生理学报Acta Physiologica Sinica,   August 

研究论文

刺激鲫鱼小脑腹外侧区诱发的Mauthner细胞兴奋性突触后电位

张英才*, 张淑华, 李效义,  童学红, 虞芬,  张茂先

首都医科大学生理学教研室,  北京 100054

 

摘要: 实验采用微电极胞内记录技术探查鲫鱼Mauthner细胞(M-细胞)对小脑刺激的电反应特征。电刺激鲫鱼小脑腹外侧部, 可在双侧M-细胞胞体、 腹侧树突和外侧树突近端记录到一种复合性兴奋性突触后电位(小脑诱发性EPSP)。小脑诱发性EPSP潜伏期较短(0.63±0.09   ms), 持续时间较长 (5.49±1.13   ms),  幅度分级和刺激频率依从等特征。以较高强度刺激小脑常引起M-细胞顺向激活。多点胞内连续穿刺实验显示小脑诱发性EPSP起源于腹侧树突远端。实验结果提示,  小脑-M-细胞通路可能包含一组长短不等的神经元链,  它们根据链的短或长,  由近及远依次投射在腹侧树突远端。

 

关键词: Mauthner细胞;  小脑;  兴奋性突触后电位;  腹侧树突;  鲫鱼

                                                                                  

中图分类号: Q429+.92

 

Excitatory postsynaptic potential evoked by stimulation of the ventrolateral region of the cerebellum

in crucian carp Mauthner cell

ZHANG Ying-Cai*,  ZHANG Shu-Hua,  LI Xiao-Yi,  TONG Xue-Hong,  YU Fen,  ZHANG Mao-Xian

Department of Physiology,  Capital University of Medical Sciences,  Beijing 100054

 

Abstract: In the present experiments,  the characteristics of the electrical responses to stimulation of the cerebellum in crucian carp Mauthner cell were explored with microeletrode intracellular recording technique. A composite excitatory postsynaptic potential (cerebellum-evoked EPSP) could be induced from  the soma,  the ventral dendrite and the proximal end of the lateral dendrite in crucian carp Mauthner cell (M-cell) on either side by stimulation of the ventrolateral region of the cerebellum. The cerebellum-evoked EPSP presented characteristics of relatively short latency (0.63±0.09   ms),  longer duration (5.49±1.13   ms),  graded amplitude and dependence on stimulation frequency. Stimulation of the cerebellum with higher intensity always activated the M-cell orthodromically. Multiple intracellular recordings showed that the cerebellum-evoked EPSP originated in the distal end of the ventral dendrite. The results suggest that the cerebellum-M-cell pathway is probably composed of a group of neuron chains with different numbers of synaptic relays projecting to the distal end of the ventral dendrite in order of length of the chains.

 

Key words: Mauthner cell; cerebellum; EPSP; ventral dendrite; crucian carp

 

Mauthner 细胞(M-细胞)是硬骨鱼类延髓内的一对特殊神经元。其巨大的胞体(直径达100 μm),  两条长而粗大的树突外侧树突和腹侧树突(起始端直径可达50 μm,  长约500－600 μm),  包绕轴突始段的致密结构轴突帽,  以及胞体-树突膜不具备主动生成动作电位能力的特殊膜特性,  使其成为研究脊椎动物中枢神经元的极佳模型。特别是利用M-细胞可以在胞体、树突等部位实现精确定位的多点胞内记录,  更使其成为研究不同类型突触功能的理想标本[1－3]。

M-细胞接受多种感觉输入[4,5], 发动惊跳反射。这是某些鱼类和两栖类逃避伤害刺激的重要活命反射。惊跳反射并非各种感觉传入引起的随机的偶然性动作,  而是具有明确逃脱方向的高度整合活动[6]。M-细胞作为惊跳反射中枢,  其功能必然受到高位中枢调控。鱼类小脑是调节运动反射的重要中枢,  Bartelmez根据其银染切片曾报告M-细胞和小脑之间可能存在纤维联系[7], 但仍缺少确定性形态学证据。而小脑与M-细胞之间是否存在功能联系迄今未见报道。

本工作报告电刺激鲫鱼小脑腹外侧区域可在M-细胞诱发兴奋性突触后电位(EPSP), 并可使M-细胞顺向激活,  为小脑和M-细胞之间存在功能联系的设想提供了实验支持。

 

1  材料和方法

实验用鲫鱼,  体长12－15 cm, 用2%乌拉坦溶液浸泡麻醉,  待鱼体翻倒后,  采取背-腹直立位或左侧斜位固定[8]于鱼槽,  用含有0.3%乌拉坦的自来水经口灌流鳃部,  维持呼吸。肌肉注射三碘季铵酚(1 μg/kg体重)制动。

