生理学报Acta Physiologica Sinica, June 25, 2003, 55(3): 339

生理学报Acta Physiologica Sinica, June 25, 2003, 55(3): 339－348

研究论文

电刺激大鼠右后背海马诱导前背海马神经网络癫痫样电活动

王文挺1, 韩丹1,*, 邹祖玉2 ,曾俊2

武汉大学医学院 1生理学系、2病理学与病理生理学系, 武汉 430071

摘要: 本文旨在探讨单侧海马(hippocampus, HPC)内神经网络与HPC癫痫发生的关系及其细胞机制。实验在45只Sprague-Dawley大鼠上完成。急性强直电刺激大鼠右侧后背HPC CA1基树突区(acute tetanization of the posterior dorsal hippocampus, ATPDH; 60 Hz, 2 s , 0.4－0.6 mA)诱发HPC癫痫模型, 同步记录同侧前背HPC CA1顶树突区单位放电和基树突区深部电图。结果, ATPDH可以沿长轴向前1.8 mm处对前背HPC神经网络产生下述效应: (1)同步或非同步原发性单位与深部电图后放电, 在同步性后放电锁时(time-lock)关系明显。非同步性后放电的深部电图癫痫样电活动具有宽频带特征(5－90 Hz); (2)原发性单位后放-后抑制效应可以引发低频原发性电图后放电, 长时程爆发式单位放电可以诱发高频原发性电图后放电; (3)短束原发性电图后放电也可以诱发原发性单位后放电; (4)原发性电图后放电和神经元单位放电的抑制效应具有明显可塑性特征。以上结果提示, 重复施加ATPDH可以引起前背HPC癫痫相关性病理生理性神经网络的重建; 而单个神经元与神经网络的异常电活动之间具有明显的互动作用和突触传递可塑性特征; 沿HPC长轴内在抑制性通路的过度活动也可以诱发电图癫痫样电活动, 导致HPC网络癫痫的发生。

关键词: 深部电图; 单位放电; 神经网络; 强直电刺激; 海马; 癫痫

中图分类号: Q424; R742.1

Epileptiform activity of the anterior dorsal hippocampal network induced by acute tetanization of the right posterior dorsal hippocampus of the rat

WANG Wen-Ting1, HAN Dan1，*, ZOU Zu-Yu2, ZENG Jun2

Departments of 1Physiology, 2Pathology and Pathophysiology, Medical College, Wuhan University, Wuhan 430071

Abstract: The purpose of the present work was to study the role of unilateral hippocampal neural network in hippocampal epileptogenesis and its cellular mechanisms. Experiments were performed on 45 Sprague-Dawley adult rats. Acute tetanization (60 Hz, 2 s, 0.4－0.6 mA) of the right posterior dorsal hippocampus (ATPDH) was used to induce hippocampal epilepsy. The single unit discharges and the depth electrographs were synchronously recorded with a glass microelectrode and a pair of stainless concentric electrodes in the ipsilateral anterior dorsal hippocampus (HPC). The results demonstrated that: (1) some primary unit after-discharges were synchronized with electrographic after-discharges in the anterior dorsal HPC network after eight or nine tetanic trains were administered. Others desynchronized with 5－90 Hz primary depth electrographic after-discharges; (2) primary electrographic after-discharges were driven by primary unit after-discharges in the anterior dorsal HPC; (3) primary unit after-discharges were induced by brief primary electrographic after-discharges; and (4) plasticity of primary electrographic after-discharges and inhibition of single neuron firing were induced by repetitive ATPDH. The results suggest that hippocampal pathophysiologic network along the temporal-septal axis of the HPC is re-established by the repetitive ATPDH. There are plastic interactions between single neurons and its network during this re-establishment, which may be involved in the generation of “seizure oscillation”. Over-activation of an intrinsic inhibition of the HPC along its temporal-septal axis might be involved in hippocampal network epileptogenesis.

