生理学报Acta Physiologica Sinica, August

研究论文

外源性重组人睫状神经营养因子抑制成人成肌细胞的体外分化

陈晓萍, 刘红, 刘淑红, 吴燕, 吴海涛, 范明*

军事医学科学院基础医学研究所, 北京 100850

摘要: 为探讨外源性重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)在成肌细胞分化中的作用, 实验观察了0－10 ng/ml rhCNTF 对成人成肌细胞体外分化的影响。结果表明, 与对照组相比, 2.5－10 ng/ml rhCNTF 能显著抑制成肌细胞的体外分化(P<0.01), 并呈量-效依赖关系, 且这种抑制作用是可逆的。Western Blot分析提示, 这种抑制作用伴有成肌细胞分化期特异标志myogenin和p21表达量的显著降低(P<0.01), 以及成肌细胞增殖期特异标志myf5和desmin表达量的显著增加(P<0.01)。因此可以认为, 外源性rhCNTF能可逆地抑制成人成肌细胞的体外分化并保持增殖。

关键词: 重组人睫状神经营养因子; 成肌细胞; 分化; 增殖

中图分类号: Q78

Exogenous rhCNTF inhibits myoblast differentiation of skeletal muscle of adult human in vitro

CHEN Xiao-Ping, LIU Hong, LIU Shu-Hong, WU Yan, WU Hai-Tao, FAN Ming*

Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850

Abstract: To determine the role of recombinant human ciliary neurotrophic factor (rhCNTF) in myogenesis, we observed the effects of rhCNTF (0－10 ng/ml) on myoblast differentiation of adult human in vitro. The results showed that compared with the control group, the groups of 2.5－10 ng/ml rhCNTF treatment significantly inhibited myoblast differentiation (P<0.01), and the inhibition was dose-dependent and reversible. Western blots also indicated that compared with the control group, the expression of myogenin and p21, markers of myoblast differentiation phase, was significantly reduced (P<0.01), while Myf5 and desmin, markers of myoblast proliferative phase, significantly increased (P<0.01) in the groups of 2.5－10 ng/ml rhCNTF treatment. These findings demonstrate that exogenous rhCNTF can reversibly inhibit differentiation but permits proliferation of adult human myoblasts in vitro.

Key words: recombinant human ciliary neurotrophic factor (rhCNTF); myoblast; differentiation; proliferation

成肌细胞分化受MyoD家族的bHLH转录因子调控, 这些成肌调节因子(MRFs)包括MyoD、 myf5、 myogenin和MRF4, 其中MyoD、 myf5决定着安静的小圆球形成肌前体细胞能否被激活成为梭形成肌细胞, 而myogenin和MRF4则发挥着调节成肌细胞终末分化为肌管肌纤维的功能, myogenin在融合和分化期间持续表达, myogenin基因表达或蛋白含量的降低可抑制成肌细胞的融合和终末分化为肌管肌纤维[1]。睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)是神经生长因子家族以外的一种神经营养因子。CNTF的主要生物学作用是支持神经细胞的存活和诱导神经前体细胞分化[2]。有关CNTF在骨骼肌系统的生物学作用报道较少。有报道皮下注射CNTF可减轻去神经引起的肌萎缩和老年性肌张力降低[3, 4], CNTF也能改善失重引起的肌萎缩和骨骼肌功能的改变[5]。可是, CNTF对骨骼肌肌萎缩或收缩功能改善等方面的作用是通过改善支配骨骼肌的神经而间接作用于肌细胞还是对肌细胞的直接作用仍不清楚。邓小华等[6]报道外源性CNTF含量增加能促进大鼠成肌细胞的体外增殖, 但有关CNTF对成人成肌细胞体外分化的影响迄今未见报道。

近年来, 大量研究展示了成人成肌细胞作为一种自体干细胞的新来源在治疗多种临床退行性疾病中具有良好的应用前景。但成人个体骨骼肌内成肌细胞含量较少, 且成肌细胞的体外自然分化较快, 不易扩增, 因此, 抑制成肌细胞的体外分化可望实现少量取样批量获取, 以满足临床需要。本文将不同浓度的CNTF作用于体外培养的克隆化成人成肌细胞, 在诱导分化条件下, 探讨了重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)对成人成肌细胞体外分化的影响及其分化特异调控因子表达的变化。

