生理学报Acta Physiologica Sinica, June25,2003,55(3):296-302
研究论文
组织学与核磁共振检测大鼠癫痫源性早期脑损伤的跨半球扩布特征
韩丹1,*, 臧颖1, 杨运煌2, 刘买利2, 王文挺1, 邹祖玉3
1武汉大学医学院生理学系、 2中国科学院武汉物理与数学研究所波谱与原子分子物理国家重点实验室;
3武汉大学医学院病理学与病理生理学系, 武汉 430071
摘要: 慢性强直电刺激(60 Hz, 2 s)大鼠右侧背海马(hippocampus, DHPC)CA1基树突区, 1次/d, 连续刺激10 d。分别在施加强直电刺激的第2、 4、 6、 8或10 d时进行核磁共振成像检测(T2 weighted magnetic resonance image, T2-WI), 并对鼠脑进行组织学切片鉴定。结果表明, 早期慢性癫痫源性脑损伤的病理性形态特征主要包括: (1) T2-WI检测侧脑室(lateral ventricle, LV)区域信号增强、 组织学检测LV扩大和双侧对称性脉络膜丛病理性增生, 后两者并非完全平行呈现。(2)组织学切片显示双侧LV扩大面积与T2-WI信号增强区域面积的脑区分布近似。与空白对照组大鼠相比, 电刺激2、 4、 6、 8和10 d后, T2-WI信号增强区域面积显著增大(P=0.0259; P=0.0184; P=0.0184; P=0.0404; P=0.0259)以及组织学鉴定LV面积增大(P=0.0210; P=0.01; P=0.0100; P=0.0152)。(3)定侧分析显示, T2-WI信号增强以及T2-WI信号增强区域面积和组织学鉴定LV面积扩大, 在慢性刺激6 d时均以植入电极的对侧为主; 第 10 d时均以同侧为主。 三项观察结果的一致性证实了癫痫源性早期脑损伤的跨半球动态扩布特征。
关键词: 脑; T2加权核磁共振; 侧脑室扩大; 癫痫; 大鼠
中图分类号: Q424; R742.1
Propagation of
brain injuries from artificial focus into the opposite hemisphere at the early
stage of rat electrogenic epilepsy
identified by histology and
magnetic resonance image
HAN Dan1,*， ZANG Ying1, YANG Yun-Huang2, LIU Mai-Li2, WANG Wen-Ting1, ZOU Zu-Yu3
Departments
of 1Physiology and 3Pathology and
Pathophysiology,
Physics
and Mathematics, Chinese
Abstract:
The popurse of this work was to
study the characteristics of rat brain abnormalities at two hemispheres at the early stage of
electrogenic epilepsy. Experiments
were performed on 37 male Sprague-Dawley rats. Chronically repetitive
tetanization (60 Hz, 2 s, 0.4－0.6 mA) was used to
stimulate the right dorsal hippocampus (DHPC) of the rat brain once a
day for 2, 4, 6, 8 or 10 d, respectively. The T2 weighted magnetic resonance image (T2-WI) were obtained from each
experimental rat at the end of the
experiments. Histological sections were obtained after experimentation. The
results showed that the main
pathologic changes at the early stage of epilepsy included: (1) T2-WI hyperintensification, the histological
enlargement of lateral ventricle (