Key words: electroencephalography; single unit discharges; neural networks; tetanus; hippocampus;

epilepsy

海马(hippocampus, HPC)内的神经网络和神经元功能异常是HPC癫痫发生的重要因素。实验研究证实, HPC癫痫的发生涉及内在神经网络功能失衡与突触重构[1,2]。海马CA1区的0.5－4 Hz自发场电位节律性电振荡和CA3的癫痫样活动可以沿HPC长轴传播[3,4]。特定频率范围的电刺激可以改变HPC功能状态和治疗颞叶癫痫, 如亚急性电刺激前部HPC可以阻断顽固性颞叶癫痫的临床发作和减少发作间期尖波发放频率[5]。本室近期报道, 慢性强直电刺激右侧前背HPC可以从前向后引起距离植入电极1 mm左右的侧脑室区域核磁共振(magnetic resonance image, MRI)检测信号异常[6,7]。而Bragin等人的电生理研究证实, 与癫痫发作样电活动形成有关的高频电振荡在HPC局部神经网络的传布距离小于1 mm[8]。可见, 癫痫样电活动及MRI检测异常信号的产生可能涉及HPC内在神经网络异常, 尤其是沿长轴方向发生、发展和传播。值得研究的是, HPC长轴神经网络功能状态的改变是否与癫痫的发生或控制有关, 网络内在的癫痫电活动传播能否超过1 mm。本工作中, 急性强直电刺激大鼠右侧后背HPC CA1基树突区, 同步记录同侧前背HPC CA1基树突区深部电图和顶树突区神经元单位放电(前后距离约1.8 mm), 观察HPC内在神经网络沿长轴的功能变化以及前背HPC网络及其单个神经元在癫痫发生过程中的相互关系。

1 材料和方法

1.1 外科手术与电极

雄性Sprague-Dawley 大鼠45只(150－250 g), 在10%乌拉坦腹腔注射麻醉(1 g/kg)下行气管插管术。将动物固定在立体定向仪(SN-3, Narishige, Japan)上, 打开颅骨, 挑开硬脑膜, 用4%生理盐水琼脂封闭骨窗。根据《大鼠脑立体定位图谱》[9], 将两根不锈钢双极同芯电极尖端(阻抗0.2－0.3 MΩ)分别置于右侧前背HPC CA1基树突区(简称前背HPC, P: －3.0 mm, R: －2.5 mm, H: －3.0 mm)和右侧后背HPC CA1基树突区(简称后背HPC, P: －4.8 mm, R: －2.0 mm, H: －3.0 mm), 用于深部电图记录和进行电刺激。为了观察HPC抑制性网络与顶树突区神经元电活动之间的关系[10], 将玻璃微电极置于右前背HPC CA1顶树突区(P: －3.0 mm, R: －2.0 mm, H: －2.5至－3.0 mm)记录单位放电。玻璃微电极内充灌含有0.5 mol/L醋酸钠的2%滂胺天蓝溶液, 电极尖端直径约1 μm, 阻抗10－20 MΩ。动物用泮库溴胺(0.2 mg/kg, i.p., Pavulon, Netherlands Batch No.8039102)制动后进行人工呼吸, 体温维持在37℃左右。

1.2 记录与刺激

HPC神经元单位放电经微电极放大器(MEZ-7101 Nihon Kohden, Japan)输入到前置放大器(FZG-81, Shanghai)进行放大, 采用SBR-1型双线示波器和 SZF-1G型生物电主放大器进行监视和监听。为了观察深部电图的高频成分, 时间常数和高频滤波分别采用0.01 s和300 Hz, 将深部电图输入8道生理记录仪的AB-621G生物电放大器进行放大(RM-6008, Nihon Kohden, Japan)。单位放电和深部电图电位经双声道磁带录像机(VR-HD 1000 PHILIPS) 储存在录像带中。采用刺激器(SEN-7203, Nihon Kohden, Japan)经刺激隔离器(SS102J, Nihon Kohden, Japan)对大鼠右侧后背HPC CA1基树突区进行重复急性强直电刺激(acute tetanization of the posterior dorsal hippocampus, ATPDH; 60 Hz, 2 s , 0.4－0.6 mA)。为了避免脑组织在出现癫痫样电活动时对新的刺激产生不应期[11], 将刺激的间隔时间设为10 min, 共进行9－10串电刺激。

1.3 资料分析

存储在录像带上的双通道电生理资料经Neurolab信息采集与分析系统[12]进行后期同步采集与处理, 对生物电信号的形式、放电瞬间频率、原发性后放电潜伏期、时程进行测量与分析。获得的数据采用SAS软件进行统计学处理, 检测各项指标的差别是否具有显著的统计学意义, 运用Sigmaplot软件绘制统计图。

