生理学报Acta Physiologica Sinica, August
研究论文
ERK在17β-雌二醇抑制大鼠血管损伤后平滑肌细胞增殖中的作用
王庭槐*, 谈智, 付晓东, 杨丹, 胡飞雪, 李永勇
中山大学中山医学院生理教研室, 广州 510080
摘要: 本实验旨在研究细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)在17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)介导的一氧化氮(nitric oxide, NO)抑制血管损伤后平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖中的作用。在去势雌性大鼠中建立颈总动脉球囊损伤模型, 实验分单纯去势组(OVX)、去势给予E2治疗组(E2+OVX)、 去势后球囊损伤组(OVX+Inj)和去势后球囊损伤给予E2治疗组(E2+OVX+Inj)。分别检测各组血管壁的厚度、血浆中NO的浓度、ERK蛋白表达和活性的变化以及eNOS蛋白表达情况。结果显示, 与OVX组相比, OVX+Inj组血浆NO含量明显下降和血管壁厚度明显增厚, E2可增加血浆中NO含量和抑制球囊损伤后血管壁的增厚; E2可以抑制ERK蛋白表达和活化, 诱导eNOS蛋白的表达。 血浆中NO含量与eNOS蛋白的表达呈正相关, 与血管壁厚度和ERK蛋白表达呈负相关。 以上结果提示, E2可通过增加血管组织eNOS蛋白表达, 促进NO生成, 抑制ERK蛋白的表达和活性, 从而抑制血管损伤后 VSMC的增殖。
关键词: 细胞外信号调节激酶; 17β-雌二醇; 一氧化氮; 血管平滑肌细胞
中图分类号: Q463; R331.36
Effect of ERK on
17β-estradiol-induced inhibition
of VSMC proliferation in rats
after vascular injury
WANG Ting-Huai*, TAN Zhi, FU Xiao-Dong, YANG Dan, HU Fei-Xue, LI Yong-Yong
Department of Physiology, Zhongshan Medical College of Sun Yat-Sen University,
Guangzhou 510080
Abstract: The aim of the present study was to investigate the effect of ERK on 17β-estradiol (E2)inhibition of vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation in rats after vascular injury. Common carotid artery balloon-injury (Inj) model was established in ovariectomized rats (OVX). Female SD rats were randomly divided into 4 groups: OVX, E2+OVX, OVX+Inj, and E2+OVX+Inj groups. The thickness of the vessels, the plasma content of NO, and the expression of ERK, phosphorylated ERK as well as eNOS protein were measured. The results showed that compared with OVX, the vessel wall was significantly thickened and the plasma content of NO was significantly decreased in OVX+Inj group. E2 significantly decreased the vessel thickness but increased the plasma NO content after balloon injury. E2 inhibited the expression of ERK, phosphorylated ERK and induced the eNOS expression. There is a positive correlation between plasma NO content and eNOS protein expression, while there is a negative correlation between plasma NO content and the thickness of vessel. The plasma NO content and the expression of ERK protein were negatively correlated. These results suggest that E2 increases the vascular eNOS protein expression and NO release, leading to the inhibition of VSMC proliferation after balloon injury by inhibiting the ERK and phosphorylated ERK protein expression.
