生理学报Acta Physiologica Sinica, August
研究论文
6-羟基多巴胺损毁大鼠内侧前脑束早期黑质-纹状体系统的铁水平与多巴胺能神经元退变的关系
王俊, 姜宏, 谢俊霞*
青岛大学医学院生理学教研室, 青岛 266021
摘要: 应用快速周期伏安法(fast cyclic voltammetry, FCV)、 原子吸收分光光度法及免疫组织化学方法, 观察了6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)单侧损毁大鼠内侧前脑束(medial forebrain bundle, MFB)早期 黑质(substantia nigra, SN)铁水平与多巴胺(dopamine, DA)神经元损伤的变化, 以及纹状体(striatum, Str) 的DA释放。结果如下: 6-OHDA单侧损毁大鼠MFB 1 d和3 d后, SN的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH) 阳性细胞分别下降了45%和66%; 与正常鼠和未损毁侧相比, 损毁侧SN的铁染色增强, 铁浓度增加, 而Str的DA释放量不变; 6-OHDA 损毁后1 d与3 d组相比, 损毁侧的铁染色、铁浓度及DA释放量差别无显著性。上述结果表明, 6-OHDA单侧损毁大鼠MFB的早期阶段, SN中的DA能神经元数目中等程度减少时, 铁染色及铁浓度即有增加, 由于DA能神经系统有强大的代偿功能, 使得Str的DA释放量仍趋于正常。
关键词:铁; 多巴胺; 黑质; 帕金森病; 快速周期伏安法
中图分类号: Q426; R592
Correlation
between iron levels and degeneration of dopaminergic neurons in rat
nigrostriatal system during the
early 6-OHDA lesions in medial forebrain bundle
WANG Jun, JIANG Hong, XIE Jun-Xia*
Department of Physiology, Medical College of Qingdao University, Qingdao, Shangdong 266021
Abstract: In the present study, using fast cyclic voltammetry (FCV), atomic absorption/flame emission spectrophotometry and immunohistochemistry, we investigated the correlation between iron levels and degeneration of dopaminergic neurons in rat nigrostriatal system during the early 6-OHDA lesions in the medial forebrain bundle (MFB). The results showed that 1 d or 3 d after lesions in MFB, there was a 45% or 66% reduction, respectively, in the density of tyrosine hydroxylase (TH) immunoreactive cells in the substantia nigra (SN) of the lesioned side accompanied by an increase in iron staining intensity and iron concentration; while there was no change in dopamine (DA) release in the striatum (Str) of the lesioned side compared with the unlesioned side and the normal rats. There was no difference in the iron staining and concentration of SN and DA release of Str on the lesioned side between one-day group and three-days group. These results suggest that an iron level elevation in SN may be involved at the early stage of degeneration of DA neurons in SN. However, DA release in Str was unchanged due to the immense compensatory mechanism of DA system.
