生理学报Acta Physiologica Sinica, August
研究论文
p38 MAPKα/β和ERK1/2在心肌缺氧预处理信号传递中的不同作用
黄轶峰, 龚开政, 张振刚*
扬州大学第二临床学院心血管内科, 扬州225001
摘要: 建立培养乳鼠心肌细胞的缺氧/复氧(A/R)损伤模型和缺氧预处理(APC)模型, 以细胞存活率、 细胞内超氧化物趋化酶(SOD)活性、 丙二醛(MDA)含量、 培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性作为反映心肌细胞损伤的指标。采用细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)抑制剂PD98059及丝裂素活化蛋白激酶p38α/β(p38α/β)阻滞剂SB203580干预模型, 并以胶内原位磷酸化法测定ERK1/2和p38 活性, 借以探讨ERK1/2和p38α/β 在缺氧预处理保护机制中的作用。结果表明: (1)在APC组, 于预处理的缺氧时相给予PD98059, 可以完全消除APC的延迟保护作用; 在A/R组的缺氧时相加入PD98059对细胞损伤无影响; (2)在APC组的预处理缺氧时相给予p38α/β 抑制剂SB203580并不能消除APC的保护作用, 而在A/R组的持续缺氧时相给予SB203580则可显著减轻缺氧对细胞的损伤; (3) ERK1/2和p38总活性测定表明, 缺氧可激活ERK1/2和p38, 它们的活性在缺氧后4 h时达到高峰, 而经过APC处理后, 两者活性高峰提前于缺氧后3 h时出现, 且峰值显著降低。上述结果提示, 预处理过程中ERK1/2的激活可能是缺氧预处理延迟保护机制中细胞信号传递的重要环节, 预处理阶段p38α/β 的活化不参与APC诱导的延迟保护信号传递过程, p38 的过度激活可能是缺氧/复氧损伤过程中的一个致损伤参与因素, 而预处理抑制随后持续缺氧阶段p38的过度激活可能是其保护机制的一个环节。
关键词:生理学; 心肌保护; 缺氧; 心肌缺血预处理; 丝裂素活化蛋白激酶p38; 细胞外信号调节蛋白激酶; 大鼠
中图分类号: Q463; R540.2
Different roles
of ERK1/2 and p38 MAPKα/β in cellular signaling during cardiomyocyte anoxia
preconditioning
HUANG Yi-Feng, GONG Kai-Zheng, ZHANG Zhen-Gang*
Department of Cardiology, The 2nd Clinical Medical College of Yangzhou University, Yangzhou, 225001
Abstract: Preconditioning (PC) exhibits earlier and delayed protection. But the mechanism of cellular signaling in delayed protection of PC remains unclear. We explored the roles of ERK1/2 and p38 MAPKα/β (p38α/β) in delayed protection of anoxia preconditioning (APC). The anoxia/reoxygenation (A/R) injury and APC models were established in cultured neonatal rat cardiomyocytes. An ERK1/2 inhibitor (PD98059) and a p38α/β blocker (SB203580) were applied and their effects on A/R and APC models were observed. The cellular contents of MDA, SOD, cell viability and LDH release was measured at the end of the study. ERK1/2 and p38 MAPK total activity was measured by
“in-gel” myelin basic protein phosphorylation assay at different points during sustained anoxia. The results obtained are as follows: (1) PD98059 (but not SB203580), administered in preconditioning anoxia phase in APC group, abolished completely the delayed protection of APC; (2) SB203580 administered in sustained anoxia phase in A/R group could relieve cell injury induced by anoxia, but not by PD98059; (3) the highest activity of ERK1/2 and p38 MAPK induced by anoxia appeared at 4 h after the beginning of sustained anoxia. APC inhibited the over activation of both ERK1/2 and p38 during the following sustained anoxia. These results suggest that ERK1/2 activation during preconditioning may be an important link of cell signal transduction in the mechanism of APC delayed protection. p38α/β activation at the preconditioning stage dose not participate in signaling of APC delayed protection. The excessive activation of p38α/β is possibly a key factor in mediating cell injury induced by sustained anoxia. The inhibition of p38α/β excessive activation during subsequent sustained anoxia might play a role in delayed protection mechanism of APC.