Key words: brain; magnetic resonance imaging; lateral ventricle; epilepsy; rats
海马(hippocampus, HPC)是一个癫痫发生的低阈值区域, HPC癫痫有可能扩布到双侧大脑皮层引起部分或全身癫痫样发作体征。有资料报道: 化学致痫剂诱导HPC癫痫形成的早期, 周期性出现的高频生物电振荡(>100 Hz)可以在脑损伤的邻近区域触发形成新的局部神经网络, 导致癫痫样生物电发作的发生[1]; 而HPC 9－16 Hz神经网络电振荡可以扩布到对侧大脑半球诱导产生继发性的癫痫全身性发作[2]。我室近期的研究工作也证实, 在慢性电刺激右侧背海马(hippocampus, DHPC)诱发癫痫形成的早期, 可观察到海马电图癫痫点燃样现象、 核磁共振(magnetic resonance image, MRI)检测侧脑室 (lateral ventricle, LV) 区域信号增强[3]、 组织学检测LV扩大、 脉络膜丛的病理性增生、对侧大脑半球易感以及动态发展特征[4]。MRI检测信号增强程度与电刺激诱发的大鼠原发性湿狗样抖的频率变化一致[5]。采用同样的刺激部位和参数, 对大鼠施加急性强直电刺激, 诱导的HPC神经元原发性单位后放电可以在双侧HPC神经元之间交互性显现[6], 体现了海马癫痫跨半球扩布和发展的电生理学特征。结果说明, 癫痫的形成过程是一个从单个神经元到神经元束、 局部神经网络、 多个神经网络间乃至全脑的病理性神经信息传递和整合的动态发展过程, 最终引发特征性体征发作。因此, HPC癫痫形成早期, 组织学鉴定LV扩大面积与MRI检测信号增强区域面积之间是否吻合, 是揭示癫痫源性早期脑损伤的跨半球特征的关键。本工作将着重报道同一癫痫模型上组织学鉴定LV扩大面积与MRI检测信号增强区域面积之间关系的量化分析结果, 以及在左右大脑半球的定侧特征, 为进一步揭示癫痫源性早期脑损伤跨半球扩布的神经网络时空发展特点提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物
雄性SD大鼠37只 (20－30 d)。 根据强直电刺激作用方式不同将实验组大鼠分为两组: 慢性电刺激组(n=21)和急性电刺激组(n=9)。将对照组大鼠分为两组: 假电极组(仅埋藏电极, 不施加刺激, n=3)和空白对照组(n=4)。
1.2 外科手术及电极植入
在0.4%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉下将动物头部固定在脑立体定位仪(江湾Ⅰ型C, 上海)上, 行开颅术。按照《大鼠脑立体定位图谱》[7], 将不锈钢双极同芯电极(尖端直径约0.1 mm)植入大鼠右侧DHPC CA1基树突区。电极尖端位置如下, P: －2.0 mm; R: －2.0 mm; H: －2.0至－2.2 mm。
用于慢性实验的动物颅骨表面采用牙托粉固定电极, 待动物苏醒后, 在标准实验室条件下喂养,
施加慢性强直电刺激。
急性动物实验中, 采用10%氨基甲酸乙酯对大鼠进行腹腔注射麻醉(1 g/kg), 刺激电极尖端的位置与慢性动物实验相同。
1.3 刺激与记录
在大鼠清醒状态下, 采用SEN-7203型刺激器(Nihon Kohden)经SS120J型刺激隔离器(Nihon
Kohden)对慢性实验组大鼠施加强直电刺激(60 Hz, 2 s, 0.4－0.6 mA), 刺激强度调节到诱发大鼠出现原发性湿狗样抖动(wet dog shakes,
WEDS)的最小强度。1次/d, 连续刺激2 (n=4)、 4 (n=3)、 6 (n=5)、 8 (n=3) 或10 d (n=4)后, 进行MRI检测。
急性动物实验中, 为了避免脑组织出现癫痫样电活动时对电刺激的不应期,
施加每个刺激串后间隔8至10 min, 一般施加10－12次电刺激, 观察刺激前后生物电现象的改变。
本文仅介绍进行组织学切片检测的实验结果。
记录慢性实验组大鼠的首次和末次深部电图以及急性刺激组大鼠电刺激前后的深部电图, 用以检测癫痫的电图发作程度。动物深部电图经生理八道仪(RM-6008, Nihon Kohden)进行记录, 对脑电波的最大电压幅值进行统计学分析。慢性或急性强直电刺激大鼠DHPC制作癫痫模型以及行为发作记录与以往实验相同[3－6]。
图1.刺激电极尖端位置以及T2-WI信号强度增强区域分析示意图
Fig. 1.Position of the stimulating electrode tip and the areas with T2-WI hyperintensity in the coronary brain section. R, right; L, left.
