生理学报Acta Physiologica Sinica, June 25, 2003, 55(3): 324－330
研究论文
人体肝癌细胞急性低氧及低氧习服差异表达基因分析
王金惠*, 善亚君, 从玉文, 吴岚军, 苑晓玲, 赵振虎, 王升启, 陈家佩
军事医学科学院放射医学研究所, 北京 100850
摘要: 本文分析了人体肝癌细胞(HepG2)急性低氧处理以及低氧习服处理后基因表达谱的改变。急性低氧处理为细胞在1%氧气中培养48 h, 低氧习服处理为细胞在1%氧气中培养24 h, 常氧培养24 h, 以此作为一个周期, 重复6个周期。联合应用抑制消减杂交技术和cDNA芯片技术, 筛选HepG2细胞经急性低氧处理与正常培养细胞相比差异表达的基因, 以及经低氧习服处理细胞与正常培养细胞相比差异表达的基因。 结果显示, HepG2细胞经急性低氧处理与在常氧条件下培养相比, 差异表达的基因有37个, 表达水平全部表现为下调, 其中包括参与细胞周期、 细胞应激、 细胞信号转导、 细胞骨架形成、 转录相关蛋白及细胞代谢相关蛋白的基因, 1个未知基因序列、 4个EST序列、 5个线粒体蛋白基因, 另外有功能不明的蛋白质基因12个。低氧习服处理的细胞与常氧条件下培养的细胞相比, 差异表达的基因有6个, 其中包括两个线粒体蛋白基因、 金属蛋白酶1基因、 转铁蛋白基因、 Thymosin.beta-4和TPT1基因。其中线粒体蛋白ND4、 转铁蛋白、 Thymosin.beta-4和TPT1基因的表达呈上调, 线粒体ND1及金属蛋白酶1基因的表达水平呈下调。经低氧习服处理后, 细胞低氧耐受力提高, 低氧习服处理细胞基因的表达与急性低氧处理细胞和正常培养细胞的基因表达不同, 这种变化可能与低氧习服细胞低氧耐受力的增强有关。
关键词: 细胞低氧; 抑制消减杂交; cDNA微阵列; 基因表达
中图分类号: Q493.9
Identification of
differentially expressed genes of acute hypoxia-treated HepG2 cells and
hypoxia-acclimatized HepG2 cells
WANG Jin-Hui*, SHAN Ya-Jun, CONG Yu-Wen, WU Lan-Jun, YUAN Xiao-Ling, ZHAO Zhen-Hu, WANG Sheng-Qi, CHEN Jia-Pei
Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850
Abstract: To provide necessary information for further understanding of molecular mechanism of hypoxia acclimatization, the differentially expressed genes of HepG2 cells exposed to normoxia, acute hypoxia-treated cells which were exposed to 1% oxygen for 48 h, and hypoxia-acclimatized HepG2 cells which were cultured for 6 circles of alternate low oxygen (1% oxygen for 24 h) and normal oxygen (21% oxygen for 24 h), were identified respectively by combining the suppression subtractive hybridization (SSH) and cDNA microarray. Thirty-seven genes were expressed differentially in cells exposed to 1% oxygen for 48 h compared with those in cells exposed to normoxia. The expression of all these 37 genes was down-regulated, including the genes participating in cell cycle, cell response to stimulus, and cell signal transduction, and cell cytoskeleton formation, the genes associated with transcription and cell metabolism, 4 expressed sequence tags (ESTs), and 12 genes of which the functions are not known. There is a novel gene sequence, which has not been found in existing databases. There were only 6 genes differentially expressed in the hypoxia-acclimatized cells compared with cells exposed to normoxia, including two mitochondrion genes, metalloprotease-1 gene, ferritin gene, thymosin beta-4 and TPT1 genes. The expressions of mitochondrion ND4, ferritin, thymosin beta-4 and TPT1 were up-regulated, while the expressions of mitochondrion ND1 gene and metalloproease-1 gene were down-regulated. Cell tolerance to hypoxia increased after the cells were hypoxia-acclimatized. The different gene expression patterns of the acute hypoxia-treated cells and the hypoxia-acclimatized cells may be related to the increased tolerance of the cells to hypoxia.