1.4 电极尖端的组织学鉴定

实验结束后用普鲁氏蓝法和滂胺天蓝法对不锈钢双极同芯电极和玻璃微电极尖端进行定位。用0.9% NaCl 100 ml和含1%亚铁氰化钾的4%甲醛溶液100 ml对动物进行左心室灌流后取脑。4℃下保存1周后进行石蜡包埋、切片和HE染色。光学显微镜下鉴定电极尖端的位置, 符合定位要求的实验资料用作统计学处理(图1)。

图1.组织学鉴定电极尖端的位置(HE染色, ×40)

Fig. 1.Positions of the electrode tips exhibited in HE-stained slices.R, right side.

2结果

前背HPC深部电图的自发活动主要为15－20 Hz节律性生物电振荡, 偶见少量尖波, 与本室近期报道的实验结果吻合[13], 单位自发放电形式主要包括紧张式放电、爆发式放电和复合放电。施加ATPDH前后, 同步观察同侧前背HPC深部电图和单位放电。

2.1 原发性HPC网络后放电及其细胞机制

分析前背HPC原发性深部电图和单位后放电的形式、潜伏期和频率特征发现, 前背HPC网络与该网络中单个神经元的癫痫相关性电活动可表现为同步或非同步原发性后放电。

2.1.1 同步原发性HPC网络和单位后放电

施加ATPDH 8－9串后, 从30对同步记录中观察到3对出现了HPC深部电图与单位放电的同步原发性后放电(平均串次为8.67), 在相位、时间和波形等方面均表现出高度的对应关系(图2)。

图2A是其中的一个例子, 施加8串ATPDH后未见完全同步的原发性电图与单位后放电。第9串刺激前, 单个前背HPC神经元呈现具有一定频率特征的单位放电。施加ATPDH之后, 前背HPC深部电图和单个神经元出现完全同步的原发性后放电, 其潜伏期约0.5 s。后放电形式表现为, 紧张式放电转变为双脉冲束(doublets)。前背HPC深部电图呈现完全同步, 具有明显锁时(time-lock)关系的双尖波样发作向阵挛性发作(clonic seizures)过渡。单位放电与深部电图的原发性后放电持续18.2 s后进入较长的静息期(silence period),符合网络癫痫的发作特征。这是大脑半球内HPC网络与单个神经元高度同步的癫痫电活动形式。

图2B显示了另一个实例。施加8串ATPDH后未见完全同步的原发性电图与单位后放电, 而第9串ATPDH诱导出单位放电与深部电图出现几乎完全同步的原发性后放电。与图2A不同, 第9串刺激前, 单个前背HPC神经元的活动几乎处于静止期, 深部电图具有散发的癫痫样电活动。施加ATPDH之后, 原发性单位后放电的潜伏期约为0.5 s, 而深部电图后放电潜伏期约0.2 s; 单位后放电形式为爆发式放电, 串内脉冲数递增, 深部电图呈现阵挛性癫痫样电活动(clonic seizures)。两者的潜伏期之差提示, 前背HPC神经网络异常活动可以引发同步原发性单位后放电, 持续23.7 s。另一方面, 图2A和B实验结果提示, 8－9个刺激串后, 前背HPC网络电活动的募集效应使单个HPC神经元出现与局部网络高度同步的原发后放电, 其发生不受单位放电背景电活动形式的影响。

图2. ATPDH诱发前背HPC同步原发性单位后放电和深部电图后放电

Fig. 2.Primary unit after-discharges synchronized with primary depth electrographic after-discharges in the anterior dorsal HPC network induced by repetitive ATPDH. A: Primary after-discharges of single unit are completely time-locked with those of depth electrographs after tetanization. Electrographic discharge pattern converted from tonic firing into clonic seizures while single unit discharge pattern transferred from singlets into doublets. B: Increased train length of single neuron bursting was in parallel with prolonged duration of clonic seizures of depth electrographs.