Key words: extracellular signal-regulated kinase; 17β-estradiol; nitric oxide; vascular smooth muscle cells
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的迁移、 过度增殖以及大量的细胞外基质合成是导致血管腔狭窄的主要原因, 也是目前血管生物学研究的重点领域。虽然不同的生长因子促进 VSMC增殖的机制各不相同, 但是它们大多都通过ERK共同途径发挥作用。ERK是把细胞外信号转导到核内调控基因表达的重要细胞内信号分子, 是不同促增殖因子调控的共同通路[1]。近年来许多研究表明E2具有血管保护作用, 且与其诱导的NO生成有关[2]。但这种作用是否与E2抑制ERK信号途径有关目前还不清楚。在血管损伤整体模型中, E2是否通过增加NO表达下调ERK的表达, 从而抑制血管损伤反应, 尚未见有关报道。因此我们在去势雌性大鼠加球囊损伤术的基础上, 补充外源性E2, 来观察E2影响血管损伤反应过程中NO和ERK蛋白表达变化, 以阐明E2抑制血管损伤反应的信号机制。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
雌性SD大鼠(250－300 g), 由中山医学院动物中心提供; 17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)、兔抗鼠ERK多克隆抗体、小鼠抗大鼠磷酸化ERK单克隆抗体、兔抗鼠eNOS单克隆抗体、 Leupeptin、apoprotinin、PMSF均购自Sigma公司; Nitrite/Nitrate Farbtest 试剂盒由Boehringer Mannheim公司提供; ECL试剂盒购自基因公司; 小鼠抗人和动物的平滑肌α-actin多克隆抗体、免疫组化试剂盒均为博仕德公司产品, 其它试剂均为国产分析纯。
1.2 大鼠去势和血管球囊损伤模型制备
3%戊巴比妥钠1 ml/kg腹腔注射麻醉, 在无菌条件下, 耻骨联合上约1 cm沿腹正中线作切口, 暴露腹腔。在膀胱后侧找到双侧输尿管和卵巢, 结扎后切除双侧卵巢, 分层缝合关闭腹腔, 术后肌注青霉素。10 d后再行球囊损伤术。同样麻醉后, 股静脉注射肝素(500 IU), 作颈部正中切口, 分离右侧颈外动脉和颈总动脉, 从颈外动脉插入2F球囊导管至胸主动脉上端, 注入肝素生理盐水后回拉球囊导管至颈外动脉, 反复6次, 拔出导管, 结扎颈外动脉, 分层缝合, 术后肌注青霉素。单纯去势组(OVX)动物只分离动脉, 不作插管。所有动物饮自来水, 标准饮食。 将动物分为4组, 每组6只, 第1组为OVX, 第2组为去势给予E2治疗组(E2+OVX), 第3组为去势后球囊损伤组(OVX+Inj), 第4组为去势后球囊损伤给予E2治疗组(E2+OVX+Inj)。E2剂量为每天20 μg/kg, 皮下注射, 4周后处死动物, 取右侧颈总动脉标本, 10% 甲醛固定, 石蜡切片, 平滑肌α-actin SABC免疫组化染色。
1.3 血浆NO的测定
用Nitrite/Nitrate Farbtest 试剂盒, 比色法测定血中的硝酸盐总量。取颈动脉血2 ml, 4℃, 3000 r/min离心20 min, 取上清液500 μl样品加入250 μl NADPH和200 μl硝酸还原酶, 室温下孵育30 min, 加入对氨基苯磺酰胺和萘乙二胺显色15 min, 以紫外分光光度计546 nm波长测定吸光度, 再根据标准曲线换算成硝酸盐浓度。
1.4 免疫印迹法检测蛋白表达
余下的血管组织在冰浴下研碎后加入1.0 ml蛋白提取液, 匀浆后4℃离心, 13000 r/min, 10 min, 取上清液, 按Bradford法测量蛋白浓度, 调蛋白质浓度至200 mg/L, 进行SDS-PAGE电泳, 用电印迹转移法将凝胶内的蛋白质转至硝酸纤维素膜上, 分别与一抗兔抗大鼠ERK多克隆抗体(稀释度为1∶10000)、兔抗大鼠eNOS单克隆抗体(稀释度为1∶4000)和小鼠抗大鼠ERK磷酸化单克隆抗体(稀释度为1∶5000), 4℃孵育过夜, 与二抗HRP标记的羊抗兔IgG抗体及羊抗小鼠IgG抗体(稀释度为1∶2000)室温孵育1 h, 与ECL试剂反应1 min, X光胶片压片曝光10 s－1 min, 以IBAS图像处理系统对胶片进行扫描测定感光区带的感光密度, 并进行积分处理, 以对照组为100%进行统计分析作图。
1. 5统计学处理t检验和单因素方差分析, 数据以mean±SD表示, 以P<0.05作为差异有显著性意义界限。
2 结果
2.1 E2对去势大鼠球囊损伤血管平滑肌特异性α-actin的表达的影响
在400×光镜下观察到, 棕黄色阳性信号主要位于血管中膜。计算机图像分析显示, 以OVX组的阳性指数(PI)为100%, E2+OVX组的阳性指数下降了 (16.1±6.7)%, 而 OVX+Inj组的阳性增加了(84±12.7) % (n=6, P<0.05), 与OVX+Inj组相比, E2+OVX+Inj组的阳性指数明显下降(n=6, P<0.05) (图1)。
图1.E2对球囊损伤后大鼠颈总动脉α-actin蛋白表达的影响
Fig. 1.Effect of 17β-estradiol on expression of α-actin in common carotid arteries of balloon injured ovariectomized rats. n=6,
*P<0.05 vs OVX,
#P<0.05 vs OVX+Inj (arrowheads indicate the immnohistochemical staining of α-actin.
Scale bar: 50 μm).