Key words: physiology; cytoprotection; anoxia; ischemic preconditioning, myocardial; extracellular
signal-regulated kinase; p38 mitogen-activated protein kinases
阐明缺血预处理(ischemic preconditioning, IPC)保护的细胞信号传递机制具有重要的生理学和病理学意义。预处理存在两个保护时相, 尽管早期保护和延迟保护可能具有相同的启动因子, 但两者的细胞信号转递机制不甚一致。我们曾在离体灌流心脏模型上观察到蛋白激酶C可能是IPC早期保护机制中细胞信号传递的共同通路[1]。由于应用培养心肌细胞缺氧预处理(anoxia preconditioning, APC)模型探讨预处理保护细胞信号传递机制具有很多优势, 我们进而应用该模型观察到蛋白激酶C可通过激活丝裂素活化蛋白激酶家族(mitogen- activated protein kinase, MAPK)中的细胞外信号调节激酶(p42/p44 extracellar signal-regulated protein kinase, ERK1/2)参与缺氧预处理延迟保护机制的信号传递[2]。近年来, p38 MAPKα/β (p38 MAPKα/β) 在预处理早期保护机制中的作用受到了一些学者的关注[3,4], 但其在预处理延迟保护机制的作用, 以及在同一模型中与ERK1/2比较的报道较少, 因此本文对此进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 材料
Sprague-Dawley (SD)系乳鼠由扬州大学实验动物中心提供, PD98059、 SB203580、 p38多克隆抗体、 多粘菌素B(polymysin B, PMB)、 髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)、 cAMP依赖性蛋白激酶抑制剂(序列为TTTAAPIASGATGAAAAIHA的多肽片段)、 leupeptin等购自美国Sigma公司, [γ-32P]ATP购自杜邦公司, 超氧化物趋化酶(superoxide diamutase, SOD)、 丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所, 其它试剂均为市售分析纯。 760型自动生化分析仪(日本日立公司), PERKIN-ELMER型液闪计数仪(美国Trilux公司)等。
1.2 复制模型
原代心肌细胞培养及APC模型的制作参照先前报道的方法[2]。即取出生后1－2 d乳鼠心尖部组织, 胰酶消化, 离心后用含20%小牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液, 过滤, 按差速贴壁分离法纯化心肌细胞, 以1×105 cells/cm2接种于24孔板, 每24 h更换培养液。贴壁生长2 d, 于实验前24 h更换为无血清DMEM培养基, 随机分组, 每组双平行孔, 重复4次操作。缺氧/复氧(anoxia/reoxygention, A/R)模型的制作: 首先将培养基用N2在密闭容器中平衡1 h以上制成无氧培养基, 将培养孔中含氧培养基吸出后加入无氧培养基, 随后将培养板置于含5% CO2-95% N2 (V/V)混合气体的密闭容器中(37℃)进行缺氧孵育10 h, 此为缺氧操作, 然后更换为与O2平衡的培养基, 放回培养箱, 复氧孵育1 h。APC模型的制作: 预先给予1次2 h缺氧孵育, 24 h后按A/R操作。
1.3 观察及检测指标
1.3.1 反应心肌细胞损伤指标的检测
采用台盼蓝染色法计算细胞存活率; SOD活性及MDA含量的测定按试剂盒操作说明进行; LDH活性采用全自动生化分析仪测定。
1.3.2 ERK1/2和p38总活性测定
采用考马斯亮蓝法测定样品蛋白质含量, ERK1/2活性的测定采用李田昌等的方法[5]; p38活性测定: 收集培养的心肌细胞, 制备MAPK粗提液, 加入p38多克隆抗体于4℃孵育1 h ,再加入含有protein A的sepharose继续冰上震荡孵育45 min, 经免疫沉淀的蛋白质重悬后制备成 p38提取液。将p38提取液分别溶于等体积的SDS样本缓冲液, 上样(15 μg protein/lane), 进行10% SDS-PAGE电泳, 其中, 分离胶内含有3%(w/v)的GST-ATF-2。电泳结束后用含有20% 2-propanol的50 mol/L Tris/HCI (pH 8.0)冲洗胶板。去除胶板后, 用6 mol/L的胍乙啶盐酸(guanidine/HIC)在室温条件下使p38变性; 再以含有0.04% Tween 40和5 mmol/L的2-巯基丙醇的50 mmol/L Tris/HCI (pH 8.0)的复性液孵育。恢复激酶活性的凝胶在室温下以激酶反应液[mmol/L: HEPES 40.0 (pH 7.4)、 MgCI2 5.0、 2-巯基乙醇2.0和EGTA0.1] 孵育10 min, 然后加入20 μmol/L ATP, 1.85 MBq [γ-32P]ATP启动磷酸化反应, 然后进行放射自显影, 切下相应凝胶置于液闪液中过夜, β液闪计数, 测定32P的放射活性, 单位定义为1 min每毫克蛋白质32P的掺入量[pmmol/(mg·pro·min)][6,7]。
1.4 设计分组