2.1.2 非同步原发性HPC局部网络和单位后放电

在HPC单位放电和深部电图同步记录中, 33.3% (10/30)对记录出现了非同步原发性后放电, 其中8对出现在第1个刺激串后, 2对出现在第6个刺激串后, 平均串次为2串。图3表明, ATPDH之后前背HPC单位放电与深部电图出现了非同步原发性后放电, 在潜伏期、波形、相位和持续时间等方面存在着很大的差异。

图3A所示的是单位放电“后放-后抑制”引发HPC局部网络低频原发性后放电。第4串刺激前前背HPC神经元表现为高频单位放电, 深部电图为16－23 Hz的生物电振荡。ATPDH后, 单位放电首先出现潜伏期0.5 s的短束原发性单位后放电, 随后表现为放电频率的抑制现象, 抑制时程为2.3 s; 深部电图的原发性阵挛样后放电和6－9 Hz尖波样后放电的潜伏期分别为0.8 s和5.1 s, 电图阵挛样后放电在单位后放电之后出现, 尖波样后放电在单位放电恢复高频放电之后出现。说明ATPDH对前背HPC单位放电短暂的频率抑制之后引发了局部神经网络6－9 Hz原发性后放电。

ATPDH可以引起前背HPC网络中单个神经元出现原发性后放电或长时程爆发式放电, 数秒钟后出现高频原发性网络后放电。如图3B所示: 刺激前, 单位放电频率较低, 施加ATPDH后首先出现原发性单位后放电, 随后出现原发性电图后放电, 潜伏期分别为3.3 s和4.1 s。原发性电图后放电为60－90 Hz的高频癫痫样电活动, 呈现2个高峰。

图3.ATPDH诱发前背HPC非同步原发性单位后放电和深部电图后放电

Fig. 3.Primary unit after-discharges desynchronized with primary depth electrographic after-discharges in the anterior dorsal HPC network induced by the ATPDH. A: Inhibitory firing rate of single unit discharges was followed by electrographic epileptiform discharges. B: Electrographic primary after-discharges at 60 Hz followed primary single unit discharges. C: Tonic firing of single neuron was modulated into bursting after the first ATPDH. D: Primary single unit after-discharges appeared when short electrographic after-discharges ceased.

如图3C所示, ATPDH调制前背HPC神经元单位放电成为爆发式放电, 伴有高频原发性电图后放电。这是一种长时程爆发式单位放电, 呈节律特征, 串间隔和串内脉冲数均相对固定, 伴有放电频率的下降。值得注意的是: 施加ATPDH后即刻出现短束原发性电图后放电, 19.1 s时出现90 Hz的高频原发性电图后放电, 持续时间约9 s。提示: ATPDH对前背HPC神经元单位放电长时程调制是形成高频原发性网络后放电的重要细胞机制之一。

反过来, 施加ATPDH后, 前背HPC网络癫痫样电活动也可以引起网络中单个神经元电活动异常。如图3D所示, 刺激前仅见少许单位放电。ATPDH后0.3 s时出现原发性电图后放电, 神经元表现为微弱的被动反应, 约4 s后出现单位后放电, 与电图后放电的潜伏期之差长达约7 s。提示这是一例由前背HPC局部神经网络癫痫样活动引发的原发性单位后放电。

2.2 ATPDH诱发前背HPC网络癫痫样电活动的可塑性特征

重复施加ATPDH后, 前背HPC原发性电图后放电和单位放电的抑制效应, 均表现出明显的可塑性特征。

2.2.1可塑的原发性电图后放电

在深部电图记录中, 53.3% (16/30)对出现原发性后放电。图4所示为其中的一例。施加第1串ATPDH时, 前背HPC的原发性电图后放电大体分为两种成分: 即潜伏期为0.4 s的初级阵挛样成分和潜伏期为1.7 s的次级尖波样发作成分。从施加第1到第8个刺激串之间, 随着串次的增加, 原发性后放电的潜伏期和脉冲数表现为明显的可塑性特征, 第9个刺激串后出现电图点燃样原发性后放电。初级阵挛样成分、次级尖波样后放电的串长和潜伏期分析表明, 次级尖波样后放电的串长和潜伏期之间呈负相关(图4B), 即潜伏期缩短时串长则延长(相关系数r=－0.7810, P<0.05)。这是一种ATPDH对前背HPC网络尖波样后放电的易化现象。

图4.ATPDH诱发前背HPC网络原发性后放电具有明显可塑性特征

Fig. 4.Plastic primary after-discharges of the anterior dorsal HPC network induced by the repetitive ATPDH. The early component of the primary electrographic after-discharges was at 3 Hz. There was a negative correlation between prolonged train duration and shortened latency of the late sharp waves after-discharges induced by nine tetani.