2.2 各组血浆中NO的含量
OVX组血浆中的NO为27.4 ±5.6 μmol/L, 使用E2替代后, E2+OVX组血浆中的NO水平明显升高到45.4 ±7.9 μmol/L (n=6, P<0.05, vs OVX)。在去势基础上进行球囊损伤, OVX+Inj组血浆中的NO含量明显下降为13.4 ±3.65 μmol/L(n=6, P<0.05 vs OVX),而使用激素替代疗法后, E2+OVX+Inj组中的NO含量明显增加到36.7 ±6.3 μmol/L (n=6, P<0.05, vs OVX+Inj)(图2)。相关分析结果显示, 各组血浆中NO的含量与血管平滑肌中膜厚度的r为－0.842(P<0.05)。
图2.E2对不同组血浆NO含量的影响
Fig. 2.Effect of 17β-estradiol on plasma NO content in different groups. n=6,
*P<0.05 vs OVX,
#P<0.05 vs OVX+Inj.
2.3 E2对大鼠球囊损伤颈总动脉的ERK蛋白表达的影响
以OVX组ERK蛋白表达为100%, E2+OVX组颈总动脉的ERK蛋白表达下降了(24±7.2)% (n=5, P<0.05), OVX+Inj组颈总动脉的ERK蛋白表达增加了(164±32.2)%(n=5, P<0.05); 而E2+OVX+Inj组颈总动脉的ERK蛋白表达则明显下降, 与OVX+Inj组相比有显著差异(n=5, P<0.05, 图3)。相关分析结果显示, 各组血浆中NO的含量与颈总动脉的ERK蛋白表达的r为－0.77(P<0.05)。
图3.E2对不同组血管ERK蛋白表达的影响
Fig. 3.Effect of 17β-estradiol on ERK protein expression in common carotid arteries of different groups. n=5,
*P<0.05 vs OVX,
#P<0.05 vs OVX+Inj.
2.4 E2对大鼠球囊损伤颈总动脉的ERK活性的影响
用磷酸化ERK蛋白的表达量的变化表示ERK活性的变化。以OVX组磷酸化ERK蛋白表达为100%, E2+OVX组颈总动脉的ERK活性明显下降了(63.4±13.2)% (n=5, P<0.05); OVX+Inj组颈总动脉的ERK活性明显增加了(129.3±27)% (n=5, P<0.05); 与OVX+Inj组相比, E2+OVX+Inj组颈总动脉的ERK活性明显下降了(156.1±21)% (n=5, P<0.05)(图4)。
图4.E2对各组血管ERK蛋白活性的影响
Fig. 4.Effect of 17β-estradiol on phosphorylated ERK protein expression in common carotid arteries of different groups. n=5,
*P<0.05 vs OVX,
#P<0.05 vs OVX+Inj.
2.5 E2对大鼠球囊损伤颈总动脉的eNOS蛋白表达的影响
以OVX组eNOS蛋白表达为100%, E2+OVX组颈总动脉的eNOS蛋白表达增加了(118.6±21.8)% (n=5, P<0.05); OVX+Inj组颈总动脉的eNOS蛋白表达减少了(23.7±15.6)% (n=5, P<0.05); 与OVX+Inj组相比, E2+OVX+Inj组颈总动脉的eNOS蛋白表达增加了(106±28)%(n=5, P<0.05)(图5)。相关分析结果显示, 各组血浆中NO的含量与颈总动脉的ERK蛋白表达的r为0.962 (P<0.05)。
图5.E2对各组血管eNOS蛋白表达的影响
Fig. 5.Effect of 17β-estradiol on eNOS protein expression in common carotid arteries of different groups. n=5,
*P<0.05 vs OVX,
#P<0.05 vs OVX+Inj.