Key words: iron; dopamine; substantia nigra; Parkinson's disease; fast cyclic voltammetry
帕金森病(Parkinson's
disease, PD)最主要的病理学特征为黑质致密带(substantia nigra zona compacta, SNc)多巴胺(dopamine,
DA)能神经元脱失及伴发的纹状体(striatum, Str)轴突末梢DA的耗竭。为阐明导致黑质(substantia nigra, SN) DA能神经元变性的原因,
神经科学家们进行了长期广泛深入的研究, 大量的实验支持自由基形成与氧化应激参与PD的发病[1]。铁是细胞色素蛋白中血红素的关键成分, 在细胞呼吸过程中介导线粒体内的电子传递,
铁还参与了转变儿茶酚胺的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)和单胺氧化酶的构成, 是脑内许多独特的酶系统的辅助因子。然而, 高浓度的游离铁离子存在于细胞内或细胞周围却是非常有害的,
铁离子, 特别是二价铁离子通过Fenton反应促进过氧化物的降解, 形成羟自由基, 羟自由基通过损伤蛋白质、核酸和含有大量未饱和脂肪酸的细胞膜, 最终导致细胞膜的脂质过氧化、细胞膜流动性改变和细胞死亡[2]。PD病人的SN含铁量增加是由Lehermitt
(1924)和Earle (1967)先后发现的, SN内铁含量增高具有特别意义: (1)PD病人其他脑区未见铁增高; (2)铁含量增高选择性的发生在SNc,
即PD病人神经元变性的主要部位; (3)脂质过氧化反应在PD病人的SN处增加。然而铁为什么会增高仍不清楚。
6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)单侧损毁大鼠内侧前脑束(medial forebrain bundle, MFB)是目前PD研究中公认的及经典的动物模型[3], 6-OHDA单侧损毁SN- Str DA系统至少一周才出现阿朴吗啡(apomorphine, APO)诱发的旋转行为及运动失调[4]。迄今为止, 大量报道均集中在 6-OHDA单侧损毁大鼠SN-Str DA系统1周以上或Str的DA含量下降90%以上的研究结果。然而组织化学、神经化学的变化, 几乎在6-OHDA注射后立即发生。为此, 本实验通过观察6-OHDA单侧损毁MFB大鼠, 注射1、3 d后铁水平变化与DA神经元损伤及DA释放量的改变, 以探讨6-OHDA损毁MFB早期的形态学、DA释放量的改变与铁水平变化之间的相互关系。
1 材料和方法
1.1 动物与药品
实验动物选用成年雌性Wistar大鼠(180－220 g, 由山东医科大学动物中心提供),
置于室温19±2℃, 12∶12小时昼夜循环光照条件下生活, 自由饮水、取食。动物于实验前适应实验室环境一周。
6-OHDA与DA均为Sigma公司产品, TH免疫组织化学试剂盒由博士德公司提供。
1.2 6-OHDA单侧损毁MFB
大鼠麻醉后将其头部固定在立体定位仪上, 暴露颅骨, 参照Paxinos和Watson鼠脑立体定位图谱, 在左侧相当于MFB区的颅骨表面钻孔(直径约2.5 mm)。清理脑膜后, 参照Earl法[5]在三维推进器的引导下行MFB两点注射6-OHDA (3.6 mg/ml), 坐标: (1) TB:－2.3 mm, AP:－4.4 mm, ML:1.2 mm, V: －7.8 mm; (2) TB: ＋3.4 mm, AP: －4.0 mm, ML: 0.8 mm, V:－8.0 mm。两点分别注射2.5和3.0 μl的6-OHDA, 注射速度为1 μl/min, 每次注射后留针5 min, 缓慢出针, 缝合头皮, 术后连续3 d 肌注青霉素预防感染。
1.3 快速周期伏安法(fast cyclic voltammetry, FCV) 测定
实验用工作电极为碳纤维微电极, 由本室自制。碳纤维直径为8 μm, 暴露在玻璃管尖端外的碳纤维长度为20－60 μm, 电极不做任何表面预处理。选择合格的碳纤维微电极备用。
动物麻醉后,
头部固定于立体定位仪上, 保持前后囟相平。暴露颅骨后用牙科钻在相当于Str和MFB区的同一侧颅骨表面钻两个小孔(直径约2 mm), 分别放置碳纤维工作电极和刺激电极。在同侧两孔间合适位置钻第三个小孔,