2.2.2 ATPDH对前背HPC神经元单位放电频率的可塑性抑制作用

重复施加ATPDH后, 观察到63.3% (19/30对) 记录对的前背HPC神经元单位放电频率出现明显抑制效应, 主要表现为以下两种形式: 对高频单位自发放电的抑制作用; 将单位自发放电调制成为节律性爆发式放电的同时伴有放电频率下降(见图3C)。

如图5所示, ATPDH后, 前背HPC神经元首先出现短束的原发性单位后放电, 随后出现后放后抑制。比较刺激前后15 s的单位放电平均瞬间频率, 6个ATPDH均可引起单位放电瞬间频率下降(P<0.01, T=7.097)。这些短束原发性后放电的脉冲个数和单位放电的后抑制时程的长短均表现出明显的可塑性特征。

图5.重复ATPDH对前背HPC神经元高频自发放电频率的可塑性抑制作用

Fig. 5.Inhibitory firing rate of single neuron induced by the repetitive ATPDH and characterized by synaptic transmission plasticity.

3 讨论

本研究的主要结果有: (1)ATPDH在同侧HPC中沿长轴向前1.8 mm处对前背HPC产生神经元与局部神经网络具有锁时特征的同步原发性后放电和非同步原发性后放电, 其中网络癫痫样电活动具有宽频带特征(5－90 Hz); (2)神经元单位放电“后放-后抑制”引发原发性低频网络后放电, 长时程爆发式单位放电引发原发性高频网络后放电; (3)短束原发性网络后放电诱导单个神经元原发性后放电; (4)原发性网络后放电和神经元单位放电的抑制效应具有可塑性特征。这些结果提示, 重复施加ATPDH可以沿长轴向前引起前背HPC局部癫痫相关性神经网络的重建; 在病理性神经网络重建过程中, 单个神经元与网络异常电活动之间具有明显的互动作用和突触传递可塑性特征; 沿长轴的HPC内抑制性神经网络的过度活动是诱发HPC网络癫痫发生的重要因素之一。

3.1 HPC内在的长轴网络与HPC癫痫

HPC是一个内在神经元之间存在着高度三维纤维联系的结构, 其广泛的树突分支接受了大面积的信息传入。HPC内在的兴奋性神经元和抑制性中间神经元组成了精密的神经网络, 并具有特定的结构基础, 抑制性网络与兴奋性网络之间的平衡是维持HPC功能正常的重要因素。如大鼠CA1锥体神经元胞体到距胞体200 μm处兴奋性树突棘数目逐渐增加, 而抑制性树突棘的数目逐渐减少[10]。群体峰电位在CA1基树突区和顶树突区可以由不同区域的兴奋传入引起, 并在树突之间广泛扩布[14]。有报道发现, CA3神经元的突起沿HPC长轴方向呈扇形分布到CA1神经元(包括近下托处)[15]。本工作观察到, 连续施加8－9串ATPDH时可激活前背海马CA1深部电图和单位放电的完全同步化原发性后放电(图2)。有可能通过化学突触和化学突触以外的细胞间连接逆向激活CA3神经元, 再由CA3的突起沿海马长轴扇形分布引起CA1群体神经元的高度同步化活动, 形成网络后放电, 最终导致癫痫的产生。

