生理学报Acta Physiologica Sinica, August

研究论文

三氯化铝对大鼠海马CA1区锥体细胞瞬间外向钾电流和延迟整流钾电流的影响

孟紫强*, 白伟

山西大学环境医学与毒理学研究所, 山西大学环境科学与工程研究中心, 太原 030006

摘要: 采用全细胞膜片钳技术, 研究了三氯化铝(AlCl3)对急性分离的大鼠海马CA1区神经元钾通道的影响。结果表明, AlCl3对钾电流有明显的抑制作用, 具有一定的浓度依赖性, 1000 μmol/L AlCl3可改变IA和IK激活曲线和失活曲线的Vh 和k值, 使钾电流激活曲线右移, 使失活曲线左移。这些结果表明AlCl3对大鼠海马CA1区神经元K+通道有抑制作用, 它可能是铝引起中枢神经系统损伤的机制之一。

关键词: 三氯化铝; 海马; 神经元; 膜片钳技术; 钾通道

中图分类号:Q426

Effects of AlCl3 on transient outward K+ current and delayed rectifier K+ current in actuely isolated rat hippocampal CA1 neurons

MENG Zi-Qiang*, BAI Wei

Department of Environmental Science and Toxicology, Shanxi University, Taiyuan 030006

Abstract: The effects of aluminum chloride (AlCl3) on the transient outward potassium and delayed rectifier K+ current in hippocampal CA1 neurons of rats were studied by the whole-cell patch clamp technique. It was found that AlCl3 reduced the transient outward potassium current and delayed rectifier K+ current in a dose-dependent manner. 1000 μmol/L AlCl3 resulted in change in voltage and slope of the half-activation and the half-inactivation of IA and IK. These results imply that AlCl3 may damage potassium channel of the hippocampal CA1 neurons from rats and this may be related to the mechanism of the damage to the central nervous system by aluminum.

Key words: aluminum chloride; hippocampus; neurons; patch clamp techniques; potassium channel

随着铝工业的发展, 铝制品和含铝化合物的广泛应用, 生活和自然环境中铝的含量日益增高。由此引起的健康问题越来越引起人们的关注。有报道表明, 铝能促进淀粉样蛋白的形成和积累, 从而在老年痴呆症(AD)的致病过程中发挥作用[1－3]。也有文献对铝引起的海马组织病变进行了报道, 表明铝可以使细胞死亡率明显增加, 降低Mg2+-ATPase等酶活性[4, 5]。另外, 也有报道表明, 三氯化铝(AlCl3)还对发育的胚胎具有毒性[6]。但是, 铝对海马神经元离子通道的研究却鲜有报道, 本实验研究了AlCl3对大鼠海马CA1区神经元K+通道的影响, 以探讨铝的神经毒作用机制。

1 材料和方法

1.1 试剂和试液

Protease、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、已二醇-双(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)、Na2ATP均为Sigma公司产品, 其余试剂为国产分析纯试剂。孵育液(mmol/L): NaCl 124、KCl 5、KH2PO4 1.2、MgSO4 1.3、CaCl2 2.4、葡萄糖 10、NaHCO3 26, pH 7.4; 标准细胞外液(mmol/L): NaCl 150、KCl 5、MgCl2 1.1、CaCl2 2.4、HEPES 10、葡萄糖 10, pH 7.4, 记录前在上述标准外液中加入CdCl2 0.2 mmol/L; 电极内液(mmol/L):KCl 65、 KOH 5、 NaF 80、MgCl2 2、 HEPES 10、EGTA 2.5、Na2ATP 2, pH 7.5。

1.2 大鼠海马CA1区神经元的急性分离

根据本实验室建立的急性分离大鼠海马CA1区神经元的方法进行[7]。 简要叙述如下:用Wistar大鼠, 鼠龄7 d, 雌雄不限。大鼠断头取脑, 置于0－4℃孵育液中取出海马, 手工切成500 μm厚的脑片, 分出CA1区, 置于32℃孵育液中, 连续通以5% CO2+95% O2 混合气, 孵育30 min。然后加入胰蛋白酶, 使其终浓度为0.5 mg/ml, 32℃下消化35 min。消化完毕用孵育液洗脑片3次, 移入盛有氧饱和标准细胞外液的离心管内, 用Pasteur吸管轻轻吹打, 制成单细胞悬液, 静置约5 min, 取上部细胞悬液, 加入盛有氧饱和标准细胞外液的培养皿内, 约15 min 后行细胞贴壁, 即可进行全细胞膜片钳记录。