Key words: cell hypoxia; suppression subtractive hybridization; cDNA microarray; gene expression
阐明机体或细胞对低氧的适应机制, 有助于人类探寻更快、 更好地适应低氧的新方法。迄今为止, 有关急性低氧造成机体或细胞损伤的研究报道很多, 已涉及机体各个系统[1－4], 但有关低氧习服的研究报道很少, 尤其是低氧习服发生的分子机制的研究鲜有报道。低氧对细胞及机体造成的影响是多方面的。 对细胞而言, 影响细胞形态, 细胞周期、 细胞信号转导等, 而这些过程又都是多基因控制的, 从多基因表达水平的变化来研究低氧习服的分子机制更为有利。用于多基因表达水平研究的方法很多, 其中联合应用抑制消减杂交(SSH)和cDNA芯片技术更具优点。SSH方法具有快速、 简便易行, 所需mRNA量较少以及假阳性率低等特点[5]。cDNA芯片技术是目前进行高通量DNA表达分析的最为有效的手段之一[6]。
人肝癌细胞(HepG2)是低氧敏感细胞, 是研究低氧较为理想的细胞株, 选用此细胞研究低氧对细胞影响的报道很多, 如低氧影响细胞因子EPO、 VEGF等基因的表达, 低氧下细胞信号转导的变化等[7－9]。本实验室已选用此细胞建立了低氧习服细胞模型[10], 并探讨了低氧习服及急性低氧处理细胞中EPO、 VEGF、 p53等基因表达水平的变化[11]。因此, 本研究在前期工作的基础上, 以HepG2细胞为研究对象, 联合应用SSH与cDNA芯片技术分析了HepG2细胞急性低氧以及低氧习服处理后差异基因的表达, 以期为今后进一步揭示低氧习服发生的分子机制提供必要的资料。
1 材料和方法
1． 材料
细胞株: 人肝癌细胞HepG2为本室保存。PCR-SelectTM cDNA消减试剂盒、 Advantage2 PCR Enzyme System、 NucleoTrapTM PCR 纯化试剂盒、 AdvanTAgeTM PCR克隆试剂盒、 SupertranscriptⅡ反转录酶、 Trizol总RNA提取试剂盒、 大肠杆菌Top10F'和 pT-Adv载体等购自CLONTECH公司; Scan Array 3000荧光扫描仪(General Scanning公司); 氨基化修饰载玻片(TeleChem International公司); Cartesian PixSys5500系统、 Axsys芯片点样控制软件(Cartesian Technologies公司); ImaGene 4.1图像分析软件(BioDiscovery公司)。
1． 2 方法
1.2.1 细胞处理
正常细胞置于常氧10%的小牛血清，放入1640培养基中培养; 急性低氧处理细胞置于1% 氧和10%的小牛血清，放入1640培养基中培养48 h; 低氧习服处理细胞为常氧培养24 h, 1%氧培养24 h, 以此作为一个周期, 6个周期后达到习服状态[8]。
1.2.2 抑制消减文库的构建
按照细胞总RNA提取试剂盒操作说明,分别提取正常培养细胞、 急性低氧处理细胞和低氧习服处理细胞的总RNA, 其中分别取急性低氧处理细胞和低氧习服处理细胞的总RNA各 600 μg , 合并作为实验组总RNA。 正常培养细胞总RNA作为对照组总RNA, 按Promage mRNA提取试剂盒提取mRNA; 分别取实验组和对照组2 μg mRNA, 按照消减文库构建试剂盒操作说明, 将反转录后的实验组cDNA作为tester, 对照组cDNA作为driver, 构建消减文库, 富集与正常细胞表达差异的实验组 cDNA片段。同时, 设立对照实验, 以试剂盒中提供的骨骼肌细胞DNA作为driver, 以提供的骨骼肌细胞DNA中加入少量ФX174酶切片段作为tester, 经消减过程后, 对第一和第二次PCR产物进行电泳分析, 以鉴定消减效果。将差异片段克隆入pT-Adv载体, 转化大肠杆菌Top10F', 建立消减文库。
1.2.3 差异表达片段的PCR扩增及纯化
以蓝白斑初步筛选转化的大肠杆菌克隆, 选择较大的白斑进行扩增培养, 利用pT-Adv载体多克隆位点两侧的通用引物(上游: 5'-AAACAGCTATGACCATGA TTAC-3', 下游: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGG-5')对其中的插入片段进行PCR扩增, 以验证是否有外源片段插入。选择扩增片段长度在350 bp以上的克隆, PCR扩增插入片段, 利用NucleoTrapTM PCR 纯化试剂盒按照操作说明对扩增产物进行纯化。
