生理学报Acta Physiologica Sinica,   August

研究论文

核因子κB在精氨酸血管升压素诱导大鼠心肌成纤维细胞一氧化氮合成中的作用

范延红1, 赵连友2,*, 郑强荪2,  薛玉生2, 杨学东2, 田建伟2, 徐琳2

1第四军医大学西京医院心脏内科, 西安 710033;

2第四军医大学唐都医院心脏内科, 西安 710038

 

摘要: 本文探讨了精氨酸血管升压素(AVP)刺激下体外培养的大鼠心肌成纤维细胞(CFs)内一氧化氮(NO)含量、 一氧化氮合酶(NOS)活性、 诱导型一氧化氮合酶基因表达的变化及其与核因子κB (NF-κB)的关系。用胰酶消化法分离培养Sprague Dawley仔鼠的CFs, 分别采用硝酸还原酶法、 分光光度法、 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、 免疫荧光-共聚焦显微镜和蛋白质印迹检测AVP干预下CFs的NO含量、 NOS活性、 iNOS mRNA表达和NF-κB的活化。结果显示, AVP浓度依赖性(0.001－0.1  μmol/L)地增加CFs的NO含量, 提高NOS活性, 增加iNOS mRNA表达; AVP能够活化NF-κB, 使其由细胞浆转位于细胞核; NF-κB特异性抑制剂吡咯啉烷二甲基硫脲(PDTC)能够抑制AVP诱导的CFs NO含量增加、 NOS活性提高和iNOS mRNA表达增加。上述结果提示, AVP干预下CFs iNOS mRNA表达增加、 NOS活性增高、 NO合成增多可能通过NF-κB激活途径, NF-κB激活参与心肌纤维化的发生和发展。

 

关键词: 精氨酸升压素; 一氧化氮; 心肌成纤维细胞; 核因子κB

 

中图分类号: Q463; R542.2+3

 

Arginine vasopressin-induced nitric oxide content changes in cultured cardiac fibroblasts and  its relation to nuclear factor-κB

FAN Yan-Hong1, ZHAO Lian-You2, ZHENG Qiang-Sun2, XUE Yu-Sheng2, YANG Xue-Dong2, TIAN Jian-Wei2, XU Lin2

1Department of Cardiology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,

and 2Department of Cardiology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038

 

Abstract: To investigate the changes in the nitric oxide (NO) contents, nitric oxide synthase (NOS) activity and inducible nitric oxide (iNOS) mRNA expression in arginine vasopressin (AVP)-induced cardiac fibroblasts (CFs) in vitro and its relation to nuclear factor-κB (NF-κB), CFs were isolated by trypsin digestion method. Nitric acid reductase method, spectrophotometry, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), immunofluorescence-interactive laser cytometer techniques and Western blotting were used respectively to detect NO contents, NOS activity, iNOS mRNA expression and the activation of NF-κB in CFs. AVP increased NO contents, NOS activity and iNOS mRNA expressions in a concentration-dependent manner; NF-κB was activated and mobilized from cytoplasm to nucleus in AVP-induced CFs; PDTC, one of the inhibitors of NF-κB, could inhibit aforementioned increments. It is suggested that the increases in NO contents, elevation of NOS activity and increment of iNOS mRNA expression may be mediated through NF-κB activation pathway in cultured CFs induced by AVP, and that NF-κB is involved in the occurrence and development of myocardial fibrosis. 

 

Key words: arginine vasopressin; nitric oxide; cardiac fibroblasts; NF-κB 

 