1 材料和方法

1.1 成人成肌细胞的分离和单克隆扩增

取成人(20－45岁)自愿者的胸小肌, 剪成约1 mm3碎片, 混合消化酶液(dispase 2.4 U/ml、 collagenase 1%、 CaCl2 2.5 mmol/L和0.1% DNAase), 37℃消化45 min。加入5倍体积10%胎牛血清(FCS; GIBCO-BRL)并用6号针头反复吹打, 然后用200目网过滤, 滤液在300 g离心10 min, 底层细胞用生长液(GM)重悬。 生长液为: DMEM加10%马血清(HS; GIBCO-BRL), 10% FCS, 1%鸡胚渗出液(GIBCO-BRL), 1%青链霉素和bFGF (R & D System) 2.5 ng/ml, 按5×105 cells/ml接种于涂有collagen Ⅰ (Sigma-Aldrich)的培养瓶。采用有限稀释法[7], 挑选desmin+细胞单克隆扩增。细胞培养主要试剂来自GIBCO-BRL, 主要消化酶为Boehringer Mannheim Corp.产品。

1.2 外源性rhCNTF处理克隆化成人成肌细胞

按5×105 cells/ml接种desmin+单克隆细胞于培养皿中, 待生长达亚汇合(subconfluence)时, 分别加入终浓度为0、 1.25、 2.5、 5、10 ng/ml rhCNTF (R & D System) 的分化液(DM:DMEM/2%HS), 培养72 h诱导分化。为进一步分析分化抑制作用是否可逆, 在以上方法诱导分化72 h后换含0或5 ng/ml rhCNTF的分化液继续培养72 h。为证明分化抑制的成肌细胞是否具有正常的增殖和分化能力, 将这些细胞换生长液培养, 并在细胞增殖达亚汇合时换分化液诱导分化72 h。用分化率(differentiation rate; 为融合细胞中myogenin+ 核的数目/细胞核总数×100%)判定分化程度, 其中融合细胞为含有3个核以上的细胞, 每组实验为3个平行生长皿。

1.3 免疫细胞化学

用4%多聚甲醛固定细胞, 室温30 min, 0.01 mol/L PBS洗3次。0.2% Triton X-100/0.01 mol/L PBS室温30 min, 加5%正常羊血清封闭4℃过夜, 然后进行一抗反应:小鼠单克隆抗desmin抗体(1∶500; Zymed), 兔多克隆抗myogenin抗体(1∶1000; Santa Cruz)加入0.1% Triton X-100/0.01 mol/L PBS和2%正常羊血清4℃过夜。PBS洗3－4次, 进行二抗反应:生物素标记的抗小鼠或抗兔IgG (1∶1000; Zymed) 室温1.5 h, PBS洗3－4次, 与A、 B复合物室温反应3 h, PBS洗3－4次, 进行常规ABC法染色。

1.4 Western blot 分析

收集用裂解液(Pierce)裂解的细胞, 并置于冰浴摇床1 h, 加入等体积2×SDS loading buffer, 100℃ 15 min, 然后12000 r/min 离心15 min, 收集上清并调节蛋白浓度为1 mg/ml, 各样品取等量蛋白(50－100 μg)在12% SDS-PAGE上电泳, 用semidry transfer (Bio-Rad)转到PVDF膜(Millipore)。膜在含10%脱脂奶粉, 0.5% BSA (Sigma), 0.1% Tween 20和0.1% NaN3的TBS中封闭过夜。 一抗:小鼠单克隆抗desmin(1∶500; Zymed)和p21 (1∶500; PharMingen)抗体, 兔多克隆抗myf5和myogenin抗体(1∶500; Santa Cruz)室温3 h, TBS洗3次; 二抗(辣根过氧化酶标记的抗小鼠或抗兔IgG, Sigma; 1∶5000)室温孵育2 h。ECL Kit (Amersham)显色。

1.5 统计分析

结果以mean±SD表示。应用SAS○R 6.12统计软件, 以两因素重复测量ANOVA分析法进行组间差异分析, P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 成肌细胞单克隆及其鉴定

分离提取的骨骼肌细胞中成肌细胞特异标记desmin的阳性率为>97%, 提示有约3%的其它种类细胞存在, 为更好地探讨CNTF对成肌细胞体外分化的影响, 我们挑选desmin+细胞进行单克隆扩增。图1是成肌细胞单克隆的活细胞及desmin免疫细胞化学染色照片, 可见单个成肌细胞(图1a)及其扩增的克隆团(图1b), 细胞呈小圆球形有较强折光度, 生长约5－10 d达亚汇合, 约7 d传代一次扩增形成单克隆细胞株。为鉴定成肌细胞的纯度, 将单克隆细胞接种在涂有collagen Ⅰ的35 mm培养皿, 贴壁后12 h (图1c)进行desmin染色鉴定, desmin+率约为100% (图1d)。

图1.成肌细胞单克隆及其鉴定

Fig. 1.Clone of individual myoblast and its identification. Individual myoblast of adult human (a) and its

clone （b）. These cloning myoblasts were dispersed and plated to obtain the adherent cells (c), which showed all desmin+ response by immunocytochemistry (d). Scale bar, 25 μm.