用常规手术方法暴露鲫鱼延髓和脊柱[1], 将小脑向嘴侧翻转,  使腹面向上,  用吸水纸条将翻转的小脑向嘴侧牵引并固定。用双极电极刺激脊髓,  以逆向激活M-细胞轴突。刺激参数: 波宽30 μs,  强度4－8 V, 重复刺激间隔700 ms。在逆向激活M-细胞的同时在延髓用灌注0.6 mol/L   K2SO4的玻璃微电极( 尖端直径1 μm , 5－10 MΩ)探查其胞外逆向动作电位。常规将逆向动作电位幅值达到20－40   mV的记录点作为M-细胞轴突帽中心。将微电极从轴突帽中心点再向外移动50 μm,  以穿刺M-细胞胞体[1]。微电极准确刺入M-细胞胞体的指标是静息膜电位在75－85 mV的范围内保持相对稳定;动作电位的阈值和潜伏期与胞外逆向动作电位相同,  其幅值在30 mV 以上且高于除轴丘以外的其他记录点。读取胞体记录点的三维坐标,  并以此为参照点计算出其他记录点与胞体间的距离[8]。在微电极稳固刺入胞体的情况下,  停止刺激脊髓,  改用微小双极刺激电极(极间距离0.5－1 mm), 以单个脉冲(波宽40  μs,  强度15－60 V)刺激小脑腹外侧部,  同时记录M-细胞反应。适当调整小脑刺激电极位置,  以寻找出较低刺激强度能引起较大反应的刺激点,  然后将刺激电极牢固固定。

为探查EPSP在M-细胞上的空间分布状况,  本工作还在M-细胞腹侧树突和外侧树突上进行了连续多点胞内记录[8]。

实验结果由MacLab/4e生理信号处理系统记录、  储存和分析。

 

2  结果

以波宽为40  μs、  强度为15－60 V的单个脉冲刺激同侧或对侧小脑腹外侧区,  可在M-细胞胞体,  腹侧树突或外侧树突近端记录到一种复合性兴奋性突触后电位(小脑诱发性EPSP)。该EPSP以一尖峰形的快速去极化电位开始,  后继以持续时间较长、  变化较缓的去极化波,  其上还叠加有多个幅度和数目不等的尖峰形电位波动,  构成典型的复合EPSP轮廓(图1A2、 A3、 B1)。但其形状常有变化,  常见尖峰波的降支与后继成分重叠,  致使两者趋于融合(图1A1)。

图1.小脑诱发性EPSP

Fig. 1.Cerebellum-evoked EPSP. 

A: Stimulation of the cerebellum at the indicated intensities induced a graded EPSP. Note that,  in A1 (superimposed recording),  the M-cell was activated in one sweep. Recording site: 344.7  μm from the soma. Calibration: 4 mV,  2 ms.

B:  EPSPs evoked by repetitive cerebellum stimulation at the indicated intervals. Note that a maximal EPSP was induced when the stimulus interval was 500 ms and that the late components were almost completely abolished when the interval was 50 ms whereas the initial peak-like potential was still presented even though it was markedly reduced. Stimulation intensity: 30 V. Recording site: ventral dendrite 57.3 μm from the soma. Calibration: 2 mV,  2 ms.

 

2.1 小脑诱发性EPSP的特征

  刺激同侧或对侧小脑诱发的EPSP并无明显差别。

2.1.1 潜伏期

平均潜伏期为0.63±0.09 ms (n=27), 变动范围在0.48－0.77 ms之间。同一个M-细胞其潜伏期随着刺激强度的提高而略有缩短。不同细胞潜伏期的差异除个体因素外,  刺激位置的变动可能是原因之一。

2.1.2 幅度分级特性

在一定范围内,  随着小脑刺激强度的增加,  复合EPSP的幅度也相应提高。如图1A所示,  30 V刺激时引起的反应幅度仅为1.9 mV, 初始尖峰波之后的去极化慢波低矮,  其上只叠加有一个较明显的尖峰形电位,  反应持续时间仅为2.3 ms (图1A3);  刺激强度提高到50 V时,  初始尖峰波和后继慢波的幅度均明显增加,  反应持续时间延长,  叠加的尖峰波数目也增多(图1A2);  刺激强度增加到60 V或更高时,  反应幅度达到最大值,  其峰值达8.3 mV, 反应持续时间超过9 ms (图1A1)。

在胞体处记录的最大反应平均幅度为8.25±3.80 mV (n=23),  反应持续时间为5.49±1.13 ms (n=25)。较强刺激在诱发高幅度EPSP的基础上,  常引起M-细胞顺向激活。动作电位可发生在早期尖峰电位的基础上(图1A1), 也可出现在后继反应的某一时期。