一氧化氮(NO)是一种重要的血管舒张因子, NO生成增多不仅可舒张血管、 降低血压, 还可抑制心肌纤维化的发生和发展[1]。精氨酸血管升压素(AVP)是下丘脑分泌的九肽抗利尿激素, 近年来的研究发现, AVP能够剂量依赖性地促进心肌成纤维细胞(CFs)增殖和胶原合成[2], 促进心肌纤维化的发生和发展。有研究表明, CFs表面有AVP受体[3], AVP能够时间依赖性地提高CFs一氧化氮合酶(NOS)活性, 促进CFs生成NO[4], 但是AVP与CFs NO合成的量效关系及通过何种细胞内机制和途径影响合成NO, 目前尚不清楚。核因子-κB (NF-κB)是一种广泛存在于各种细胞、 具有多种调节作用的转录因子, 能够调节包括诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在内的众多靶基因的基因表达, 白细胞介素-1 (IL-1)、 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)能够通过激活CFs的NF-κB上调iNOS基因表达, 增加NO合成[5]。本文拟探讨不同浓度AVP对体外培养大鼠CFs NO合成的影响及AVP诱导下NO合成增加是否通过NF-κB活化途径, 旨在探讨心肌纤维化发生的可能机制。

 

1  材料和方法

1.1 材料及试剂来源

实验用SD仔鼠(出生1－3 d)由第四军医大学动物中心提供。AVP由美国Peninsular Lab提供。NO含量和NOS活性测定试剂盒购自南京建成生物技术研究所。TRIZOL裂解液、 Oligo (dT)、 M-MLV反转录酶和Taq-DNA聚合酶分别购自Promega和宝生物公司。小鼠抗大鼠NF-κB p65单克隆抗体购自Transduction公司, 兔抗小鼠FITC抗体购自Sigma公司。SABC试剂盒购自宝生物公司。PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.2 CFs的分离、 培养和鉴定[5]

无菌条件下取SD仔鼠心室, 无菌盐水漂洗后剪至2－3 mm3小块。1.25 g/L胰蛋白酶 37℃ 消化20－40    min, 每5 min收集1次细胞, 收集3－4次, 筛网过滤, 1000 r/min离心3－5 min。将所得细胞沉淀物重新悬浮于含100 ml/L小牛血清的DMEM培养液中, 小心吹打分散。置于37℃, 50 ml/L CO2孵箱中贴壁60－90 min后更换培养液, 用差速贴壁法去除心肌细胞。继续培养细胞至近融合状态时按1∶2传代。实验用2－3代细胞。对CFs进行SABC法免疫组织化学染色结果: 纤维连接蛋白染色阳性, 血管平滑肌肌动蛋白染色阴性, 符合CFs染色特征。

1.3 CFs培养液NO含量、 NOS活性和iNOS mRNA表达量检测

实验分为对照组、 0.001  μmol/L AVP组、 0.01  μmol/L AVP组、 0.1  μmol/L AVP组、 1  μmol/L AVP组和0.1  μmol/L AVP+NF-kB特异性抑制剂吡咯啉烷二甲基硫脲(PDTC)组。CFs培养至近融合状态时无血清培养液驯化24 h, 继之分组培养24 h, 收集培养液测定NO含量和NOS活性, 收集细胞测定iNOS mRNA表达量。

1.3.1 NO含量测定

NO在体外转化为NO－2和NO－3, 利用硝酸还原酶将NO－3还原为NO－2, 通过显色深浅测定NO－2浓度推算NO含量。操作按试剂盒说明进行, NO含量以公式 (测定管吸光度－空白管吸光度)/(标准管吸光度－空白管吸光度)×100 μmol/L计算。

1.3.2 NOS活性测定

NO与亲核物质生成有色化合物, 测定其吸光度值, 通过NOS催化产生的NO量推算NOS活力。操作按试剂盒说明进行, NOS活性以公式(测定管吸光度－空白管吸光度)×141.6 U/ml计算。

1.3.3 iNOS mRNA表达量测定[6]

按TRIZOL试剂说明书提取CFs总RNA。反转录合成cDNA第一链, 反应体系为: 10×cDNA合成缓冲液、

MgCl2、 oligo (dT)、 4×dNTP、 RNA酶抑制剂、 AMV反转录酶和去离子水, 总体积20  μl, 42℃恒温水浴1 h。取反转录产物10 μl 进行PCR反应: 反应体系为: 10×PCR合成缓冲液、 4×dNTP、 上游引物、 下游引物、 cDNA模板、 Taq酶和去离子水, 总体积50 μl。循环参数为: 94℃变性1 min, 50℃复性1 min, 72℃延伸1.5 min, 共30个循环。其中鼠iNOS (GenBank登录号: X76881)上下游引物序列分别为: tcgagccctggaagacccacatct和gttgttcttcttccaaggtgtttgccttat, 扩增PCR产物大小为276 bp。鼠磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(GenBank登录号: M32599)上下游引物序列分别为: tattgggcgcctggtcacca和ccaccttcttgatgtcatca, 扩增PCR产物大小为746 bp。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳, 用凝胶图像分析系统分析, 以iNOS mRNA/GAPDH mRNA电泳带荧光强度比值作为iNOS mRNA表达量的指标。