2.2 外源性rhCNTF对克隆化成人成肌细胞体外分化的影响

分析不同浓度的rhCNTF对成肌细胞体外分化的影响, 0－10 ng/ml rhCNTF处理组中成肌细胞的分化率分别为74.4±10.44%、 65.5±11.84%、 45.1±8.49%、 40.7±6.82%、 30.1±7.21%, 可见与对照组相比2.5、 5和10 ng/ml rhCNTF均显著抑制成肌分化(P<0.01), 且呈量-效关系(图2)。对照组中有粗大、多核(≥3个核)的肌管(图3; 箭头)形成, 而5 ng/ml rhCNTF处理组中含大量梭形单核细胞(图3; 箭头), 这些单核细胞在生长液中能快速增殖, 在分化液中也能分化成肌管(结果未显示)。图3也提示去除rhCNTF作用后成肌细胞可分化成肌管。因此, rhCNTF可抑制克隆化成人成肌细胞的体外分化, 且这种抑制作用是可逆的, 并呈量-效依赖关系。

图2.rhCNTF抑制成人成肌细胞的体外分化

Fig. 2.Inhibition of myoblast differentiation by rhCNTF in vitro. Myoblasts were cultured in DM with rhCNTF (0－10 ng/ml) for 72 h, and then were stained with myogenin to show nuclei. The differentiation rates was expressed as a percentage of the number of myogenin+nuclei in the fused cells among the total number of nuclei in 3 randomly chosen fields under a microscope. Cells containing more than three nuclei were regarded as fused cells.

*P<0.01, n=3.

图3.rhCNTF对成人成肌细胞体外分化的抑制作用的可逆性

Fig. 3.The reversibility of inhibitory effect of rhCNTF on myoblat differentiation in vitro. Myoblasts were cultured in DM with (72 h+) or without (72 h-) rhCNTF 5 ng/ml for 72 h. To test whether the inhibition is reversiable, myoblasts were also cultured with 5 ng/ml rhCNTF in DM for 72 h after which the culture medium was replaced with the same media (72+72+) or DM containing no rhCNTF (72+72-) for a further 72 h. Scale bar, 25 μm.

2.3 外源性rhCNTF抑制成肌分化蛋白的表达

为探讨rhCNTF对成肌细胞体外分化的抑制作用是否伴有分化特异蛋白myogenin和细胞周期素依赖的激酶抑制剂p21表达的变化, 我们收集rhCNTF 5 ng/ml处理组和对照组诱导分化72 h的细胞进行Western blot分析。结果表明, rhCNTF 5 ng/ml 处理组与对照组相比, myogenin和p21表达显著降低(P<0.01), 同时desmin和myf5表达显著增高(P<0.01)。提示rhCNTF可抑制成人成肌细胞的体外分化并保持增殖(图4)。

图4.外源性rhCNTF对成肌蛋白表达的影响

Fig. 4.Effect of exogenous rhCNTF on myogenic proteins. Extracts were prepared from cells cultured in DM with or without rhCNTF 5 ng/ml for 72 h, and then subjected to Western blot assay by using the anti-desmin, myf5, myogenin and p21 antibodies. The results indicated that in the treatment of rhCNTF 5 ng/ml groups the expression of myogenin and p21 was significantly reduced (P<0.01), while the expression of desmin and myf5 was significantly increased (P<0.01).