1.4核磁共振成像
在MRI检测中, 被检组织含氢原子核越多, 信号强度越大, 被磁化的氢原子核越多,
吸收的能量越大, MRI信号越强。由于水含量和弛豫时间的差异, 利用适当的MRI脉冲序列可以区别不同的生物组织, 获得有明显差异的正常和病理组织的图像。
慢性实验结束之前, 在10%氨基甲酸乙酯(1 g/kg)腹腔麻醉下使用MRI成像仪(Bruker
Biospec 47/30, 德国)对大鼠脑部进行MRI检测, 动物体温始终维持在37℃左右。磁场强度为4.7 T, 质子共振频率为200 MHz, 采用常规的自旋回波脉冲序列, 轴位冠状脑切片, 连续8片, 片厚0.75 mm, 片间距1
mm, 成像面积为30 mm×30 mm, 每片像距阵大小为128×128。T2-WI采样参数为: TR=2500 ms、 TE=30 ms、 回波数为16、 NA=3, 成像时间为34.1
min, 利用单指数拟合得到T2像。
选择含有刺激电极的MRI切片进行背部(LV下角头部)、 中部(海马伞)以及腹部(LV下角尾部)异常信号强度的视觉分析(图1),
具体分析方法见前文[4]。分析T2-WI信号增强区域的面积大小采用测量实际面积的方法进行, 对两个大脑半球T2-WI信号增强区域的实际面积进行定量分析。
对空白对照组大鼠LV T2-WI信号增强区域面积进行总体均数的可信区间估计后, 将所有慢性实验组大鼠信号异常区域的面积与之相比较, 对超出正常均数区间上限的大鼠进行LV扩大的定侧分析。
1.5 组织学切片鉴定
实验结束后, 用0.9% NaCl 100 ml和0.1 mol/L磷酸缓冲液配制的4%多聚甲醛150－250
ml对动物进行主动脉灌流, 取脑固定, 将脑置于4℃冰箱保存24 h。
取电极植入处前后各约1 mm范围内的鼠脑组织, 经流水冲洗、 常规脱水、
透明、 浸蜡及石蜡包埋处理后, 采用美国820型旋转式切片机(American Optical产品)对鼠脑进行冠状组织学切片, 片厚6 μm。用常规苏木素-伊红(HE)染色, 光镜下鉴定电极尖端位置和脑组织结构的变化。
由于MRI切片的片厚(0.75 mm)和片间距 (1 mm) 与组织学石蜡包埋切片的片厚(6 μm)相距甚远, 因而选择含有电极尖端痕迹的MRI前片[4]和相应的组织学切片, 也就是含有植入刺激电极轨道痕迹最明显的脑组织学切片进行平面脑结构分析。 采用与分析MRI检测结果相同的方法, 首先对组织学切片的背部、 中部和腹部区域进行视觉分析, 然后采用Scion Image图像分析软件对所有大鼠脑组织切片的LV实际面积进行定量定侧分析, 并与MRI检测的结果进行比较。
实验数据采用SAS软件进行统计学处理, 用秩和检验检测其差别是否具有显著的统计学意义。
2 结果
慢性强直电刺激的实验与以往的报道结果相同[4, 6], DHPC可以诱发大鼠出现原发性湿狗样抖动和末次HPC电图出现癫痫点燃样电活动; 施加急性强直电刺激5－7次后大鼠双侧HPC单位放电出现交互样癫痫相关性电活动。本文重点研究T2-WI信号增强区域面积与组织学切片鉴定LV实际面积之间的关系及其定侧分析。
2.1 组织学检测
所有空白对照组和假电极对照组大鼠的MRI检测和脑组织学切片检测中, 均未发现明显的脑组织异常区域, 空白对照组大鼠双侧LV区域面积之间无显著差异(P>0.05)。假电极对照组大鼠与空白对照组大鼠LV脑区T2值信号略有差异, 其差别不具有显著的统计学意义(秩和检验, P>0.05)[3,8]。
2.1.1 LV扩大
光学显微镜下观察组织学切片显示, 慢性电刺激组大鼠在“点燃效应”的行为出现之前, LV明显扩大。与空白对照组大鼠相比, 慢性电刺激2、 4、 6和10 d的大鼠LV面积增大具有显著的统计学意义(秩和检验, P=0.0210; P=0.01; P=0.0100; P=0.0152)。
在空白对照组大鼠上尚未见到LV扩大现象, 进行双侧LV面积大小总体均数可信区间估计后, 将所有慢性实验组大鼠的LV面积与之相比较, 对超出正常均数区间上限的大鼠脑组织切片进行双侧大脑半球定侧分析发现(图2A), LV扩大的区域面积大小由电刺激2 d时以植入电极同侧为主(2/4只), 发展为电刺激4 d (3/5只)及6 d (4/5只)时以植入电极对侧为主, 并在电刺激10 d时过渡为以植入电极同侧为主(3/4只)。急性强直电刺激大鼠DHPC 10 次后, 仅见到LV扩大。
图2.慢性强直电刺激大鼠出现LV扩大和T2-WI信号增强动态发展的定侧分析
Fig. 2.Lateralization of histologically
enlarged
以上结果说明慢性强直电刺激引起的LV扩大现象可以累及对侧, 表现为对侧易感。这进一步证明了大鼠癫痫源性早期脑损伤首先累及LV区域, 并具有跨半球动态扩布特征。
图3.慢性实验组大鼠LV扩大不伴有或伴有脉络膜丛上皮细胞的病理性增生
Fig. 3.The enlarged LV and pathological ventricular choroidea plexus hyperplasia were histologically observed in coronary brain slices obtained from one chronical experimental rat, but the enlarged LV was observed only in acute experimental rat. A: HE slice from one chronically tetanized rat. B: HE slice from an acutely tetanized rat. R, right; L, left; ↓, the position of the stimulating electrode tip. Scale bar, 0.5 mm.