1.2.4 cDNA芯片的点制
纯化干燥后的cDNA片段溶于4 μl 3×SSC 溶液中, 浓度调整为0.5 μg/μl用于点制cDNA芯片。每区含有看家基因β-actint和G3PDH作为阳性对照。点样后玻片经水合、 室温干燥、 UV交联, 再用0.2% SDS、 水及0.2%硼氢化钠溶液处理, 晾干备用。
1.2.5 探针制备及杂交
分别提取正常培养HepG2细胞, 急性低氧处理细胞和低氧习服处理细胞的总RNA, 测定OD(260)/(280)以鉴定RNA的质量, 在50 μl反转录反应体系中加入100 μg总RNA, 按照 Schena[12]的方法合成及纯化cDNA探针, 以Cy3-dUTP标记正常培养细胞总RNA, Cy5-dUTP分别标记急性低氧处理细胞总RNA和低氧习服处理细胞总RNA。乙醇沉淀后将Cy3-dUTP和Cy5-dUTP标记的探针混合溶解在20 μl杂交液中(50%甲酰胺, 5×SSC, 0.2% SDS, 5×Denhardt试剂)。芯片和杂交探针分别在95℃变性后置于杂交舱内, 加入混合探针, 于42℃杂交16 h, 按顺序用2×SSC＋0.2% SDS 、 0.1%×SSC＋0.2% SDS、 0.1%×SSC分别洗涤5 min, 室温晾干。
1.2.6 表达差异基因的检测与生物信息学分析
用Scan Array3000扫描芯片, ImaGene3.0软件分析两种荧光信号的强度和比值。将下列三个条件作为判断基因差异表达的标准: (1) Cy5/Cy3的自然对数的绝对值>0.69(Cy3和Cy5信号相差2倍以上); (2)Cy5或Cy3信号值, 其中之一必须>1000; (3) PCR结果良好。差异表达的基因进行DNA序列测定。序列测定结果用BLASTN比对分析。
2 结果
2．1 消减文库的构建
正常细胞、 急性低氧处理及低氧习服处理细胞的总RNA OD260/280值分布在1.85－1.96之间。 以甲醛变性电泳分析, 可看到18S和28S两条清晰条带, 其中28S与18S条带的亮度比为1.5－2.0, 说明RNA质量良好。正常组及实验组(合并急性低氧处理细胞总RNA和低氧习服处理细胞总RNA各600 μg作为实验组总RNA) mRNA OD260/280 分别为2.08和1.96, 甲醛变性电泳分析可看到2000 bp－12 kb之间弥散的条带, 18S和28S条带较浅, 说明mRNA 质量较好。分别取正常组和实验组细胞2 μg mRNA进行反转录后, 以RsaI酶切, 核酸电泳分析酶切结果看到片段大小集中在500 bp左右, 说明RsaI酶对反转录片段进行了有效的酶切(图1)。将实验组酶切后产物加上特异性接头片段, 接头连接效果分析表明实验组cDNA有25%以上接上了接头(图2)。接头连接之后, 对产物进行两次PCR, 结果表明, 经消减后, 急性低氧处理细胞及低氧习服处理细胞合并的实验组第二次PCR中发现了较特异带富集。同时利用对照实验分析消减效果, PCR电泳结果表明, 经过消减后, 第二次PCR中, 对照实验的实验组仅有ФX174特异片段得到了扩增, 说明消减效果较好(图3)。将合并了急性低氧处理细胞及低氧习服处理细胞的实验组消减后的第二次PCR 产物连入pT-Adv载体中, 转化大肠杆菌Top10F'。收集菌斑较大的白色菌落, 利用pT-Adv载体两侧的通用序列进行PCR扩增, 共得到740个克隆, PCR鉴定阳性率为95%, 片段大小分布于150－1200 bp之间, 60%分布在300－700 bp之间。
图1.cDNA合成及RsaI酶切效率分析
Fig. 1.Efficiency of ds cDNA synthesis and RsaⅠdigestion analysis. 1, tester ds cDNA synthesis after RsaI digestion; 2, tester ds cDNA synthesis before RsaI digestion; 3, DNA size markers (DL2000 marker); 4, driver ds cDNA synthesis before RsaI digestion; 5, driver ds cDNA synthesis after RsaI digestion. The tester group means the acute hypoxia-treated HepG2 cells together with hypoxia-acclimatized HepG2 cells.