(1)对照组: 取培养箱内持续孵育的细胞不作任何缺氧处理; (2) A/R组, 操作见前述; (3) APC组: 操作见前述; (4) APC+PD98059组: 操作同APC组, 但在APC缺氧前10 min加入PD98059(终浓度50 μmol/L)至预处理缺氧结束; (5) APC+SB203580组: 操作同APC组, 但在APC前10 min先加入SB203580 (终浓度15 μmol/L)至预处理缺氧结束; (6) A/R+PD98059组: 操作同A/R组, 但在缺氧前10 min加入PD98059(终浓度50 μmol/L)至缺氧结束; (7) A/R+SB203580组: 操作同A/R组, 但在缺氧前10 min加入SB203580(终浓度15 μmol/L)至缺氧结束。实验终点统一取材分别测定各组细胞存活率、 LDH活性、 MDA和SOD含量。
1.5 ERK1/2及p38总活性检测时间
按前述方法分别检测A/R组及APC组在持续缺氧后1、 2、 3、 4、 6、 8 h各时间点ERK1/2及p38总活性。
1.6 统计学处理实验结果各指标以mean±SD表示, 采用SPSS 10.0软件进行统计学处理。以P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 ERK1/2及p38α/β 在APC保护机制中的作用
由表1可见, A/R组的细胞存活率及细胞SOD含量低于对照组(P<0.05), LDH漏出和细胞MDA含量均高于对照组(P<0.05)。APC组SOD及细胞存活率高于A/R组(P<0.05), LDH活性和MDA含量均低于A/R组(P<0.05),但与对照组比较无差别。当加入ERK1/2阻滞剂PD98059后, APC+PD组的细胞存活率、 胞内SOD含量低于APC组, MDA含量及LDH则多于APC组及对照组(P值均小于0.05), 且各指标与A/R组比较无差别(P值均大于0.05); A/R+PD组与A/R组比较无差异, 而与对照组比较仍可见明显的缺氧复氧损伤, 差异显著(P值均小于0.05)。在APC+SB组, 于预处理缺氧阶段加入了p38α/β 特异性抑制剂SB203580, 与APC组及对照组比较各细胞损伤指标无明显变化。在A/R+SB组, 于持续缺氧阶段加入SB203580, 该组细胞存活率及细胞内SOD含量显著高于A/R组(P值均小于0.05), LDH漏出及MDA含量均低于A/R组
表1. 各组间心肌细胞损伤的比较
Table 1. Comparison of cardiac myocyte injury indexes between groups (mean±SD, n=8)
|
Group |
Percentage of viable cells (%) |
LDH activity(U/L) |
MDA content(nmol/mg protein) |
SOD activity(U/L) |
|
Control |
91.0±4.7 |
86.3±15.7 |
0.41±0.19 |
16.3±2.2 |
|
A/R |
43.8±8.1# |
233.8±38.9# |
1.55±0.27# |
6.7±1.4# |
|
APC |
83.4±4.6 |
95.1±12.0 |
0.32±0.12 |
14.7±2.1 |
|
APC+PD |
50.4±6.1 |
251.7±38.2 |
1.33±0.40 |
5.9±2.1 |
|
APC+SB |
81.8±4.0 |
105.8±22.0 |
0.41±0.19 |
15.1±2.5 |
|
A/R+PD |
41.1±5.1# |
257.9±44.6# |
1.50±0.30# |
7.1±1.4# |
|
A/R+SB |
79.1±5.7 |
109.2±20.9 |
0.47±0.22 |
15.6±2.1 |
The results are expressed as means±SD for two wells in every group for four times (n=8).
#P<0.05 vs contorl group;
P<0.05 vs A/R group;
P<0.05 vs APC group;
P<0.05 vs A/R group.
A/R, anoxia/reoxygention;
APC, anoxia preconditioning;
PD, PD98059; SB, SB203580.
(P值均小于0.05), 与APC组、 APC+SB组和对照组比较各指标均无显著性差异(P>0.05)。
2.2 缺氧对培养心肌细胞内ERK1/2与p38活性的影响
由图1、 2可见, 持续缺氧可使ERK1/2和p38明显激活, 其峰值出现于缺氧后4 h。而预先经过缺氧预处理后, 随后持续缺氧引起的ERK1/2和p38激活受到明显抑制, 且峰值提前于缺氧后3 h。
图1.APC与A/R组持续缺氧过程中ERK1/2活性比较
Fig. 1.Comparison of ERK1/2 activities during sustained anoxia between A/R and APC groups.
The maximal ERK1/2 activities in A/R group and APC group occurred at 4 and 3 h after anoxia, respectively. Their activities gradually declined thereafter. Each point represents means±SD for two wells in each group for 3 times (n=6).
**P<0.001,
*P<0.01.