2.1.2 侧脑室脉络膜丛上皮细胞病理性增生
慢性强直电刺激不仅引起大鼠LV扩大, 还常伴有LV脉络膜丛上皮细胞的病理性增生(图3A), 双侧多见, 呈现对称性, 随着刺激天数增加逐渐加重。而在急性强直电刺激大鼠仅见LV扩大, 而不伴有脉络膜丛上皮细胞的病理性增生(图3B)。
慢性电刺激诱发的LV扩大与脉络膜丛上皮细胞病理性增生现象呈现不完全平行状态, 19只出现LV扩大的动物中仅有4只伴有脉络膜丛上皮细胞增生。
图4.冠状MRI脑切片和脑组织学切片显示同一慢性实验组大鼠LV异常扩大现象
Fig. 4.Pathological LV enlargement was identified using coronary magnetic resonance image (MRI) slice and HE-stained slice obtained from one chronic experimental rat. R, right; L, left. A: Scale bar 5 mm. B: Scale bar 0.5 mm.
2.2 核磁共振检测信号异常与组织学检测LV病理异常的相关性分析
视觉分析含有电极痕迹的组织学切片与MRI切片发现: 组织学切片显示双侧LV扩大区域与
T2-WI信号增强区域的分布基本吻合(图2B),两者具有相似的动态发展趋势(图2A和B), 图4是其中的一个例子。定量分析 T2-WI信号增强区域面积(mm2): 与空白对照组大鼠相比,
电刺激DHPC 第2、 4、 6、 8或10 d后, 慢性实验组大鼠T2-WI信号增强区域面积显著增大(P=0.0259; P=0.0184;
P=0.0184; P=0.0404; P=0.0259), 其数值较组织学鉴定LV实际面积值略有偏大(表1)。这种差异可能是由于MRI切片的每片厚750 μm, 可以涵盖百片以上的组织学切片(片厚6 μm), 重叠较多形态学信息所致。
如图2B定侧分析所示, 信号增强区域面积在电刺激2 d时呈现双侧背部对称性(2/4只), 4 d时以植入电极同侧为主(3/5只), 6 d时以植入电极对侧为主(4/5只), 8 d (2/3只)或10 d时以植入电极同侧为主(4/4只)。
表1. T2-WI 信号增强区域面积以及组织学鉴定LV扩大面积的比较
Table 1. Comparison between T2-WI hyperintensive area and histologically enlarged LV area (mm2)
|
Stimulating day |
MRI slice |
HE slice |
||
|
Right |
Left |
Right |
Left |
|
|
Control |
0.48 |
0.27 |
0.20 |
0.13 |
|
2 |
1.61* |
1.55* |
0.73* |
0.38* |
|
4 |
2.19* |
1.89* |
0.89* |
1.45* |
|
6 |
1.45* |
2.09* |
0.72* |
1.13* |
|
8 |
2.14* |
0.84* |
0.56 |
0.47 |
|
10 |
2.37* |
0.68* |
1.80* |
1.61* |
*P<0.05.