图2.cDNA接头连接效率分析
Fig. 2.Efficiency of cDNA adaptor ligation analysis. 1, DNA size markers(100 bp ladder); 2, PCR products using tester (adaptor 1-ligated) as the template, and the G3PDH3' and 5' primers; 3, PCR products using tester (adaptor 1-ligated) as the template, and the G3PDH3' primer and PCR primer 1; 4, PCR products using tester (adaptor 2-ligated) as the template, and the G3PDH3' and 5' primers; 5, PCR products using tester (adaptor 2-ligated) as the template, and the G3PDH3' primer and PCR primer 1. The tester group means the acute hypoxia-treated HepG2 cells together with hypoxia-acclimatized HepG2 cells.
2．2 cDNA芯片的杂交
利用荧光素Cy3标记正常细胞, 分别用Cy5标记急性低氧和低氧习服处理细胞的总RNA。将两组探针: 合并Cy3标记的正常细胞总RNA与Cy5标记的急性低氧处理细胞总RNA的探针1, 合并Cy3标记的正常细胞总RNA与Cy5标记的低氧习服处理细胞总RNA的探针2, 分别对点制的芯片进行杂交。杂交后荧光信号以ScanArray 3000荧光扫描仪扫描, 以ImaGene 4.1图像分析软件进行分析。
图3.消减效率分析
Fig. 3.Efficiency of subtraction analysis. 1, secondary PCR product of unsubtracted skeletal muscle tester cDNA; 2, primary PCR product of unsubtracted skeletal muscle tester cDNA; 3, secondary PCR product of subtracted skeletal muscle tester cDNA; 4, primary PCR product of subtracted skeletal muscle tester cDNA; 5, DNA size markers (200 bp ladder); 6, secondary PCR product of unsubtracted experiment tester cDNA; 7, primary PCR product of unsubtracted experiment tester cDNA; 8, secondary PCR product of subtracted experiment tester cDNA; 9, primary PCR product of subtracted experiment tester cDNA. The tester group means the acute hypoxia-treated HepG2 cells together with hypoxia-acclimatized HepG2 cells.
2．3 序列分析
急性低氧处理细胞与正常细胞相比有46个基因的表达发生了变化, 对这些片段进行了序列分析, 其中9个序列为重复序列, 详细资料见表1。
低氧习服处理细胞与正常细胞相比有6个克隆的表达发生了变化, 对这些片段进行了序列分析, 详细资料如表2所列。
表1. HepG2急性低氧处理后差异表达的基因
Table 1. Differentially expressed genes of HepG2 cells exposed to acute hypoxia
|
Clone |
Identity |
Reduced fold |
Gene bank accession No |
Insert size (kb) |
Nucleotide equenced |
mRNA size (kb) |
Nucleotide % identity |
|
A12 |
Mitochondrion protein ND1 |
15.0 |
AF382011 |
0.45 |
0.45 |
16.569 |
99 |
|
A18 |
CGI-51 |
7.7 |
XM-043614 |
0.45 |
0.45 |
1.714 |
100 |
|
A30 |
Phospholipase A2 |
12.4 |
M86400 |
0.75 |
0.56 |
2.834 |
96 |
|
A35 |
Human sapiens cDNA FLJ32403 |
6.9 |
AK056965 |
0.75 |
0.68 |
1.432 |
99 |
|
A65 |
mRNA expressed only in placental villi |
59.5 |
AB019563 |
0.27 |
0.35 |
0.333 |
100 |