直径约1 mm, 放置Ag/AgCl参考电极。按照坐标[5]: AP: ＋1.1 mm, ML: 2.8 mm, V: －5.5 mm将碳纤维微电极插入Str区,
将刺激电极插入同侧MFB区, 坐标为[5]: AP: －4.3 mm, ML: 1.5 mm, V: －6.5 mm, 将参考电极置于脑膜表面。实验开始后, 每隔10
min将刺激电极下移0.5 mm, 并参照本室前期的研究工作[6,7]给予100 Hz, 200个脉冲(P), 1.5 mA, 0.2 ms波宽的负向脉冲方波电刺激,
直至在Str区记录到DA释放为止。通常情况下当刺激电极尖端在脑膜下7.5－8.0 mm时, 即可记录到DA释放。
每次实验结束后, 均用标准DA溶液进行碳纤维微电极的离体校准, 常规评价电极敏感性和伏安测定信号。根据各种DA溶液浓度及对应的氧化电流(电压)值, 绘出标准曲线,
由此得出电刺激MFB诱发Str区DA释放的实际释放量[6,7](释放量的单位为μmol/L)。
实验后, 动物断头取脑, 行组织学切片, 观察刺激电极及工作电极尖端位置是否准确, 电极位置不准确的资料弃去不用。
1.4 黑质内铁浓度测定
动物断头处死, 取出双侧SN称重, 放入50 ml烧杯中, 加入2 ml混合酸溶液(高氯酸:硝酸=1∶4), 在砂熔炉上加热, 至组织完全消化, 将酸溶液蒸发, 用去离子水定容至1 ml, 备用。将配制好的不同浓度的标准液上机测定其吸收值, 原子吸收分光光度计自动绘制标准曲线, 根据测得的吸收值得出样品中的铁浓度。
1.5 铁染色
修整中脑组织块进行冠状连续冰冻切片, 片厚25 μm。切片间隔分两套, 一套作铁染色, 一套作TH免疫组织化学。铁染色采用经典的Perls'染色[8]: 切片置于4%多聚甲醛溶液中浸泡5
min, 去离子水冲洗30 s, 然后在新鲜配置的2% HCl与2%亚铁氰化钾等体积混合液中孵育30 min, 0.01 mol/L PBS冲洗后浸泡在1% H2O2中去除内源性过氧化物酶, DAB显色10 min。
阴性对照:
在染色过程中不加亚铁氰化钾-盐酸混合液。
灰度分析: 在SNc中央区域取两个互不重叠的高倍视野, 分别测其平均密度值, 取两个视野的平均值。用于灰度分析的是VIDAS2.1图像分析系统, (德国欧波同公司生产), 测定面积为512×512点阵。
1.6 TH免疫组织化学技术
上述切片在0.3%过氧化氢-甲醇溶液中37℃孵育15 min, 以去除内源性过氧化物酶。PBS冲洗3次后, 10%正常山羊血清37℃孵育15 min。TH抗体(1∶10000稀释)湿盒中4℃过夜。PBS冲洗3次后, 生物素标记二抗37℃孵育30 min。然后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液, DAB显色10－15 min。不加一抗的切片不显色。
1.7 统计学处理
实验结果采用mean±SE表示, 所用统计方法有配对样本t检验、随机区组方差分析后Q检验, P<0.05说明结果有统计学意义。
2 结果
2.1 6-OHDA单侧损毁MFB大鼠SN铁含量的变化
6-OHDA单侧损毁MFB后1 d组、3 d组大鼠损毁侧铁含量与未损毁侧及正常大鼠相比有显著性差异(P<0.05), 但未见铁染色强度进行性增强 (P>0.05) (表1)。
表1. 6-OHDA单侧损毁大鼠MFB后SN铁浓度的变化
Table 1. Changes in iron concentration in rat SN after unilateral 6-OHDA lesion in MFB
(μg/mg wet weight of brain tissue)
|
Group |
n |
Lesioned side |
Unlesioned side |
|
Normal |
7 |
0.11±0.05 |
0.11±0.05 |
|
1 d |
7 |
0.46±0.05*# |
0.10±0.02 |
|
3 d |
7 |
0.60±0.04*# |
0.12±0.04 |
*P<0.05, compared with normal rat.
#P<0.05, compared with unlesioned side.
