生理学报Acta Physiologica Sinica, August

研究论文

大鼠坐骨神经切断后外源性bcl-2对脊髓运动神经元的保护作用

杨萍*, 应大君, 宋林, 孙建森

第三军医大学解剖学教研室, 重庆 400038

摘要:采用大鼠坐骨神经切断损伤模型, 行神经外膜端端对线缝合, 术中依不同组别, 动物于神经缝合处远端0.5 cm处分别注射人的正义和反义bcl-2重组腺病毒(Ad/s-bcl-2、 Ad/as-bcl-2), 报道基因重组腺病毒(Ad/lacZ)和生理盐水。术后48 h, 7 d, 15 d和30 d常规灌注固定大鼠, 取L4－L6脊髓节段, 应用X-gal染色、 bcl-2原位杂交和免疫组化染色、 TUNEL染色以及乙酰胆碱酯酶(AChE)组织化学染色方法, 观察到外源基因能在脊髓中表达, 同时外源性Ad/s-bcl-2能显著减少L4到L6节段脊髓前角运动神经元凋亡的数目, 减少脊髓前角运动神经元中因坐骨神经切断导致的AChE活性的降低幅度, 并加快其恢复。而Ad/as-bcl-2可显著增加坐骨神经切断诱导的脊髓前角运动神经元凋亡数目以及AChE活性降低幅度, 并延缓其恢复。这些观察结果表明, 外源性bcl-2能保护周围神经切断后引起的脊髓运动神经元损伤。

关键词: bcl-2; 周围神经损伤; 运动神经元; 腺病毒载体

中图分类号: Q426; R 338; R 345.57

Protective effect of exogenous bcl-2 on spinal cord motoneurons following sciatic nerve axotomy in the rat

YANG Ping*, YING Da-Jun, SONG Lin, SUN Jian-Sen

Department of Anatomy, Third Military Medical University, Chongqing 400038

Abstract: The aim of this study was to investigate the protective effect of exogenous bcl-2 on spinal cord motoneurons following sciatic nerve axotomy. After epineurium suturing, sense bcl-2 (Ad/s-bcl-2), antisense bcl-2 (Ad/as-bcl-2), or reporter gene lacZ (Ad/lacZ) recombinant adenovirus or NS was injected into the sciatic nerve 0.5 cm distant from the sutured point respectively in different groups. The rats were transcardially perfused with 4% paraformaldehyde on postoperative 48 h, 7 d, 15 d and 30 d respectively and the spinal cords of L4 to L6 were harvested. X-gal staining, bcl-2 in situ hybridization and immunohistochemical staining, TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling) staining and AChE (acetyl cholinesterase) histochemical staining were used. We observed that the exogenous lacZ gene was expressed in the spinal cord of Ad/lacZ group, and sense bcl-2 significantly decreased the number of apoptotic motoneurons and the decreasing degree of AChE activity of the motoneurons in the spinal cord induced by sciatic nerve axotomy and accelerate AChE activity recovery. However, antisense bcl-2 increased the number of apoptotic motoneurons and the decreasing degree of AChE activity of the motoneurons in the spinal cord induced by sciatic nerve axotomy and prolonged AChE activity recovery. These results demonstrate that exogenous bcl-2 may protect motor neurons from injury induced by peripheral nerve axotomy.

Key words: bcl-2; peripheral nerve injury; spinal motoneuron; adenovirus

周围神经损伤虽局限于轴突, 但神经功能的恢复涉及到神经元、轴突及末梢效应器三部分, 神经元的死亡将影响神经的再生。因此, 神经损伤后如何保护神经元是一项十分重要的课题。近年来研究表明, 各种原因导致的周围神经损伤, 脊髓前角运动神经元均出现不同程度的凋亡[1－3], 说明凋亡可能是引起神经元丢失、影响运动神经元再生和功能恢复的直接原因之一。因此, 神经损伤后, 如何保护濒临死亡的神经元, 减少或阻止神经元凋亡的发生, 已成为目前研究的热点之一。