1.3 全细胞膜片钳记录

记录电极由玻璃微电极经PP-830型微电极拉制仪(Narrishage, Japan )拉制, 尖端直径为1－2 μm, 充灌电极内液后阻抗为8－10 MΩ, 记录在20－24℃的室温下进行, 试验用Axopatch 200B膜片钳放大器(Axon Instrument, USA)进行全细胞膜片钳记录。当电极尖端与细胞膜之间形成高阻抗封接(大于5 GΩ)后, 负压破膜, 使电极内液与细胞内液相通, 即形成全细胞状态。电流信号经2 kHz滤波及Digidata 1200型A/D、D/A转换器进行数模转换后存于硬盘, 采样频率1.67 kHz。保持电位及钳制测试脉冲程序的设定、信号采集与存储均借助微机运行Pclamp 6.0.4软件(Axon Instrument, USA)完成。

1. 4 数据分析

试验结果用mean±SD表示, 数据的分析和处理采用Pclamp Clamfit程序(Axon Instrument)和Origin 5.0软件(Microcal software, USA)完成, 给药前后差异的显著性用t 检验进行分析。

2 结果

2.1 大鼠海马CA1区神经元外向K+电流的分离

利用Pclamp 6.0.4软件记录分离K+电流。在电压钳模式下将保持电压置于－100 mV, 给予－100 mV到+90 mV的阶梯去极化脉冲刺激, 步幅10 mV, 刺激波宽160 ms, 刺激频率0.5 Hz, 记录得到的电流(图1A)。激活的外向K+电流包括两种成分[8], 即快速激活与失活的瞬时外向K+电流IA(对4-AP 敏感, n=8)和缓慢激活几乎不失活的延迟整流K+电流IK (对TEA敏感, n=8)。在本实验中, IA用电流峰值来计算, IK用158 ms处的电流值来计算[9, 10]。

图1.AlCl3对钾电流的影响

Fig. 1.Effect of AlCl3 on K+ current.

A． Current traces obtained by 160 ms depolarizing pulses from －100 mV to +90 mV in 10 mV

steps.

B． Time curve of the effect of 1000 μmol/L AlCl3 on K+ current (mean±SD, n=10).

C,D． Dose-response curve for the effect of AlCl3 on K+ current (IA and IK).

2.2 不同浓度AlCl3对钾电流的影响

由2.1所述方法获得电流, 然后向培养皿中定量加入AlCl3溶液, 使其终浓度为1000 μmol/L, 加药后不同时间分别记录IA电流, 得到加药后的时间过程图(图1B)。由图1B可看出给药后记录到的IA随时间的延长而减小, 10 min后药物的作用达到最大。

向培养皿中定量加入AlCl3溶液, 使其终浓度分别为1、 10、 100、 1000 μmol/L。给药后10 min 再次记录上述外向电流, 观察AlCl3对IA和IK电流 I-V的影响(图1C, D)。由图1C, D可看出随AlCl3浓度的增加, I-V曲线显著降低, 呈一定的浓度依赖性。