2.2 6-OHDA单侧损毁MFB大鼠SN的铁染色结果
SN内铁染色阳性细胞主要是胶质细胞, 呈圆形, 体积较小, 有的有突起, 神经元极少着色。6-OHDA损毁1 d与3 d大鼠, 损毁侧铁染色均增强, 但未见铁染色进行性增强(图1、 2)。
图1.6-OHDA单侧损毁大鼠MFB后SN铁染色的变化
Fig. 1.Changes in iron staining in rat SN after unilateral 6-OHDA lesions in MFB.
A: Normal.
B: 1 day after 6-OHDA lesion.
C: 3 days after 6-OHDA lesions.
Scale bar, 25 μm.
图2.6-OHDA单侧损毁大鼠MFB后SN铁染色的定量分析
Fig. 2.Quantitative analysis of iron staining in rat SN after unilateral 6-OHDA lesion in MFB.
*P<0.05, compared with normal rat;
#P<0.05, compared with unlesioned side.
图3.6-OHDA单侧损毁大鼠MFB后SN内TH染色的变化
Fig. 3.Changes in TH immunohistochemistry in rat SN after unilateral 6-OHDA lesion in MFB.
A: Normal.
B: One day after 6-OHDA lesion.
C: Three days after 6-OHDA lesion.
Scale bar, 25 μm.
2.3 6-OHDA单侧损毁MFB大鼠SN的TH免疫组织化学染色结果
图3显示损毁侧阳性细胞数呈圆形, 不见突起, 而健侧TH阳性细胞密集, 呈多角形。1 d组损毁侧SN内TH免疫阳性细胞的平均密度较对侧下降45%, 3 d组TH阳性细胞平均密度下降66% (图3、 4)。
图4.6-OHDA单侧损毁大鼠MFB后SN内TH染色的定量分析
Fig. 4.Quantitative analysis of TH immunochemistry in rat SN after unilateral 6-OHDA lesion in MFB.
*P<0.05, compared with normal rat.
#P<0.05, compared with unlesioned side.
2.4 6-OHDA单侧损毁MFB大鼠Str的DA释放量
实验分为3组, 6-OHDA单侧损毁MFB后1 d和3 d大鼠及正常大鼠各7只, 分别测试其双侧Str由电刺激MFB诱发的DA释放量。 6-OHDA损毁后1、3 d的大鼠损毁侧与未损毁侧及对照相比, Str的DA释放量差别无显著性(表2)。
表2. 6-OHDA单侧损毁大鼠MFB后Str的DA释放量
Table 2. DA release in striatum after unilateral 6-OHDA lesion in MFB (μmol/L)
|
Group |
n |
Lesioned side |
Unlesioned side |
|
Normal |
7 |
2.00±0.18 |
1.98±0.20 |
|
1 d |
7 |
1.95±0.25 |
1.88±0.17 |
|
3 d |
7 |
1.84±0.18 |
1.99±0.12 |
P>0.05 compared with normal rat and unlesioned side.