bcl-2基因是调节细胞凋亡最基本的成员, 被认为是能够特异地抑制凋亡发生的“抗凋亡基因”。近年来的研究表明, bcl-2是中枢神经系统主要的神经保护性蛋白[4], 提高bcl-2的表达水平, 不仅可保护神经元对抗不同的损伤因素, 而且能促使哺乳动物神经系统轴突再生。研究bcl-2在神经系统退行性疾病和中枢神经再生的作用, 已取得了可喜的成绩[5,6]。这些研究表明, bcl-2的高表达可使神经元免遭发育期自然发生的死亡、保护因缺血或轴突切断而引发的神经元死亡, 还可以延缓神经退行性疾病的发生, 但其对周围神经再生的影响的报道很少。腺病毒(adenovirus, AdV)作为一种高效基因转移载体被广泛用于将外源基因导入哺乳动物细胞, 原因是腺病毒本身分子稳定, 基因组不会发生分子重排, 插入的外源基因也相当稳定, 不仅能感染分裂期细胞, 也可感染静止期细胞, 感染率几乎100%[7]。因此, 被认为是神经系统有效的基因转染载体, 为神经系统基因治疗带来了希望。同时, 它不与宿主基因组整合, 没有基因毒性, 比较安全。因此, 腺病毒在基因治疗与基因免疫中具有极大的应用前景[8]。本实验利用基因同源重组原理构建复制缺陷型重组腺病毒Ad/s-bcl-2、 Ad/as-bcl-2和Ad/lacZ, 分别介导bcl-2正义、反义cDNA和lacZ cDNA的转染, 通过腺病毒载体介导外源基因bcl-2的转染, 从正反不同的角度研究外源性bcl-2对坐骨神经切断损伤后脊髓运动神经元的保护作用。

1 材料和方法

1．1 材料试剂

重组人bcl-2正义(Ad/s-bcl-2)和反义(Ad/as-bcl-2)腺病毒载体以及含报道基因lacZ(Ad/lacZ) 的腺病

毒, 根据我们先前报道的制备方法[9], 病毒滴度分别为8.0×1010、 8.5×1010 和8.0×1010 pfu/ml。

地高辛标记试剂盒(SP6/T7)、抗地高辛抗体和碱性磷酸酶为Boehringer Mannheim产品, bcl-2单克隆抗体、生物素标记的马抗小鼠IgG和辣根酶标记的链亲合素购于北京中山生物技术有限公司, 细胞死亡原位检测试剂盒购于Roche Molecular Biochemical, 其余试剂为国产分析纯。

1．2 动物与动物模型

雄性SD大鼠取自我校实验动物中心, 体重160－200 g, 64只, 随机分成4组: Ad/s-bcl-2组、 Ad/as-bcl-2组、 Ad/lacZ组和生理盐水组, 每组16只。实验动物经戊巴比妥钠按30 mg/kg腹腔注射麻醉, 无菌条件下作左臀部斜切口, 显露坐骨神经, 距梨状肌下缘0.5 cm处将其切断, 用2－3针10-0无创缝线将神经外膜端端对线缝合。术中在不同组别, 动物于神经缝合处远端0.5 cm处分别注射Ad/s-bcl-2、 Ad/as-bcl-2、 Ad/lacZ和生理盐水。

1．3 动物固定、切片和染色

术后48 h、 7 d、 15 d和30 d动物再次腹腔注射麻醉, 常规灌注固定, 取脊髓L4－L6脊髓节段, 连续冰冻切片, 片厚30 μm, 漂片法[10]行bcl-2原位杂交和免疫组化染色。bcl-2 cRNA探针的制备: 将含hbcl-2基因的重组pcDNA/s-bcl-2质粒经限制性内切酶HindⅢ线性化后回收, 采用地高辛标记系统体外转录成含0.91 kb的bcl-2 cRNA探针。AChE染色按Karnovsky法[11]进行; X-gal染色方法参照文献[12]方法进行。TUNEL染色按试剂盒说明操作, 简述如下: 大鼠L4－L6脊髓冰冻切片厚约10 μm, 贴片; 用二甲苯脱脂2次, 每次5 min; 切片经100%、 95%、 90%、 80%、 70%系列乙醇入水, 均为2 min; 蛋白酶K(2 μg/ml 于0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0, 0.05 mol/L EDTA缓冲液中)消化15 min (37℃); 0.3% H2O2/甲醇封闭内源性过氧化物酶, 10 min, 室温; 加酶反应液 (10 μl TdT和90 μl含荧光标记dUTP脱氧核酸缓冲液) 37℃ 孵育2 h; 加POD 50 μl, 2 h, 37℃; 以上各步间均用0.01 mol/L PBS漂洗3次, 每次5 min; DAB显色, 苏木素复染; 脱水、透明、用中性树胶封片。对照实验: 在核酸缓冲液中不加TdT 酶, 其余步骤同上。随机挑选15个视野, 计数TUNEL阳性染色神经元数。