3 讨论

成肌细胞的体外分化过程包括梭形成肌细胞的分裂增殖、 汇聚和膜融合, 最终形成终末分化的成熟肌纤维。成肌调节因子(MRFs)MyoD、 myf5、 myogenin和MRF4中myogenin是成肌细胞终末分化的重要调节因子, myogenin蛋白表达降低可抑制成肌细胞终末分化为肌管肌纤维[1], 许多生长因子也参与成肌分化的调节, 如神经生成细胞因子(neuropoietic cytokines)家族的LIF [8]可在骨骼肌再生过程中促进成肌细胞增殖和生成新的再生肌纤维。CNTF与LIF同属神经生成细胞因子家族, 且CNTF及其受体在骨骼肌中有较高表达, 因此CNTF在骨骼肌生长发育过程中可能起着重要的作用。Guillet 等给老年肌萎缩患者反复皮下注射CNTF蛋白后, 发现能改善患者的肌肉萎缩和增强肌张力[3], 皮下注射CNTF蛋白也可减轻去神经引起的肌萎缩[4]。Fraysse 等给尾悬吊3周造成肌萎缩的大鼠皮下持续供给CNTF, 观察到能显著改善失重引起的肌萎缩和骨骼肌收缩功能的降低[5]。可是, CNTF对骨骼肌肌萎缩或收缩功能的改善是通过作用于支配骨骼肌的神经而发挥间接作用还是对肌细胞的直接作用仍不清楚。有报道[6]增加外源性CNTF含量能促进L6-TG肌母细胞和新生SD大鼠原代成肌细胞的体外增殖, 但迄今未见有关外源性CNTF对克隆化成人成肌细胞体外分化影响的报道。

本文发现, 增加外源性rhCNTF(2.5－10 ng/ml)能显著抑制克隆化成人成肌细胞的体外分化, 并产生大量的梭形单核细胞, 且这种抑制作用在去除外源性rhCNTF作用后能得以消除, 即外源性rhCNTF对成人成肌细胞体外分化的抑制作用是可逆转的, 因此, 外源性rhCNTF对成人成肌细胞体外分化的抑制作用与其毒性作用无关。这些梭形细胞desmin染色阳性, 在生长液中能快速增殖, 可通过传代扩增达到批量获取, 这对成人成肌细胞作为一种新的自体干细胞来源的临床应用具有重要意义。大量研究表明, 成肌分化调节因子myogenin基因表达或蛋白含量的降低抑制成肌细胞的融合和终末分化[1]。我们用Western blot分析了rhCNTF 5 ng/ml处理组和对照组myogenin蛋白的表达, 发现rhCNTF 5 ng/ml处理组中肌管数量减少的同时myogenin蛋白表达量也显著降低, 这与目前认同的结论一致。蛋白表达分析还提示rhCNTF处理组中细胞周期素依赖的激酶抑制剂p21含量显著降低和成肌细胞增殖期标志myf5, desmin蛋白表达显著增加, 这表明rhCNTF处理的成肌细胞未完全撤出细胞周期, 即其终末分化受到抑制。但rhCNTF对成肌特异调节因子myogenin、 myf5和细胞周期蛋白p21, desmin的表达调控及其对成人成肌细胞体外分化的抑制作用的机制还有待进一步探讨。本文首次提出并证明了rhCNTF能抑制成人成肌细胞的体外分化并保持增殖, 这对成人成肌细胞的批量获取及其作为一种自体干细胞的新来源应用于治疗多种相关临床退行性疾病具有重要的意义。

参考文献

[1]Hawke TJ, Garry DJ. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physio 2001;91:534－551.

[2]Mark WS, Keith DA, Philip DL. The ciliary neurotrophic factor and its receptor, CNTFRα. Pham

Acta Helv 2000;74:265－272.

[3]Guillet C, Auguste P, Mayo W, Kreher P, Gascan H. Ciliary neurotrophic factor is a regulator of muscular strength in aging. J Neurosci 1999;19:1257－1262.

[4]Helgren ME, Squinto SP, Davis HL, Parry DJ, Boulton TG, Heck CS, Zhu Y, Yancopoulos GD, Lindsay RM, Distefano PS. Trophic effect of ciliary neurotrophic factor on denervated skeletal muscle. Cell

1994;76:493－504.

[5]Fraysse B, Guillet C, Huchet-Cadiou C, Camerino DC, Gascan H, Leoty C. Ciliary neurotrophic factor prevents unweighting-induced functional changes in rat soleus muscle. J Appl Physio 2000;88:1623－1630.

[6]Deng XH (邓小华), Shi J, Jiang CL, Lu CL. Ciliary neurotrophic factor promotes myoblast proliferation in vitro. Chin J Appl Physio (中国应用生理学杂志) 2000;16(1):59－63 (Chinese, English abstract).

[7]Chen XP (陈晓萍), Liu H, Wang CY, Guo Q, Fan M. Isolation and clonal analysis of satellite cells from adult rats. Chin J Biomed Eng (中国生物医学工程) 2001;10(2):56－59 (Chinese, English abstract).

[8]Kurek JB, Bower JJ, Romanella M, Koentgen F, Murphy M, Austin L. The role of leukemia inhibitory factor in skeletal muscle regeneration. Muscle Nerve 1997;20:815－822.