3 讨论
3.1 6-OHDA损毁大鼠MFB后SN DA神经元变性死亡及其可能原因
本实验观察到6-OHDA损毁MFB 1或3 d 后, SN TH染色阳性细胞明显减少, 表明DA神经元变性死亡, 这是由6-OHDA 的毒性作用所致。6-OHDA是一种神经毒物, 因其结构与DA类似, 所以可与高亲和力的儿茶酚胺转运系统结合进入相应的神经元内, 在单胺氧化酶B(monoamine oxidase-B, MAO-B)的作用下产生H2O2, 再由Fe2+通过Fenton反应生成羟自由基和高铁离子(ferryl ion)自由基, 从而使DA形成5-OHDA和6-OHDA, 新生成的6-OHDA又可以使铁蛋白释放Fe2+, Fe2+催化产生大量自由基, 如此循环, 造成细胞死亡[9]。受6-OHDA影响的变性DA神经元更易受氧化应激的损伤, 这些神经元含有神经黑素。因为DA自身氧化会形成神经黑素, 它具有高度亲和铁的能力和容量[10]。铁-黑素反应能使Fe3+还原为Fe2+, 产生大量羟自由基, 从而引发过氧化反应, 造成神经元死亡。
3.2 SN铁染色增强相伴DA能神经元变性死亡出现在6-OHDA损毁的早期
SN 铁染色结果可见, 铁染色阳性细胞呈圆形, 体积较小, 主要是胶质细胞, 神经元很少着色,
可能由于神经元中铁在呼吸酶链中以血红素铁形式存在, 而不是非血红素铁的形式[8]。脑内非血红素铁一般认为存在于铁蛋白中, 铁蛋白的L亚基(含高浓度的铁)主要存在于胶质细胞中。
6-OHDA损毁MFB 1 d 及3 d 后SN内铁染色均增加, 这与我们前期的研究工作[7] 即SN内注入Fe3+ 4周后, Str DA释放减少, DA及DA代谢产物降低的结果相一致, 这是由于: (1) Perls' 染色主要染自由的疏松结合的Fe3+, 6-OHDA能将铁从铁蛋白上释放出来。(2)铁可以通过与表达增多的各种铁转运蛋白结合进入SN。Sastry等人[11]用6-OHDA单侧损毁Str, 分别于1周, 1月后进行实验, 发现SN内铁染色进行性增强, 铁浓度进行性增加。本实验未显示出铁染色进行性增强的结果, 仅观察到1 d与3 d相对较短的时间里铁含量的变化, 且与DA能神经元变性死亡相伴出现。
3.3 Str的DA的释放量反映DA系统的功能
在6-OHDA损毁MFB 1 d、3 d及正常大鼠的两侧Str, 我们未观察到3组大鼠DA释放量之间的差别。这可能是由于6-OHDA损毁1－3
d, 变性死亡的DA神经元仅占半数左右, 而FCV法以碳纤维电极测定的DA释放所涉及的DA神经元胞体范围较小和DA神经元固有的代偿性作用所致。PD病人及PD模型动物DA神经元变性死亡大于90%时才分别出现症状及行为学改变[12,13],
即是有力的佐证。据报道, 与DA神经元纤维末梢所在部位Str的DA耗竭相比, DA神经元胞体所在部位SN的DA耗竭程度能更好的反映SN-Str系统的受损程度[14],
即SN受损程度小时凭借DA系统强大的代偿作用, 在Str内仍能检测到DA释放接近正常。6-OHDA损毁的PD模型鼠中, Str中DA耗竭60%－90%时, 用微透析法测得Str的DA浓度与正常对照无差别,
当Str内DA耗竭达90%以上时, DA浓度才下降[15]。可见, 尽管DA能神经元丢失, SN-Str DA系统有着巨大的代偿能力来维持其正常功能。
大量资料表明, 多种神经元变性性疾病如PD, Huntington's disease, Hallervorden-Spatz disease 均有铁含量增加,
且有报道称只有在PD的晚期才出现SN铁的增加[16]。这些均说明铁积累并非PD的发病原因而是神经元变性的继发反应。超声研究的结果却认为, 铁是PD发病的重要原因而不是神经元变性的结果[17]。脑代谢研究的权威Rouault
TA在Nature Genetics撰文指出, 目前已有足够的证据证实, 铁在神经退行性疾病中是一个关键因素[18]。虽然铁在PD发病中是因还是果的问题仍是目前神经科学家争论不休的焦点问题,
但是本实验结果表明, 在6-OHDA单侧损毁1－3 d内, SN TH阳性细胞中等程度减少时, 铁染色即增加, 提示高铁可能与DA神经元变性死亡直接相关。 因此我们认为,
在很大程度上SN铁增加是DA神经元变性死亡的原因。
随着研究的进展, 人们逐渐认识到铁在PD的发病机制中起到关键的作用[18], 而本实验观察到SN内DA中等程度减少时铁浓度即有增加, 这将为在PD治疗中早期应用铁离子螯合剂提供潜在的应用前景。
参考文献
[1] Jenner P, Dexter D, Sian J, Schapira A, Marsden C. Oxidative stress as a cause of nigral cell death in Parkinson's disease and incidental lewy body disease. Ann Neurol 1992;32:S82－S87.