1．4 图像分析及统计处理

原位杂交、免疫组化以及乙酰胆碱酯酶(acetyl cholinesterase, AChE)染色后, 应用Tiger 920图像分析系统(重庆大学)根据染色的灰度确定同一标准, 测定染色阳性的神经元平均光密度值。对所测数据用单因素方差分析(ANOVA)和t检验进行差异显著性比较。取α=0.01, 数据用mean±SD表示。

2 结果

2．1 大鼠脊髓前角运动神经元外源基因lacZ的表达

脊髓漂片作X-gal组织学染色观察β-galactosidase marker gene的表达, Ad/lacZ组动物脊髓细胞中X-gal染成蓝色, 存在于双侧白质和灰质中, 主要在注射侧细胞胞浆中。胞体大、有轴突的脊髓前角运动神经元染色居多, 白质中的小细胞也有染色, 这些细胞具有胶质细胞形态。其它3组中脊髓神经元和胶质细胞未见染色。术后48 h X-gal染色就能检测到阳性染色的细胞, 术后7 d染色最深, 表明术后7 d外源基因在脊髓中表达达最高峰, 以后逐渐变淡(图1)。30 d时仅见极少染色。

图1. 细胞浆中的Ad/lacZ组脊髓X-gal染色的蓝色反应物

Fig. 1.X-gal staining of Ad/lacZ group shows that the blue reactivity substance exists in cytoplasm. The left photographs show the positive neurons and the right ones show the positive glia. The staining reached its peak on postoperative d 7 and then decreased gradually (×80).

2．2 脊髓前角运动神经元内bcl-2的表达

2．2.1 bcl-2 mRNA水平的表达

在bcl-2原位杂交染色阳性的脊髓运动神经元内可见蓝色颗粒密集在神经元胞浆中, 胞核中未见染色(图2)。图像分析统计结果见表1。Ad/s-bcl-2组脊髓前角运动神经元中4个时相点bcl-2 mRNA表达均较其它组高(P<0.01); Ad/as-bcl-2组神经元中bcl-2 mRNA的表达较其它组低 (P<0.01); Ad/lacZ组与生理盐水组间无显著性差异(P>0.01)。

图2.术后15 d的脊髓 bcl-2原位杂交染色

Fig. 2.bcl-2 level detected by in situ hybrization staining in spinal cord on postoperative d 15 in the four

experimental groups.

A: Group of Ad/s-bcl-2.

B: Group of Ad/as-bcl-2.

C: Group of Ad/lacZ.

D: Group of NS. (×80)

表1. 4组大鼠脊髓前角运动神经元bcl-2原位杂交染色平均光密度

Table 1. Average OD of the motoneurons in spinal cord antro-horn after bcl-2 in situ hybrid staining

Group	Postoperative time
Group	48 h	7 d	15 d	30 d
Ad/s-bcl-2	0.97±0.03*	1.09±0.05*	0.98±0.04*	0.85±0.03*
Ad/as-bcl-2	0.78±0.04#	0.72±0.02#	0.76±0.03#	0.77±0.03
Ad/lacZ	0.87±0.04	0.94±0.03	0.88±0.03	0.79±0.03
NS	0.89±0.03	0.97±0.04	0.90±0.04		0.80±0.04

*, there is a significant difference when compared with other three groups (P<0.01).