1.4 CFs中NF-kB的活化

实验分为对照组、 0.1  μmol/L AVP组、 0.1  μmol/L AVP+PDTC组。细胞培养至近融合状态时用无血清培养液驯化24 h, 继之分组再培养1 h, 收集细胞。

1.4.1 CFs中NF-kB细胞内定位检测

用4%多聚甲醛固定细胞。以5%山羊血清室温封闭30 min; 倾去血清, 滴加1∶30抗大鼠NF-κB p65单克隆抗体4℃过夜; 倾去抗体孵育液, PBS洗3次, 换加1∶10 FITC荧光标记兔抗鼠抗体, 4℃过夜, PBS充分洗板。将待测样品置于激光扫描共聚焦显微细胞仪下, 选用40×物镜, 7%滤光片, 确定激发光波长为488 nm, 进入Kinetics-Image Scan程序, 预扫描后选定最佳细胞扫描参数, 扫描细胞照片并保存。

1.4.2 制备CFs核提取物[7]

 用冷Tris缓冲盐溶液洗涤细胞2次, 将沉淀悬浮于400 μl溶液A (mmol/L: HEPES 10, pH 7.9,  KCl 10、

 EDTA 0.1、   EGTA 0.1、  DTT 1、   PMSF 0.5)冰浴15 min, 加入25 μl 10% NP-40溶液, 混匀后于4℃ 5000 r/min离心, 沉淀重悬于30 μl溶液B [mmol/L:  HEPES  20, pH 7.9,  NaCl 400、   EDTA 1、  EGTA 1、  DTT 1、  PMSF 1和25% (v/v)]甘油中, 置摇床上剧烈震荡15 min, 4℃ 15000  r/min离心10 min,取上清分装冻存。

1.4.3 CFs细胞核中NF-κB蛋白含量检测

CFs核提取物与等体积2×电泳加样缓冲液混合煮沸5 min, 每泳道上样10 μl。用10%聚丙烯酰胺凝胶标准方法电泳, 并将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。对硝酸纤维素膜进行丽春红S染色, 观察蛋白质转移情况后用去离子水将染液漂洗干净。用封闭液37℃孵育硝酸纤维素膜1 h, 1∶100抗NF-κB p65抗体4℃孵育膜过夜, PBS洗膜5 min×2次。生物素标记二抗工作液4℃孵育膜过夜, PBS洗膜5 min×3次。辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液4℃孵育膜过夜, PBS洗膜5 min×3次。DAB显色, 显色适度时, 再用水漂洗终止显色反应, 拍摄滤膜照片。

1.5 统计学处理

所有数据以means±SD表示, 应用SPSS统计软件对资料进行分析。多组均数比较采用F检验和q检验, P<0.05表示有显著性差异, P>0.05表示无显著差别。

 

2  结果

2.1 AVP对CFs NO合成、 NOS活性的影响以及PDTC的抑制作用

对照组CFs具有NOS活性, 能够合成NO。在不同浓度AVP干预下, CFs NOS活性增强, NO含量升高, 呈浓度依赖性。其中0.1  μmol/L AVP组和1  μmol/L AVP组的NOS活性和NO含量均显著高

于对照组、 0.001  μmol/L、0.01  μmol/L和1  μmol/L AVP组的NOS活性和NO含量虽均低于0.1  μmol/L AVP组, 但无显著性差异。加入PDTC后0.1  μmol/L AVP组CFs NOS活性和NO合成显著降低(见表1)。

 