表2. T2-WI信号增强区域、 信号增强区域面积以及组织学鉴定LV扩大面积的定侧分析
Table 2. Lateralization of T2-WI hyperintensity, abnormal areas and histologically enlarged LV areas
|
Stimulating day |
T2-WI hyperintensity (Worse) |
T2-WI abnormality area (Worse) |
Histologically enlarged LV area (Worse) |
|
2 |
Bilateral and symmetric |
Bilateral and symmetric |
Ipsilateral |
|
4 |
No statistical significance |
Ipsilateral |
Contralateral |
|
6 |
Contralateral |
Contralateral |
Contralateral |
|
8 |
Contralateral |
Ipsilateral |
No statistical significance |
|
10 |
Ipsilateral |
Ipsilateral |
Ipsilateral |
慢性刺激DHPC 6 d时, MRI信号增强区域、 MRI信号增强区域的面积和组织学鉴定LV扩大面积(发生率)均以植入电极的对侧为主; 10 d时均以同侧为主(表2), 进一步证实了癫痫源性早期脑损伤的跨半球动态扩布特征。
3 讨论
本工作观察到的早期慢性癫痫源性脑损伤的病理性形态特征主要包括: (1)组织学鉴定LV扩大面积与MRI检测T2-WI信号增强区域面积的分布以及动态发展趋势具有相似之处。(2)LV脉络膜丛上皮细胞病理性增生多表现为双侧对称性, 与LV扩大并非完全平行呈现。(3)MRI信号增强区域、 MRI信号增强区域面积和组织学鉴定LV扩大面积定侧分析的动物发生率, 在慢性电刺激DHPC 6 d时均以植入电极的对侧为主; 电刺激10 d时均以同侧为主, 进一步证实了癫痫源性早期脑损伤的跨半球动态扩布特征。
3.1 左右大脑半球与海马癫痫的发生、 发展与扩布
临床上联合运用EEG与脑磁图检测显示, 癫痫患者右侧小腿连续肌阵挛性癫痫发作的病灶位于左侧大脑半球的运动皮质, 接近MRI监测的脑信号异常区域[9], 而据行为学与脑电图(video-EEG)连续监测, 癫痫患者痫样发作(EEG seizures)可以从大脑半球的一侧扩布到另一侧[10]。电刺激单侧中部颞叶可以诱导刺激电极同侧或对侧出现痫样发作[11]。可见左侧大脑半球的癫痫灶或损伤可以引起右侧肢体出现发作样体征, 而单侧的癫痫灶也可以引起双侧大脑半球出现癫痫样电图发作。不仅如此, 左侧大脑半球在癫痫发生的易感性方面也存在着明显的差异。有资料报道, 人类癫痫更容易发生在左侧大脑半球[12], 左利手者尤其如此[13]。这说明双侧大脑半球之间存在着癫痫发生的脑区非对称性, 当癫痫样生物电活动扩布到对侧大脑半球时, 也可以形成新的脑损伤区域和产生继发性癫痫病灶[4, 6]。我室近期的实验研究表明, 强直电刺激大鼠尾壳核可以诱导双侧海马出现原发性后放电和癫痫点燃效应[21], 而双侧海马神经元之间的原发性单位后放电也可以交互性出现[6]。MRI检测信号异常程度与电刺激诱发的大鼠原发性WEDS的频率变化一致[5]。因此, 左右大脑半球双侧海马之间的癫痫源性跨半球病理性神经网络的重新建立可能是引起癫痫全身性体征发作的重要神经机制之一。
3.2 癫痫源性早期脑损伤的跨半球特征及其意义
颞叶癫痫的重要病理特征之一是HPC的硬化和萎缩[14]。事实上, 药物难治性癫痫者的HPC硬化与潜在的癫痫源性皮质损伤往往是并存的双重病理改变
[15]。临床研究发现: 无论颞叶癫痫患者是否有HPC硬化均可出现癫痫灶的同侧颅内容积明显减少[16], 可见癫痫源性颅内容积的减少可以出现在HPC硬化之前,