# , there is a significant difference when compared with other three groups (P<0.01).

The average OD of bcl-2 mRNA level in group Ad/s-bcl-2 is higher significantly than that of other three groups (P<0.01) at observed time points. The average OD of bcl-2 mRNA level in group Ad/as-bcl-2 is lower significantly than that of other three groups (P<0.01) at postoperative 48 h, 7 d and 15 d. There is not statistic difference between groups of Ad/lacZ and NS (P>0.01). n=30 neurons.

2.2.2 bcl-2蛋白水平的表达

切片经bcl-2免疫组化染色后, 可见免疫反应物质呈棕黄色密集于神经元胞浆中, 清晰可辨, 胞核中未见免疫反应物质。图像分析统计结果见表2, 4组大鼠脊髓运动神经元内bcl-2蛋白表达规律同其原位杂交结果。图3显示了术后7 d 4组脊髓bcl-2免疫组织化学染色照片。

图3.术后7 d的脊髓 bcl-2免疫组化染色

Fig. 3.bcl-2 level detected by immunohistochemical staining in spinal cord on postoperative

d 7 in the four experimental groups.

A: Group of Ad/s-bcl-2.

B: Group of Ad/as-bcl-2.

C: Group of Ad/lacZ.

D: Group of NS. (×80)

表2. 4组大鼠脊髓前角运动神经元内bcl-2组化染色平均光密度

Table 2. Average OD of motoneuron in spinal cord antro-horn after bcl-2 immunohistochemical staining

Group	Postoperative time
Group	48 h	7 d	15 d	30 d
Ad/s-bcl-2	1.12±0.04*	1.18±0.07*	1.13±0.06*	1.01±0.04*
Ad/as-bcl-2	0.87±0.02#	0.80±0.04#	0.85±0.03#	0.88±0.02
Ad/lacZ	0.98±0.04	1.09±0.03	1.01±0.04	0.91±0.06
NS	1.01±0.04	1.11±0.03	1.02±0.04	0.89±0.05

*, there is a significant difference when compared with other three groups (P<0.01).

# , there is a significant difference when compared with other three groups (P<0.01).

The average OD of bcl-2 protein level in group Ad/s-bcl-2 is higher significantly than that of other three groups (P<0.01) at observed time points. The average OD of bcl-2 protein level in group Ad/as-bcl-2 is lower significantly than that of other three groups (P<0.01) at postoperative 48 h, 7 d and 15 d. There is not statistic difference between groups of Ad/lacZ and NS (P>0.01). n=30 neurons.

2.3 脊髓前角运动神经元的凋亡

各实验组中, 在4组切片实验侧脊髓前角均检测到TUNEL阳性染色的凋亡神经元, 在正常侧和阴性对照组未见TUNEL染色阳性神经元。TUNEL阳性细胞最典型的特征为: 胞核固缩, 染色质边聚, 胞核染成棕黄色, 苏木素复染时正常的细胞核被苏木素染为蓝色(图4)。随机挑选15个视野, 计数TUNEL阳性染色神经元, 统计结果如表3。术后48 h就能检测到TUNEL阳性神经元, 但4个实验组无显著性差异(P>0.01), 术后7 d、 15 d时Ad/as-bcl-2组神经元凋亡发生率最高, Ad/s-bcl-2组神经元凋亡发生最少, 与Ad/LacZ组和生理盐水组间有显著性差异(P<0.01); Ad/lacZ组和生理盐水组间无显著性差异(P>0.01)。30 d时各组TUNEL阳性神经元极少。

图4.术后7 d的TUNEL染色

Fig. 4.TUNEL staining on postoperative d 7. The TUNEL positive neurons with brown-yellow nucleus (↑) stained by TUNEL following transection of sciatic nerve in adult rat, while the normal neurons were stained

blue after being restained by hematoxylin (↑) (×80).