2.3 AlCl3对钾电流激活和失活动力学的影响

2.3.1 AlCl3对IA和IK 激活动力学的影响

用2.1所述方法获得电流, 然后向培养皿中定量加入AlCl3溶液, 使其终浓度为1000 μmol/L, 给药后10 min 再次记录上述外向电流。利用公式G=I/(V－VK)将IA和IK的电流值转换为电导值, 其中G为电导, V为膜电位, VK为翻转电位。以电导值与最大电导值的比值(G/Gmax)对应膜电位分别绘制出给药前后IA和IK 的激活曲线。所得曲线可以用Boltzman方程G/Gmax=1/{1+exp[(V－Vh)]/k}进行拟合, 式中G为电导, V为膜电位, Vh为半数激活电压, k为斜率因子(图2)。由图2可以看出, 两者的激活曲线均呈S形, 并由此计算出给药前后IA的Vh分别为8.12±1.27和22.03±2.68 mV (n=10, P<0.01), k值分别为－23.76±5.28和－25.33±4.16 mV (n=10, P>0.05); 给药前后IK的Vh分别为16.55±3.28和29.76±1.16 mV (n=10, P<0.01), k分别为－20.15±3.47和－19.83±4.26 (n=10,P>0.05)。这说明, 1000 μmol/L的AlCl3可使IA和IK的激活曲线显著右移, 但不改变其斜率因子。

图2.1000 μmol/LAlCl3对IA和IK 激活动力学的影响

Fig. 2.Effect of 1000 μmol/L AlCl3 on the kinetics of steady-state activation of transient outward K+ current and delayed rectifier K+ current.

2.3.2 AlCl3对IA 失活动力学的影响

置保持电位于－100 mV, 先给予－120至－20 mV, 步幅10 mV, 刺激波宽80 ms的阶梯钳制预脉冲刺激, 然后再给予至+50 mV的测试脉冲刺激, 刺激波宽120 ms, 刺激频率0.5 Hz, 记录得到的电流图形。然后向培养皿中定量加入AlCl3溶液, 使其终浓度为1000 μmol/L, 给药后10 min 再次记录上述外向电流。以电流峰值与最大电流峰值的比值(I/Imax)对应预脉冲刺激电压, 分别绘制出给药前后IA的失活曲线。所得曲线可以用Boltzman方程I/Imax=1/{1+exp[(V－Vh)]/k}进行拟合, 式中I为电流, V为膜电位, Vh为半数失活电压, k为斜率因子(图3)。由图3中可以看出, 两者的失活曲线均呈S形, 并由此计算出给药前后IA的Vh为－52.87±1.92和－60.50±1.36 mV (n=10, P<0.01), k值分别为11.63±1.78和14.24±1.51 mV (n=10, P>0.05), 这说明AlCl3可使IA失活曲线明显左移, 但不改变其斜率因子。

图3. 1000 μmol/L AlCl3对IA 失活动力学的影响

Fig. 3.Effect of 1000 μmol/L AlCl3 on the kinetics of steady-state inactivation of delayed rectifier K+ current (mean±SD, n=10).

3 讨论

近年来, 在铝引起神经系统疾病的研究方面取得了很大的进展。文献指出铝可以穿过血-脑屏障进入并蓄积在脑组织中, 且可以增加血-脑屏障的通透性, 改变生物膜的转运方式[11]。最近的研究资料表

明[12], 在老年痴呆症患者的脑组织神经纤维缠结和老年斑中, 铝含量可达0.5－3.0 mmol/L。

因此, 研究铝的毒理作用具有很重要的意义。

本实验采用全细胞膜片钳技术观察了铝化合物对大鼠海马神经元CA1区锥体细胞的IA和IK 电流的影响, 结果表明AlCl3对IA和IK均有明显的抑制作用, 且呈浓度依赖性, 同时可使钾电流激活曲线右移, 使失活曲线左移。当钾电流被阻断时, 海马神经元持续处于发放冲动状态, 通常持续去极化只能使海马神经元发放冲动1次动作电位。Al3+对IA和IK 的抑制作用使动作电位发放延长, 引起兴奋, 于是CA1神经元表现持续发放动作电位。由此可见, 铝可以部分地阻断电压门控性外向钾通道, 使其随电压改变而启闭的功能减弱, 从而引起海马神经细胞膜功能发生改变。

Deleers认为, 在生理条件下, 20－50 μmol/L的铝就可以取代胞膜上几乎所有的二价阳离子, 使进入细胞的铝增加, 并阻碍二价阳离子进入细胞, 100 μmol/L的铝可以使细胞膜带负电的磷脂双分子层分离解聚[13]。电压门控性钙离子通道可被50 μmol/L的铝阻断45%, 1 mmol/L时完全阻断[14]。由此可见, 铝使进入细胞内的钙离子减少, 使膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性受到抑制和功能改变, 导致海马神经元的损伤。

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