表1.  AVP和PDTC对CFs培养上清液中NO含量和NOS活性的影响

Table 1. Effects of AVP and PDTC on NO contents and NOS activity in CFs supernatant 

Group 

NO contents (μmol/L) 

NOS activity (U/ml)

Control  

29.34±5.34# 

26.65±4.87#

AVP 0.001μmol/L   

31.79±1.59# 

30.33±8.24#

AVP 0.01μmol/L  

36.87±1.89# 

35.96±4.1#

AVP 0.1μmol/L   

70.78±8.93* 

71.86±3.3*

AVP 1μmol/L

62.86±6.05* 

66.34±3.8*

0.01μmol/L AVP+PDTC  

40.63±7.82#

33.32±6.49#

*P<0.05 vs control, #P<0.05 vs   0.01  μmol/L AVP group.  n=5, means±SD.

 

2.2  AVP对CFs iNOS mRNA表达的影响以及PDTC的抑制作用

对照组CFs有iNOS mRNA表达。在不同浓度AVP干预下, CFs iNOS mRNA表达量呈浓度依赖性增加。其中0.1和1  μmol/L AVP组的iNOS mRNA表达量显著高于对照组,  0.001、0.01和 1  μmol/L AVP组的iNOS mRNA表达量虽低于0.1  μmol/L AVP组, 但无显著性差异。加入PDTC后0.1  μmol/L AVP组iNOS mRNA表达量显著降低(图1和表2)。

图1.AVP和PDTC对CFs iNOS mRNA表达的影响

Fig. 1.Effects of AVP and PDTC on iNOS mRNA expression in CFs.     

1, control group;

2, 0.001  μmol/L AVP group;

3, 0.01  μmol/L AVP group;

4, 0.1  μmol/L AVP group;

5, 1  μmol/L AVP group;

6, 0.1  μmol/L AVP+PDTC group.

 

表2. AVP和PDTC对CFs iNOS mRNA的影响

Table 2.  Effects of AVP and PDTC on iNOS mRNA expression in CFs (OD value)

Group 

iNOS 

GAPDH 

iNOS/GAPDH

Control  

0.15±0.02# 

0.61±0.02 

0.25±0.04#

0.001μmol/L AVP  

0.18±0.04# 

0.59±0.03 

0.30±0.06#

0.01μmol/L AVP  

0.19±0.02# 

0.60±0.01 

0.31±0.03#

0.1μmol/L AVP  

0.43±0.04* 

0.62±0.03 

0.70±0.03*

1μmol/L AVP  

0.38±0.02* 

0.58±0.04 

0.66±0.06*

0.1μmol/L AVP +PDTC  

0.21±0.05# 

0.64±0.07 

0.33±0.05#

*P<0.05 vs control, #P<0.05 vs 0.1  mol/L AVP group. n=5, means±SD.

 

2.3 AVP对CFs NF-κB细胞内定位的影响以及PDTC的抑制作用

CFs呈多角形或梭形散在、 成簇生长。对照组CFs胞浆有中等强度绿色荧光着色, 胞核中无荧光着色; 0.1  μmol/L AVP组CFs胞浆中绿色荧光着色强度显著减弱, 核中有强绿色荧光着色, 并可在核中强绿色荧光着色处见无荧光着色的核仁区; 0.1  μmol/L AVP+PDTC组CFs胞浆中有中等强度绿色荧光着色、 胞核中无荧光着色, 偶尔可见核中有强绿色荧光着色、 胞浆着色浅淡的细胞(图2)。

图2.AVP和PDTC对CFs中NF-κB细胞内分布的影响

Fig. 2.Effects of AVP and PDTC on the distribution of NF-κB in CFs (×400).

图3.AVP和PDTC对CFs核提取物中NF-κB蛋白含量的影响 

Fig. 3.

Effects of AVP and PDTC on NF-κB protein contents in CFs nuclear extract. 

1, AVP group;

2, AVP+PDTC group;

3, control group.