2.1.3 对刺激频率的依从性

在刺激强度保持不变的情况下,  较高频率的重复刺激使反应明显衰减。实验中依次使用间隔为10 s－20 ms各种频率的重复脉冲刺激小脑,  发现使用间隔为500 ms以上的重复刺激诱发的EPSP能在数小时的实验过程中保持稳定,  刺激间隔小于500 ms的较高频率重复刺激使诱发 EPSP的幅度明显衰减。如图1B所示,  重复刺激间隔由500 ms缩短为200 ms和50 ms时, 波幅由稳定反应时的3.3 mV(图1B1)降低为2.5 mV (图1B2)和1.7 mV (图1B3), 分别衰减了24.2%和48.5%。从图1B还可看出,  与初始尖峰形电位相比较,  复合EPSP的迟发反应成分对较高频率的重复刺激更敏感。高频率刺激下,  迟发反应成分衰减,  致反应持续时间缩短。如图1B2、B3,  重复刺激间隔为200和50 ms时,  诱发EPSP的持续时间由稳定反应时的5.9 ms (图1B1)分别缩短为2.4 ms和1.4 ms。刺激间隔在50 ms时,  迟发反应成分几乎完全消失,  而初始的尖峰形电位虽有衰减却依然存在。

较高频率重复刺激引起EPSP衰减的现象是可逆性的。经过短时间休息后,  适宜间隔的重复刺激仍能引起稳定的正常反应,  提示高频刺激下EPSP衰减可能是由于突触传递疲劳。

为了获得稳定的反应,  在本文报告的其他各项实验中,  小脑重复刺激间隔均保持为3 s。

2.2  小脑诱发性EPSP在M-细胞上的分布

将记录电极从胞体逐渐移向腹侧树突远端时,  小脑诱发性EPSP的幅度也逐渐增大,  接近腹侧树突末端时,  EPSP的幅度达到最大值。电极从胞体沿外侧树突方向移动时,  EPSP的幅度逐渐降低。图2是在一个M-细胞上得到的结果。

图2.M-细胞小脑诱发性EPSP和逆向动作电位的多点胞内记录

Fig. 2.Multiple intracellular recordings of cerebellum-evoked EPSP and antidromic action potential from a  M-cell. Demonstration of the cerebellum-evoked EPSPs (A) and the antidromic action potentials (B) recorded at 7 points of  ventral dendrite (VD1－3),  soma and lateral dendrite (LD1－3),  of the M-cell. The numbers on the left indicate the distance in  μm from the soma. Stimulation intensity: 60 V. Calibration: 10 mV,  2 ms.

 

本次实验分别在腹侧树突上9个点和外侧树突上11个点进行了稳定的胞内记录。A组曲线是在其中7个点记录的小脑诱发性EPSP。其幅度在胞体处为 7.0 mV, 距胞体542.8 μm的腹侧树突远端, 其幅度增加为16.2 mV, 增加了131.4%;  在外侧树突上,  愈远离胞体幅度愈低,  距胞体401.8  μm处幅度降至0.9 mV,  衰减了87.1%。B组曲线是在A组各曲线同一位置上记录的M-细胞逆向动作电位。其正常形状是M-细胞具有良好机能状态的指标,  其幅度由胞体沿两个树突方向逐渐衰减, 形象地反映了记录电极逐渐远离了胞体。

小脑诱发性EPSP在腹侧树突上的分布还表现出另一种特征,  即记录电极愈接近该树突远端,  反应中迟发成分幅度的增长愈明显。迟发成分幅度的增加可表现为反应持续时间延长和/或峰潜伏期延长。如图2A中胞体处(0 μm)反应持续时间为5.3 ms,  峰潜伏期为0.8 ms,  在腹侧树突距胞体542.8 μm处,  反应幅度明显增大的同时,  反应持续时间延长到8.7 ms以上,  峰潜伏期也延长为2.4 ms。

图3.小脑诱发性EPSP和逆向动作电位在M-细胞上的分布

Fig. 3.Plots of the amplitude (ordinate) of the cerebellum-evoked EPSP (О) and the antidromic action potential(●) as a function of the distance (abscissa) from the soma.

A: From the same experiment shown in Fig.2;

B: Averaged plots from 20 experiments of multiple intracellular recordings.  Amplitudes of the cerebellum-evoked EPSP and the antidromic action potential are expressed as percentages of values measured at the soma. Abscissa is scaled with 50 μm steps. Each point centered at  the indicated step represents an average of all percentage values within that step. For all points but the extreme in the ventral dendrite,  4≤n≤20.