[2]Venarucci D, Venarucci V, Vallese A, Battilal L, Casado A, Dela Torre R, Lopez Fernandez ME. Free Radicals: important cause of pathologies refer to aging. Panminerva Med 1999;41: 335－339.
[3]Deumens R, Blokland A, Prickaerts J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrosriatal pathway. Exp Neurol 2002;175: 303－317.
[4]Christina LZ, Vivian KN, Lori AB, George RH, Ann CG, Paula CB. Time course of degenerative alterations in nigral dopaminergic neurons following 6-hydroxydopamine lesion. J Comp Neurol 2000;427:440－454.
[5]Earl CD, Reum T, Junxia Xie, Sautter J, Kupsch A, Oertel WH, Morgenstern R. Foetal nigral cell suspension grafts influence dopamine release in the non-grafted side in the 6-OHDA rat model of Parkinson's disease: in vivo voltammetrice data. Exp Brain Res 1996;109: 179－184.
[6]Xie JX (谢俊霞), Zhou Y, Jiang H. Monitoring dopamine release by fast cyclic voltammetry: an in vivo study. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志) 2000;16: 370－372 (Chinese, English abstract).
[7]Jiang H (姜 宏), Chen WF, Xie JX. Rlationship between dopamine and iron contents in the brain of Parkinsonian rats. Acta Physiol Sin (生理学报) 2001;53(4):334－338 (Chinese, English abstract).
[8]Morris CM, Candy TM, Oakly AE, Bloxham CA, Edwardson JA. Histochemical distribution of non-haem iron in the human brain. Acta Anat 1992;144:235－257.
[9]Ekienzl K, Jellinger H. Iron as catalyst for oxidative stress in the pathogenesis of Parkinson's disease. Life Sci 1999;65:1973－1976.
[10]Ben-shachar D, Riederer P, Youdim MBH. Iron-melanine interaction and lipid peroxidation:implications for Parkinson's disease. J Neurochem 1991;57:1609－1614.
[11]Sastry S, Arendash GW. Time dependant changes in iron levels and associated neuronal loss within the substantia nigra following lesions within the neostriatum/globus pallidus complex. Neuroscience 1995;67: 6
49－666.
[12]Bernheimer H, Birkmayer W, Hornykiewicz O, Jellinger K, Seitelberger F. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson and Huntington: clinical, morphological and neurochemical correlations. J Neurol Sci 1973;20:415－455.
[13]Zigmond MJ, Stricker EM. Recovery of feeding and drinking by rats after intraventricular 6-hydroxydopamine or lateral hypothalamic lesions. Science 1973;182:717－719.
[14]Connor JJ, Kruk ZL. Fast cyclic voltammetry can be used to messure stimulated endogenous 5-hydroxytamine release in untreated rat brain slices. J Neurosci Methods 1991;38: 25－33.
[15]Zhang WQ, Tilson HA, Nanry KP, Hudson PM, Hong TS, Stachowiak, MK. Increased dopamine release from striata of rats after unilateral nigrostriatal boundle damage. Brain Res 1988;461: 335－342.
[16]Riederer P, Sofic E, Rausch W, Schmidt B, Reynolds G, Jellinger K, Youdim M. Transition metals, ferritin, glutathion and ascorbic acid in Parkinsonian brains. J Neurochem 1989;52: 515－520.
[17]Berg D, Gerlach M, Youdim MBH. Brain iron pathways and their relevance to Parkinson's disease. J Neurochem 2001;79: 225－236.
[18]Rouault TA. Iron on the brain. Nat Genet 2001;28: 299－300.