 

2.4 AVP对CFs核内 NF-κB蛋白含量的影响以及PDTC的抑制作用

在对照组CFs核蛋白提取物中未发现NF-κB蛋白, 0.1  μmol/L AVP组CFs核蛋白提取物中NF-κB蛋白表达阳性。与0.1  μmol/L AVP组相比, 0.1  μmol/L AVP+PDTC组CFs核蛋白提取物中NF-κB蛋白表达显著减弱(图3)。

 

3 讨论

心肌纤维化是指心肌组织中胶原浓度显著升高或胶原容积分数显著高于正常值, CFs是其主要效应细胞。心肌间质胶原增多使心肌硬度增加, 顺应性下降, 导致心脏舒张、 收缩和传导功能发生障碍, 是心力衰竭、 心律失常和心性猝死发生的重要环节[8]。AVP和NO是重要的血管活性物质, 它们在心肌纤维化的发生和发展中起相互拮抗的作用。CFs本身能够合成分泌NO, 但在CFs中NO合成与AVP的浓度效应关系及其细胞内机制目前还不清楚。

本研究结果显示, 在一定浓度范围内(0.001－0.1  μmol/L)AVP干预下CFs的NO含量、 NOS活性和iNOS mRNA表达量都随AVP浓度的增高而增加; 但当AVP浓度继续增高(1  μmol/L)时, 这些反而都有所下降。说明AVP能够在一定浓度范围内剂量依赖性地提高CFs合成NO, 其最大效应浓度为0.1  μmol/L。NOS是NO合成的关键酶, 根据其存在方式及作用特点分为内皮型、 神经元型和诱导型三种类型。 免疫组化研究认为, 成纤维细胞中仅含有iNOS[9], 其活性受iNOS基因表达控制。这与本研究中iNOS mRNA表达量、 NOS活性和NO含量同步增减相符合。本实验中使用的AVP浓度与高血压患者血中的AVP浓度一致[10], 因此AVP干预下CFs内NO合成增多具有重要的病理生理意义, 它可能属于生物体内的一种代偿性负反馈调节机制。增加的NO能够在一定范围内拮抗AVP浓度增高(0.001－0.1  μmol/L)所致的促心肌纤维化作用, 以求最大限度地维持正常的心肌结构和功能; 但这种代偿能力是有限的, 当AVP浓度过高(>0.1  μmol/L)时, CFs合成的NO不能再继续增加, 也就无法拮抗更高浓度AVP的促心肌纤维化作用, 导致心肌组织发生纤维化。

NF-κB是由p50和p65亚基组成的异源二聚体, 正常情况下它在胞浆中与其抑制蛋白结合而呈非活性状态。当细胞受到各种刺激原作用时, NF-κB与其抑制蛋白解离而激活, 进入细胞核内与特定基因启动子结合, 调节靶基因表达。

本研究通过AVP诱导CFs合成NO增加进行实验, 结果发现AVP干预下CFs 的NF-κB由细胞浆转位至细胞核, 细胞核中可检测出NF-κB蛋白, 说明AVP能够激活CFs的NF-κB。近年研究发现, iNOS基因5'端转录调控区域中含有NF-κB结合位点, NF-κB激活参与iNOS mRNA表达[11]。因此, AVP干预下CFs NO合成增多可能是通过激活NF-κB, 增加iNOS mRNA表达, 提高NOS活性途径实现的。本文结果显示: AVP在活化CFs NF-κB的同时, 能够上调iNOS mRNA表达, 提高NOS活性, 增加NO合成, 并且这三种上调作用均能够被NF-κB特异性抑制剂PDTC显著抑制。从而证实, AVP干预下CFs NO合成增加至少部分通过NF-κB活化、 iNOS mRNA表达增加、 NOS活性增高途径, 提示NF-κB激活可能与心肌纤维化的发生发展有关。

NO不但直接抑制CFs增殖、 降低纤维连接蛋白、 Ⅰ型胶原和III型胶原基因表达、 促进间质胶原降解[12], 而且通过抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活、 降低血压等间接途径抑制心肌纤维化[13]。因此, 通过调节NF-κB的活性或以NF-κB作为药物作用的靶点增加NO合成, 可以延缓心肌纤维化的发生和发展, 这将为心肌纤维化的防治研究提供新的思路。

 

参考文献

 

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