表3. 脊髓TUNEL阳性神经元计数

Table 3. Numbers of TUNEL positive motoneurons in the spinal cord

Group	Postoperative time
Group	48 h	7 d	15 d	30 d
Ad/s-bcl-2	2.0±0.71	2.2±0.52*	1.4±0.54*	0.6±0.3
Ad/as-bcl-2	3.6±1.34	6.2±1.32#	4.6±1.21#	0.8±0.2
Ad/LacZ	2.4±1.14	3.6±1.34	3.2±0.83	0.6±0.3
NS	2.8±1.45	3.4±0.57	3.0±0.71	0.6±0.3

*, there is a significant difference when compared with other three groups (P<0.01).

# , there is a significant difference when compared with other three groups (P<0.01).

At postoperative days 7 and 15, the numbers of TUNEL positive neurons in group Ad/s-bcl-2 were significantly fewer than those of other groups (P<0.01); the numbers of TUNEL positive neurons in group Ad/as-bcl-2 were higher than those of other groups (P<0.01); the number of TUNEL positive neurons in group Ad/lacZ has not been different statistically with that of NS (P>0.01). n=15 sights.

2.4 脊髓前角运动神经元内AChE的表达

正常大鼠腰段脊髓前角外侧核大、中型神经元内AChE活性反应强烈, AChE活性反应位于胞质, 呈棕黄至棕红色, 细胞轮廓清楚核不着色。坐骨神经损伤后, 脊髓运动神经元内AChE不同程度的降低, 术后7 d, 4组均降到最低, 但Ad/s-bcl-2组降低程度低于其它组(P<0.01), Ad/as-bcl-2组降低幅度最大, 与其它组比有显著性差异(P<0.01), 生理盐水组和Ad/lacZ组无显著性差异(P>0.01)。以后各组神经元内AChE均有不同程度的增加, 30 d时Ad/s-bcl-2组恢复最好, 其AChE表达量与其它3组比有显著性差异(P<0.01), Ad/as-bcl-2组神经元恢复较差, 与其它3组比有显著性差异(P<0.01), 生理盐水组与Ad/lacZ组间无显著性差异(P>0.01)。图像分析统计结果见表4。

表4. 4组脊髓前角运动神经元AChE染色平均光密度

Table 4. Average OD of AChE staining in the spinal cord motoneurons

Group	Postoperative time
Group	48 h	7 d	15 d	30 d
Ad/s-bcl-2	1.18±0.03	0.97±0.06*	1.02±0.03*	1.24±0.05*
Ad/as-bcl-2	1.12±0.04	0.78±0.04#	0.81±0.06#	1.12±0.04#
Ad/lacZ	1.16±0.03	0.90±0.05	0.92±0.03	1.18±0.05
NS	1.17±0.02	0.89±0.03	0.93±0.04	1.17±0.04

*, there is a significant difference when compared with other three groups (P<0.01).

# , there is a significant difference when compared with other three groups (P<0.01).

At postoperative days 7,15 and 30, the average OD of AChE in group Ad/s-bcl-2 is significantly higher than that of other three groups (P<0.01); the average OD of AChE in group Ad/as-bcl-2 is significantly lower than that of other three groups (P<0.01). There is not statistic difference between groups of Ad/lacZ and NS (P>0.01). n=30 neurons.

3 讨论

提高神经系统基因治疗效果最关键的问题是建立有效的基因转染方法, 并使转染基因高效表达。基因转染方法分为物理、化学和生物三大类, 前两类是非病毒的方法, 生物方法是指病毒载体介导的基因转染。病毒载体介导的基因转染方法的特点是基因转染效率高, 已成为神经系统基因治疗应用最广泛且最有效的基因转染方法。由于逆转录病毒(retrovirus, RV)不感染分化成熟的神经元; 单纯疱疹病毒(herpes simple virus, HSV)最大的缺陷是裂解性感染和细胞毒性问题, 即使缺失型载体也有一定的毒性。因此, AdV在基因治疗与基因免疫中具有极大的应用前景[12]。