但是否由于HPC与皮质癫痫源性双重损伤所致值得研究。临床上采用MRI检测技术以及对神经外科手术后切除患者的HPC或颞叶结构进行组织学鉴定可以清楚地识别HPC硬化的程度,
但是潜在的早期癫痫源性脑损伤部位却难以确认。本室近期的系列整体动物实验研究证实: 癫痫源性早期脑损伤主要表现为T2-WI 信号异常、 LV扩大和脉络膜丛病理性增生[3－5,
8, 17]。慢性强直电刺激DHPC或中部颞叶新皮质均能引起植入电极对侧出现非对称性侧脑室区域MRI检测信号异常, 不同的是: HPC刺激组大鼠有高频率的原发性WEDS,
而中部颞叶新皮质刺激组大鼠有低频率原发性WEDS。提示: 刺激右侧中部颞叶新皮质诱发双侧HPC-EC环路异常电活动会引起MRI检测双侧LV区域信号异常。由于EC与DG的双重门控作用[5,
17], HPC癫痫扩展到运动皮质区域受到阻遏, 引起低频率WEDS。说明: 慢性刺激单侧HPC诱导癫痫源性早期脑损伤是具有跨越大脑半球扩布特征的, 而且与全身性行为的发作程度有关。尽管单凭MRI检测LV区域信号异常尚难以确定异常活动脑区的精确位置,
但是根据LV室壁和周边的神经组织结构可以推测, MRI检测的信号异常与双侧HPC的异常活动有关。 采用同样的刺激参数, 刺激同样的右侧HPC基树突区可以观察到双侧HPC神经元原发性单位后放电的跨半球交互性显现[6],
这从细胞机制上支持了这一假说: 双侧HPC癫痫相关性病理神经网络的重新建立很可能是引起T2-WI 信号异常的主要原因, 而具有跨半球特征的LV扩大区域脉络膜丛病理性增生现象[4,
8]间接支持了这一观点。
本工作中, 慢性刺激DHPC在癫痫形成的早期可以引起MRI检测异常信号面积具有双侧大脑半球动态变化的相似特征, 第6 d时均以植入电极的对侧为主; 电刺激10 d时均以同侧为主。而在第4 d时, 原发性湿狗样抖动频率达高峰, 随后下降, 而MRI检测信号异常逐渐加强[4]。但是, 组织学检测LV扩大面积的跨半球动态变化特征仅仅部分与MRI检测异常信号面积吻合, 扩大的LV脉络膜丛病理性增生也支持了MRI检测的信号异常可能涉及脑实质性结构的损伤。另一方面, 在急性强直电刺激相同的区域仅仅存在LV扩大, 尚未观察到LV脉络膜丛病理性增生。该现象提示, 慢性强直电刺激诱导神经元活动异常和脑脊液代谢异常是导致LV脉络膜丛病理性增生的重要原因。推测, LV扩大可能与LV内脑脊液形成的量和质有关, 而重复强直电刺激可以引起神经组织的过度活动导致LV内脑脊液增多, 长期慢性强直电刺激时, LV脉络膜丛的功能过度增强会引起病理性增生, 这是一种脑组织结构的病理性改变。因此, 单纯急性强直电刺激时, 大鼠仅表现为LV扩大而没有脉络膜丛上皮细胞的病理性增生。 新近报导道的临床研究结果进一步证实了这一点, 癫痫患者HPC T2-WI信号异常主要与齿状回胶质细胞的比例升高有关[18]。在实验性动物颞叶癫痫点燃模型上, 产生脑损伤的主要特点是细胞损失与胶质化、 突触重构以及有一定潜伏期的慢性发作[19], 在不同年龄的大鼠“seizure”引起HPC神经元损伤的数目不一样[20]。在临近区域, 早期癫痫诱发的脑损伤可以触发神经网络癫痫发作的形成, 包括高频电振荡[1]。可以认为, 癫痫电活动的传布、 反复发作与癫痫源性的早期脑损伤往往是平行存在的。
我室新近报道的实验结果显示, 急性强直电刺激尾-壳核不仅可以促进同侧HPC癫痫和中部颞叶新皮质癫痫的同步化, 而且可以诱导双侧HPC电图出现癫痫点燃现象[21]。由此可见, HPC癫痫不仅可以由急性或者慢性电刺激引起, 而且可以在皮层下核团的异常电活动的激发下继发产生, 并由强直电刺激诱导的尾壳核-HPC-中部颞叶新皮质癫痫源性病理生理神经电通路并动态扩布到对侧大脑半球, 而累及更大面积的脑区。
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