3 讨论
我们用免疫组化检测各组 VSMC特异性 α-actin的表达, 观察到OVX组α-actin的表达主要位于血管中膜。在本实验中未见新生内膜的形成, 可能与实验所用的动物有关。大鼠内膜细胞很少[3,4], 不易对损伤发生反应, 很难引起内膜增生[5]。球囊损伤后, 血管壁增厚, α-actin表达的阳性指数明显增加, 提示引起血管增厚的主要原因是 VSMC增殖。补充E2后, 可明显减少血管壁的增厚, α-actin的表达下降。说明E2可通过抑制 VSMC的增殖从而抑制球囊损伤所致的血管壁的增厚。因此, 我们推测, 去势促进血管 VSMC增生, 导致血管壁增厚。E2则通过抑制 VSMC增殖, 从而抑制血管壁的增厚, 发挥对血管损伤的保护作用。由此可见, E2能明显抑制血管损伤反应, 其主要的细胞机制是抑制 VSMC增殖。Stephen 等在大鼠血管损伤模型上观察到与我们相似的结果[7]。E2通过什么机制来抑制血管损伤模型中 VSMC的增殖呢？目前认为, VSMC增殖与多种细胞因子有关, ERK在其中起着重要的作用。ERK把细胞外信号转导到核内, 调控基因表达的重要细胞内信号分子, 是不同促增殖因子调控早期生长反应基因表达的共同通路。 因此, 我们认为E2抑制 VSMC与ERK有关。同时国内外研究和我室的工作表明, E2的许多作用与NO有关, 因此我们推测, NO在E2抑制血管损伤反应中, 可能参与对ERK的作用。
我们在血管损伤模型上用免疫印迹法检测了损伤血管组织ERK蛋白表达和活性的变化。发现血管损伤导致损伤部位的ERK蛋白表达和活性增加, 去势促进血管损伤引起的损伤部位ERK蛋白表达和活性增高, 而E2对去势后血管损伤引起的损伤部位ERK蛋白表达和活性增高有明显的抑制作用, 提示E2抑制血管损伤反应可能与抑制ERK信号途径有关。有研究表明ERK的活化是球囊损伤后血管再狭窄的关键因素之一[7]。血管损伤后多种生长因子的产生增加, 导致血管损伤部位的ERK蛋白表达和活性增高, 从而促进 VSMC增殖。我室通过体外实验观察到E2抑制ET-1和血浆诱导的 VSMC增殖[8], 有研究报道E2还能抑制PDGF诱导的 VSMC增殖[9], 由于ET-1和PDGF的上游信号途径不同, ERK是两条途径的信号交汇点, 提示E2的作用位点可能在ERK共同通道上, 即E2通过抑制生长因子诱导的ERK活性增高, 从而抑制 VSMC增殖, 抑制球囊损伤引起的血管壁的增厚。
研究表明, E2可通过eNOS和iNOS来调节NO的生成发挥其血管保护作用。在血管损伤模型中, 已有大量的研究表明iNOS在其中起重要作用。Yan等证明[10], 在血管球囊损伤的大鼠模型中, 血管壁上iNOS的表达增加, 能抑制血小板的黏附; Shears等研究表明[11], 将iNOS基因转入大鼠血管中能抑制损伤后血管壁的增厚; 在去势大鼠模型上, Binko J等研究表明, E2可以通过增加iNOS蛋白表达来减弱去内皮主动脉环对苯福林的收缩[12]; 而Tolbert等在iNOS缺失的转基因鼠上进行血管损伤模型研究表明, E2的血管保护作用依然存在[13]。提示我们在血管损伤模型中, 除iNOS外, eNOS也可能在其中起重要的作用。
因此, 为了研究NO信号途径对E2抑制ERK信号途径在血管损伤反应中的作用, 我们重点在血管损伤模型上观察了血浆中NO的含量和血管组织eNOS的蛋白表达的变化。我们观察到球囊损伤后血管的eNOS蛋白表达明显下降, 去势使球囊损伤后血管的eNOS蛋白表达进一步降低, E2明显增加去势后球囊损伤血管的eNOS蛋白表达, 提示E2缺乏使损伤血管的eNOS蛋白表达下降, 补充E2后能纠正这种状况, 增加血管的eNOS的蛋白表达。各组血浆中NO的含量变化与eNOS呈正相关, 说明E2可通过eNOS来调节NO的生成, 从而发挥其血管保护作用。eNOS蛋白主要存在于内皮细胞, E2可调节其活性和蛋白表达[14, 7]。近年来的研究表明, 除内皮细胞外, 在心血管的其它组织细胞中也有eNOS的表达[15]。有研究表明, 将eNOS基因转染入血管平滑肌细胞能抑制 VSMC增殖[16], 更进一步支持本实验所得出的结果。在eNOS基因上含有E2反应性作用序列, 提示E2可调控其基因表达[15]。很多研究也证实了E2与eNOS基因启动子部位的ERE结合后直接增加了eNOS的mRNA和蛋白表达, 从而促进NO的产生[17]。雌激素可通过NO而抑制血管损伤反应。
本实验相关分析结果显示: 血浆NO的含量变化与eNOS 蛋白变化呈正相关, 而与ERK蛋白表达呈负相关, 同时与血管壁厚度也呈负相关。根据实验结果我们推断, E2可能通过调节eNOS来促进NO的生成, 从而抑制ERK蛋白的表达和活性, 进而抑制血管损伤后 VSMC的增殖。这一新的认识为今后利用E2解决血管损伤后血管壁再狭窄提供了一个新的思路。而E2如何通过NO来抑制ERK途径仍有待探讨。
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