必不可少的, 保持外膜结构的完整性对于正常血管功能的维持及避免多种病理生理状态下的血管重构具有重要作用。
参考文献
[1] Gonzalez MC, Arribas SM, Molero F, Fernandez-Alfonso MS. Effect of removal of adventitia on vascular smooth muscle contraction and relation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2001;280:H2876－H2881.
[2]Li G, Chen SJ, Oparil S, Chen YF, Thompsom JA. Direct in vivo evidence demonstrating neointimal migration of adventitial fibroblasts after balloon injury of rat carotid arteries. Circulation 2000;March:1362－1365.
[3]De Leon H, Ollerenshaw JD, Griendling KK, Wilcox JN. Adventitial cells do not contribute to neointimal mass afer balloon angioplasty of the rat common carotid artery. Circulation 2001; October:1591－1593.
[4]Booth RF, Martin JF, Honey AC, Hassall DG, Beesley JE, Moncada S. Rapid development of atherosclerotic lesions in the rabbit carotid artery induced by perivascular manipulation. Atherosclerosis 1989;76:257.
[5]Wang HD, Pagano PJ, Du Y, Cayatte AJ,
[6]Barker SG, Talbert A, Cottam S, Barkerville PA, Martin JF. Arterial intimal hyperplasia after occlusion of the adventitial vasa vasorum in the pig. Arteriosclerosis Thrombosis 1993;13:70－77.
[7]Griendling KK, Sorescu D, Ushio-Fukai M. NADPH Oxidase Role in cardiovascular Biology and Disease. Circ Res 2000;86(5):494－501.