|
A66 |
Mitochondrion protein ATP synthase 6 |
8.0 |
AF381982 |
0.45 |
0.252 |
16.567 |
100 |
|
A68 |
EST |
8.0 |
BI253829 |
0.35 |
0.4 |
|
100 |
|
B6 |
Papillomavirus type 18 proteins E6 and E7 |
12.5 |
M20325 |
0.35 |
0.35 |
3.135 |
97 |
|
B39 |
Ribosomal protein L7 |
7.3 |
NM_000971 |
0.42 |
0.45 |
0.838 |
100 |
|
B47 |
c-myc oncogene containing coxⅢ sequence |
13.6 |
X54629 |
0.54 |
0.6 |
1.941 |
98 |
|
C11 |
Thymosin beta-4 |
13.8 |
M17733 |
0.25 |
0.202 |
0.625 |
100 |
|
C14 |
TPT1 |
2.5 |
NM_003295 |
0.5 |
0.47 |
0.83 |
99 |
|
C26 |
Ran_GTP binding protein 5 |
22.4 |
Y08890 |
0.8 |
0.78 |
4.826 |
96 |
|
D8 |
CCT3 |
33.5 |
XM_044127 |
0.45 |
0.42 |
2.08 |
100 |
|
D16 |
NIMA-related kinase 4 |
15.5 |
NM_003157 |
0.6 |
0.35 |
3.698 |
96 |
|
D22 |
Unknow |
18.2 |
|
|
|
|
|
|
D44 |
Mitochondrion protein COX2 |
40.5 |
AF382012 |
0.3 |
0.293 |
16.569 |
100 |
|
E12 |
EST |
7.1 |
AL049610 |
0.8 |
0.5 |
|
100 |
|
E13 |
Mitochondrion protein ND1 |
42.9 |
AF382013 |
0.35 |
0.3 |
16.567 |
99 |
|
E33 |
mRNA expressed only in placental villi |
4.5 |
AB019568 |
0.9 |
0.8 |
1.028 |
95 |
|
F18 |
Heat shock 70 kD protein 8 |
31.8 |
XM_165584 |
0.6 |
0.58 |
2.005 |
100 |
|
F42 |
Ferritin, heavy polypeptide 1 |
4.5 |
BC001399 |
0.7 |
0.65 |
0.88 |
98 |
|
F48 |
Carnitine/acylcarnitine translocase |
5.4 |
BC001689 |
0.5 |
0.35 |
1.781 |
95 |
|
F49 |
DEAD/H box polypeptide 3 |
29.1 |
XM_018021 |
0.6 |
0.3 |
3.396 |
100 |
|
G47 |
VAP-C |
7.6 |
AF086629 |
0.5 |
0.45 |
1.833 |
99 |
|
G54 |
EST |
12.3 |
BQ310571 |
0.25 |
0.2 |
0.239 |
99 |
|
H29 |
KIAA0863 protein |
31.1 |
AK023032 |
0.4 |
0.45 |
4.313 |
96 |
|
I25 |
Prosaposin PSAP |
6.9 |
XM_045140 |
0.35 |
0.35 |
2.746 |
99 |
|
J30 |
Myosin, light polypeptide 6, alkali |
6.4 |
NM_079423 |
0.55 |
0.53 |
0.651 |
100 |
|
J71 |
Thymosin, beta 10 |
3.9 |
BC016731 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
97 |
|
K22 |
Similar to Y box protein 1 |
12.3 |
BC010430 |
0.6 |
0.6 |
1.554 |
99 |
|
K23 |
Annexin A2 |
9.2 |
BC016774 |
0.46 |
0.46 |
1.404 |
100 |
|
K43 |
Glioblastoma amplified secreted protein |
27.2 |
AF395824 |
0.6 |
0.56 |
2.721 |
99 |
|
K59 |
Mitochondrion protein ND4 |
19.8 |
AF381990 |
0.38 |
0.38 |
16.569 |
99 |
|
L2 |
Uncharacterized hematopoietic stem/progenitor cells protein |
26.6 |
NM_018464 |
0.3 |
0.3 |
0.634 |
99 |
|
L5 |
EST |