图2.APC与A/R组持续缺氧过程中 p38总活性比较
Fig. 2.Comparison of p38 activities during sustained anoxia between A/R and APC groups. The peak activity was observed at 4 h point after anoxia in A/R group and at 3 h point after anoxia in APC group. Every point represents means±SD for two wells in each group for 3 times (n=6).
*P<0.05,
**P<0.01.
3讨论
缺血预处理作为一种内源性适应性心肌细胞现象受到国内外学者的重视。近年研究观察到, 除缺血外, 缺氧、 热应激和某些药物等多种刺激均可诱导启动这一保护现象, 并由此建立起不同的研究模型, 它们在机制上有很多类似, 因此通过对不同预处理模型的观察, 极大促进了对这种内源性保护机制的认识。本研究应用培养心肌细胞缺氧预处理模型, 可排除在体时神经体液等因素的影响, 有利于观察这种内源性保护细胞内固有的信号传递机制。预处理存在早期保护及延迟保护两个时相, 尽管早期保护和延迟保护可能具有相同的启动因子, 但两者的细胞信号传递机制不甚一致。我们曾观察到, 蛋白激酶C可能是预处理早期保护信号传递的共同通路, 且可通过激活ERK1/2参与延迟保护机制, 从而建立起预处理早期保护和延迟保护在机制上的联系。近来有资料观察到, 除ERK1/2外, 在丝裂素活化蛋白激酶家族中, p38α/β也可能是预处理早期保护蛋白激酶C下游的信号传递物质, 但p38α/β在延迟保护中的作用以及与ERK1/2的关系尚不清楚。
本实验观察到, 在预处理的缺氧过程中加入ERK1/2抑制剂PD98059可阻断预处理延迟保护作用, 提示预处理阶段ERK的活化是预处理延迟保护机制中细胞信号传递的重要环节, 这与我们先前报道相一致[2]。
p38包括四种同工酶。对预处理早期保护机制的研究观察到, p38α/β可能与预处理机制有关。有资料报道, 通过茴香霉素(anisomysin)激活p38α/β可诱导出预处理的早期保护作用, 而用SB203580抑制预处理阶段p38α/β的激活可完全阻断预处理早期保护, 提示p38α/β的激活是预处理早期保护机制的重要环节[8－10]。但关于p38α/β在延迟保护机制中作用的研究资料较少。本研究观察到, 在缺氧预处理过程中加入p38α/β 抑制剂SB203580, 未能消除预处理后的延迟保护作用。Punn等[11]应用缺血预处理模型也观察到, 仅在预处理期采用SB203580抑制p38α/β的激活并不能阻断预处理的延迟保护。这些资料提示, 虽然预处理阶段p38α/β激活可能参与预处理的早期保护机制, 但其在这一阶段的激活并不参与预处理的延迟保护机制, 预处理早期和延迟保护机制的细胞信号传递机制不完全相同。
图1、 2显示, 持续缺氧使心肌细胞内ERK1/2和p38显著激活, 并随着缺氧时间的延长两者活性逐步升高, 在缺氧后4 h时达到高峰。进一步观察到, 在进行缺氧/复氧损伤过程中, 于持续缺氧阶段给予PD98059抑制ERK的激活不能减轻细胞损伤, 但如果在这一过程中应用SB203580抑制p38α/β的过度激活可显著减轻持续缺氧所致的细胞损伤, 且与预处理的保护强度无明显差别。Ma等[4]研究也发现于损伤性缺血前及再灌早期给予SB203580可减轻再灌后的心肌坏死, 改善心功能。这些结果提示p38α/β在持续缺氧过程中的过度激活可能是缺氧/复氧损伤的一个参与因子, 而ERK1/2在持续缺氧过程的活化与缺氧损伤无直接关系。图1、 2还显示, 缺氧预处理也可显著抑制后继持续缺氧引起的p38过度激活。综合资料提示缺氧预处理抑制随后持续缺氧阶段p38的过度激活可能是其保护机制的一个环节。但持续缺氧阶段p38过度激活的抑制是否与预处理阶段ERK1/2的活化有直接关系, 即在ERK1/2下游的信号传递过程中, 是否是最终通过抑制后续缺氧过程中p38的过度激活而达到预处理保护作用, 这一问题尚需进一步研究。相关资料提示, 丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶(mitogen-activated protein kinase phosphotase,MKP)可通过去磷酸化作用使p38失活, 应用PMA (一种PKC兴奋剂)刺激鼠心肌细胞可诱导MKP的激活和表达, 而该作用可被ERK1/2抑制剂PD98059完全抑制[12], 提示ERK1/2的激活可诱导MKP 的表达增强, 从而抑制p38的过度激活。
参考文献
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