HPC长轴网络间的相互作用目前仍然不是十分清楚。人体功能性核磁成像检测发现短时记忆的编码功能与后HPC的神经网络活动有关[16]。沿长轴HPC神经元束的激活与大鼠空间学习记忆功能活动有关[16]。离体大鼠全HPC(不含齿状回)上证实, 将HPC与其它HPC外结构隔离后, CA1仍然保持0.5－4 Hz自发场电位节律性电振荡, 这种电振荡可以沿HPC长轴扩布[3]。亚急性电刺激前HPC可以阻止难治性颞叶癫痫的发生[5]。本室近期报道, 慢性强直电刺激右侧前背HPC CA1基树突区引起的MRI检测异常可以沿植入电极处向后扩布约1 mm左右[7]。本工作证实ATPDH可以沿长轴向前1.8 mm抑制前背HPC CA1顶树突区神经元单位放电的频率, 6串刺激后抑制持续时间较第1、2串缩短(图5), 这是一种重复刺激引起的抑制逐渐减弱的放电频率易化效应, 呈现明显的可塑性特征。分析同一细胞的单位放电与深部电图发现, 单位放电的抑制效应出现后约2 s表现为明显的原发性电图癫痫样电活动(图3A)。这种可塑的短时程单位放电抑制效应很可能是局部神经网络癫痫样电活动的诱发因素。沿长轴发生的HPC网络抑制活动可以诱导“兴奋-抑制”失衡, 最终形成HPC网络癫痫。重建的HPC长轴癫痫相关性功能网络可以向前波及1.8 mm。MRI检测发现, 强直电刺激大鼠右侧前背HPC引起的T2信号值异常可以向后波及1 mm左右[7], 而HPC内触发癫痫相关性神经网络形成的特征性电振荡范围不超过1 mm3[8]。

3.2 HPC网络癫痫电活动特征及其细胞机制

HPC癫痫发生过程中涉及到HPC内在神经网络和单个神经元电活动的异常。在离体HPC脑片上, 癫痫早期脑损伤区域附近产生的高频电振荡(250－600 Hz)可以在HPC内传播[8]。本室近期研究发现, 强直电刺激不仅可以诱发单个HPC神经元出现具有癫痫相关的特征性异常电活动[13], 还可以通过激活具有生物电振荡器特性的单个神经元启动群体神经元同步化癫痫样电活动[18]。这些实验结果提示了HPC局部神经网络与神经元的异常电活动参与了HPC癫痫的形成。前背HPC原发性电图和单位后放电的潜伏期表明, 前背HPC单位后放电可以引发60－90 Hz的高频电图后放电(图3B), 短束原发性深部电图后放电也可以诱导产生单个神经元的原发性后放电(图3D), 两者的潜伏期均为4 s左右。提示, 局部神经网络的高频癫痫样电活动可以由单个神经元的异常电活动引发; 反过来, 神经网络癫痫样电活动也可以引起单个神经元电活动的异常, 体现了单个细胞与局部网络之间癫痫相关电活动的互动作用。该现象揭示了HPC内癫痫相关性神经网络重建过程中的正反馈机制。施加8－9串ATPDH后, 前背HPC深部电图和单位放电出现了高度锁时的原发性后放电(图2), 显示了HPC局部网络突触活动的募集效应可以促使单个神经元异常电活动逐渐达到与网络癫痫样行为的高度同步, 体现了HPC癫痫发生的爆发性特征及其细胞和网络机制。

HPC癫痫的发生过程也是神经网络中突触传递可塑性异常的反应过程, 这种可塑性异常可以是结构和功能双重性的。海人藻酸诱发的大鼠癫痫模型中, CA1锥体神经元的轴突芽孢再生长增加, 伴有新的再生兴奋性环路形成[1]。人类颞叶癫痫和大鼠匹鲁卡品致痫模型中, CA1区神经元网络的再生组织与其锥体细胞异常侧突在锥体层和放射层投射有关[19]。提示, HPC局部神经网络的癫痫活动是以神经元之间突触结构性重构为基础的。我室近期研究证实, 癫痫发作行为的可塑性变化可能涉及HPC复杂神经网络多级突触传递长时程效应的整体靶行为表达[20]。本次工作发现, ATPDH可以诱导前背HPC出现单位放电的抑制性效应、频率调制作用、原发性后放电、以及原发性深部电图后放电等，并具有明显的突触传递可塑性特征。这种突触传递机制的可塑性异常与新的突触重构之间的关系值得认真探讨。然而, 在癫痫发生过程中, 神经元之间突触传递的可塑性变化很可能是促进HPC内在癫痫相关性神经网络的功能性重建的重要原因。这些重建的神经网络异常电活动可以沿HPC内甚至跨半球扩布, 最终诱导产生不易发现的继发性癫痫病灶[7, 21]。

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