 

图3显示小脑诱发性EPSP和逆向动作电位在M-细胞胞体和两个树突上的空间分布状况。图3A根据图2实验的全部穿刺结果标绘,  图3B根据20个M-细胞多点胞内连续穿刺实验的平均结果标绘。两图呈现相似的空间分布趋势。

 

3  讨论

Bartelmez 曾根据其银染切片报告,  有小脑纤维到达M-细胞腹侧树突周围网[7], 但难于确定这些纤维是抵达还是经过M-细胞。关于这些纤维的生理学研究迄今亦无报道。本工作采用电生理学方法考查了小脑和M-细胞之间是否存在功能联系,  结果发现: (1)电刺激小脑腹外侧部可诱发M-细胞产生一种潜伏期较短、  持续时间较长的兴奋性突触后电位(小脑诱发性EPSP);  (2)小脑诱发性EPSP是一种复合电位,  具有明显的幅度分级特性,  较高的刺激频率使其显著衰减;  (3)在以较高强度刺激小脑诱发高幅度EPSP的基础上常会引起M-细胞顺向激活;  (4)小脑诱发性EPSP起源于M-细胞腹侧树突远端。

引起小脑诱发性EPSP的刺激区域只局限于小脑腹外侧部的很小范围。将刺激电极从有效刺激点移开1－2 mm将使反应大大降低, 或完全不发生反应。这提示反应不是电流扩散至其他脑区域引起的。我们进行的如下实验进一步排除了电流扩散引起伪差的可能性: 将小脑在基部切断,  但保留在原位,  尽管小脑与其他脑部位的接触关系无变化,  刺激也不再能引起EPSP反应。

Bodian和Nakajima[9,10]曾对 M-细胞的光镜和电镜结构进行过系统研究。他们报告,  在金鱼的腹侧树突, 广泛存在小型有髓棒状末梢和大型囊泡状终扣,  它们都与腹侧树突构成电和化学的混合突触。本工作发现,  小脑诱发性EPSP以耐受高频刺激的早期尖峰形去极化电位开始,  继以时程较长、  变化较缓的去极化波,  其上叠加有尖峰形电位。这些特点也提示, 由小脑抵达M-细胞的纤维通路上必定有电突触和化学突触中介。

小脑诱发性EPSP的平均潜伏期为0.63 ms, 其变动范围在0.48－0.77 ms。本实验小脑刺激电极至M-细胞的直线距离约4－5 mm。据此估计,  小脑－M-细胞通路上冲动传导时间至少费时0.2   ms, 则跨突触时间约为0.3－0.6   ms。  考虑到传递过程可能有电突触中介,  则小脑和M-细胞之间的最短通路可能由单或双突触构成。而EPSP的幅度分级特性,  较强刺激引起的反应具有较长的持续时间,  以及早期反应和晚期反应对重复刺激的敏感性不同等特点则提示小脑－M-细胞通路可能由一组神经元构成。细胞池内各神经元的阈值和传导速度不同,  它们经过数目不等的突触接替后到达M-细胞。较弱刺激强度下,  短链通路首先活化,  引起的反应潜伏期短,  持续时间短。随着刺激强度的提高,  将有愈来愈多的长链通路被募集,  反应持续时间也相应延长。

小脑诱发性EPSP在空间分布上有两个主要特征: (1)腹侧树突远端幅度最高;  (2)腹侧树突远端迟发反应成分的幅度增长更明显。这表明小脑纤维投射于腹侧树突远端,  此外似乎还提示小脑－M-细胞网络在腹侧树突上的有序排列: 依神经链的短或长,  由近及远依次排列。愈是长链通路,  其投射点愈靠近腹侧树突远端。

根据图3A、B所示的逆向动作电位幅度从胞体沿腹侧树突和外侧树突方向逐步衰减的空间分布曲线, 可测出电紧张电位沿两树突在离心方向上扩布的空间常数分别约为400和279 μm,  均接近其他作者报告的数值[3,11]。而依据图中EPSP从腹侧树突远端沿腹侧树突－胞体－外侧树突方向衰减的分布曲线测算,  腹侧树突在向心方向的空间常数远远超过500 μm,  与其他作者报告的数值有很大差别[3]。可以认为,  图中小脑诱发性EPSP在腹侧树突上沿向心方向减幅缓慢,  致使按图估测的空间常数(实为效应空间常数effective space constant)增大的现象可能与小脑纤维在腹侧树突远侧的投射范围相对广阔而非灶样集中于一狭小区域的空间分布特点有关。

本工作初步证明小脑和M-细胞之间存在功能联系,  但这种联系的生理意义尚有待探讨。许多作者认为,  M-细胞除了作为活命中枢接受各种感觉输入发动惊跳反射外,  还与快速游泳时的急速转弯,  向猎物发动攻击,  突然转向同类等行为有关[12]。在某些鱼类的M-细胞还会产生自发放电[13]。由此可以设想,  小脑作为重要的运动调控中枢,  在调节M-细胞的兴奋水平,  甚至直接激活M-细胞,  产生“主动的”惊跳反射方面可能有重要作用。

 

参考文献

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