本实验利用基因同源重组原理构建复制缺陷型重组腺病毒Ad/s-bcl-2、 Ad/as-bcl-2和Ad/lacZ, 分别介导bcl-2正义、反义cDNA和lacZ cDNA的转染, 当坐骨神经切断缝合后在损伤远端分别注射重组腺病毒, 通过检测大鼠脊髓运动神经元中报道基因β-半乳糖苷酶的表达, 了解腺病毒介导外源基因在大鼠脊髓运动神经元中的表达规律。大鼠坐骨神经切断缝合后立即注射Ad/lacZ, 术后48 h就能在脊髓运动神经元中检测到β-半乳糖苷酶的表达, 7 d时达高峰, 以后开始降低, 术后1个月时仅能见到极少量的X-gal染色阳性细胞。以上结果表明, 在损伤周围神经处注射重组腺病毒能在CNS检测到外源基因的表达, 表明腺病毒载体能通过周围神经进入中枢, 并使外源基因在体内持续表达1个月左右。这样可避免CNS任何不必要的操作所造成的机械性损伤。我们的实验结果与Boulis[13]的一致。但Lou等[14]将重组LacZ基因腺病毒直接注入脊髓后, 发现其基因表达至少持续2个月, 这可能与具体实验条件有关。

利用TUNEL染色表明大鼠坐骨神经切断后脊髓运动神经元发生凋亡, 但坐骨神经损伤后立即在损伤神经内注入构建的Ad/s-bcl-2后, 脊髓运动神经元中bcl-2无论是mRNA水平还是蛋白水平的表达均显著性增高, 脊髓中凋亡的运动神经元明显减少; 而在Ad/as-bcl-2组, 神经元的凋亡发生率最高, 可能是由于封闭了神经元内源性bcl-2基因的表达, 从而增加神经元对损伤因素的易感性所致。有研究表明, bcl-2 mRNA在神经组织中的广泛表达可能是NTFs等因子促进神经元生存作用的一部分, 在神经网络的构建和神经元存活与死亡的调节等方面发挥重要作用, 对于某些细胞, bcl-2基因表达的降低往往是凋亡发生的第一步[15]。因此, 我们的实验结果与他们的一致。注入Ad/lacZ和生理盐水组, 两组脊髓发生凋亡的神经元数之间无显著性差异。结果表明, 脊髓神经元凋亡的减少是因为Ad/s-bcl-2使脊髓神经元过表达bcl-2所致。

周围神经损伤后, 部分神经元死亡而消失, 部分存活神经元出现不同程度的退行性变化, 如胞核偏位、粗面内质网解聚、溶酶体增多及一些酶的活性发生变化等。AChE与神经元内粗面内质网的结构和功能活动密切相关。神经损伤后, 神经元中的AChE活性减弱, 提示粗面内质网的数量减少和功能减退, 因此, 胞体中AChE的活性能反应坐骨神经损伤后神经元逆行变性的程度[16]。虽然Ad/s-bcl-2不能稳定AChE表达水平, 但它能使其活性降低的幅度减小, 同时加快其恢复; 而Ad/as-bcl-2使AChE活性显著性降低, 并延缓其恢复; Ad/lacZ组与NS组间无显著性差异。以上结果表明腺病毒载体介导bcl-2基因转染可显著性阻止神经元的逆行性变性, 而报道基因lacZ无此作用, 表明腺病毒介导bcl-2基因转染将可能是治疗运动神经元疾病的有效方法, 同时本文还从相反的方面得到同样的结论。Natsume等[1]研究也发现近端脊神经的损伤导致脊髓腹侧角的运动神经元死亡, 而这种死亡可被介导bcl-2基因转染的病毒载体阻断, 但bcl-2的过表达并不能稳定损伤侧ChAT的表达, 当同时注射bcl-2和GDNF的表达载体可稳定损伤侧ChAT的表达, 因此这可能为我们进一步的实验提供了新的思路。

周围神经损伤后神经元的存活是损伤神经修复与再生的基础, 干扰凋亡级联反应和促进神经元生存从而阻止因凋亡导致的死亡, 将是非常有效的治疗方法。bcl-2能使切断坐骨神经的大鼠脊髓运动神经元凋亡发生率显著降低, 神经元存活增多, 保护了损伤神经元, 进而促进神经的再生。可见通过控制神经元凋亡来治疗外伤性神经疾患是有可能的, 应用基因疗法作用于神经元的保护并促进神经再生, 可能给周围神经损伤带来

一种新的治疗手段。

参考文献

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