生理学报Acta Physiologica Sinica, August
研究论文
过氧亚硝基阴离子对离体兔肺动脉反应性变化的影响
谷振勇1,2,*, 凌亦凌2, 徐小虎1, 孟爱宏2, 李淑瑾2
1汕头大学医学院, 汕头 515031; 2河北医科大学病理生理教研室, 石家庄 050017
摘要: 探讨过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, ONOO-)对离体兔肺动脉反应性变化的影响。用离体血管环技术观察ONOO-孵育后肺动脉对钙离子载体A23187、 ADP、 ACh、 硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)和苯肾上腺素(phenylephrine, PE)的反应性张力变化。结果显示: (1) ONOO-孵育后肺动脉对A23187、 ADP和ACh引起的舒张反应明显降低, ONOO-抑制内皮依赖受体依赖或受体非依赖性舒张反应有量效关系; (2) ONOO-孵育可剂量依赖性抑制肺动脉对SNP的舒张反应; (3) 0.5 mmol/L ONOO- 孵育后肺动脉对PE的收缩反应明显增强, 而1.0和2.0 mmol/L ONOO- 导致肺动脉的收缩反应明显降低; (4) 溶剂对肺动脉的反应性无明显影响, dec ONOO- 对PE和ADP的反应性影响不大, 但可增强A23187、 ACh和SNP的舒张反应。结果表明, ONOO- 可改变离体肺动脉的反应性。
关键词: 过氧亚硝基阴离子; 肺动脉; 舒张反应; 收缩反应
中图分类号: Q463; R363.2
Effect of
peroxynitrite on the reactivity of rabbit pulmonary arteries in vitro
GU Zhen-Yong1, 2*, LING Yi-Ling2, XU Xiao-Hu1, MENG Ai-Hong2, LI Shu-Jin2
1Shantou University Medical College, Shantou 515031;
2Department of Pathophysiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017
Abstract: To investigate the effect of peroxynitrite (ONOO-) on the reactivity of rabbit pulmonary artery, the responses of rabbit pulmonary artery rings (PARs) pre-incubated with ONOO- to endothelium-dependent and receptor-dependent relaxants ACh and ADP, endothelium-dependent and receptor-independent relaxant calcium ionophore A23187, endothelium-independent relaxant sodium nitroprusside (SNP) and α1-adrenoceptor agonist phenylephrine (PE) were observed in vitro in an accumulative manner. (1) Relaxations of PARs to ACh, calcium ionophore A23187 and ADP were markedly impaired with shift of accumulative dose-response curve of each agonist to the right. Inhibition of endothelium-dependent and receptor-dependent or independent relaxation by ONOO- was dose-dependent. (2) ONOO- incubation inhibited SNP-induced relaxation in a dose-dependent manner. (3) Contractile response of PARs to PE varied with the different doses of ONOO-. In PARs pre-incubated with 0.5 mmol/L ONOO-, contractile response was significantly enhanced with shift of PE accumulative dose-response curve to the left, whereas in PARs pre-incubated with 1.0 mmol/L or 2.0 mmol/L ONOO-, it was markedly reduced with right shift of PE accumulative dose-response curve. (4) Vehicle of ONOO- had no effect on responses to each agonist.Decomposed ONOO- had minimal effect on the response to PE and ADP, in contrast, relaxation of PARs to ACh, A23187 and SNP were enhanced. These results indicate that ONOO- may contribute to regulatory disorder of pulmonary artery reactivity.
Key words: peroxynitrite; pulmonary artery; vasorelaxation; contractile response
血管反应性失调及其发生机制一直是休克领域中的研究热点。在内毒素休克发病过程中, 肺血管张力调节机制发生明显紊乱, 表现为休克早期肺动脉压增高而晚期降低[1]。肺循环中的收缩和舒张血管因子稳态失衡以及肺动脉的反应性异常变化可能是肺动脉张力调控机制紊乱的重要原因。研究证实,一氧化氮(nitric oxide, NO)与超氧阴离子(superoxide anion, O·
均是调控血管反应性变化的重要因素［2］, NO与O·2, 可快速反应生成强氧化剂过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-)［3］。实验显示, 内毒素入血早期可诱导肺动脉平滑肌生成ONOO-［4］。内毒素休克时生成增多的NO与O·2, 可能通过衍生ONOO-改变肺动脉的张力调控机制, 参与介导肺动脉反应性变化。迄今为止, ONOO-对肺动脉反应性变化的影响尚无报道。本实验系统观察了ONOO-对离体兔肺动脉反应性变化的影响, 为休克时肺循环稳态紊乱发生机制提供了新的实验依据。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
ACh、 calcium ionophore (A23187)、 ADP、 硝普钠(SNP)、 消炎痛为Sigma产品, 苯肾上腺素(PE)购自上海天丰制药厂。ONOO-的合成、 鉴定和定量方法见文献[3], 新合成的ONOO-用0.1 mol/L NaOH稀释, 然后置于－70℃避光保存。Krebs Ringer bicarbonate缓冲液(简称Krebs液), 成分为(mmol/L): NaCl 118.0、 KCl 4.7、 CaCl2 2.5、 MgSO4 1.2、 KH2PO4 1.2、 NaHCO3 25、 glucose 11.1, pH 7.2－7.4。不含Ca2+和Mg2+的Dulbecco's磷酸缓冲液(DPBS), 成分为(mmol/L): KH2PO4 1.4、 KCl 2.8、 NaCl 137.0、 Na2HPO4·7H2O 8.0, pH 7.2。
1.2 动物
健康纯种日本大耳白兔18只, 体重1.8－2.2 kg, 3－4月龄, 雌雄不限。实验前禁食18 h, 自由饮水。
1.3 离体兔肺动脉环(pulmonary arterial rings, PARs)的制备
日本大耳白兔静脉注射肝素1 250 U/kg抗凝, 2 min后颈动脉放血处死。分层剪开胸壁, 迅速摘取心肺, 置于4℃持续充入95% O2+5% CO2混合气体(北京普莱克斯实用气体公司 )的Krebs液中, 仔细分离双侧近端的肺动脉, 剔除动脉周围的结缔组织, 避免损坏血管内皮。 然后将肺动脉剪制成3 mm长PARs。肺离体至制成PARs一般在40 min内完成。每只兔可制环5－7个, 每次用环4 个, 多余的PARs置于含饱和95% O2+5% CO2的Krebs液密封玻璃瓶中, 于4℃保存, 当日用完。
血管环随机分为5组: 0.5、 1.0和2.0 mmol/L ONOO-组; 溶剂对照组, 溶剂为与2.0 mmol/L ONOO－等容积的0.1 mol/L NaOH; 为排除ONOO－分解产物的影响, 实验还设立了2.0 mmol/L dec ONOO－组 (dec ONOO-系 ONOO-溶液于100℃水中温育10 min)。各组PARs置于含DPBS小杯中, 每次1环/2 ml, dec ONOO-和ONOO-组分别加入前述终浓度的试剂, 迅速混匀。ONOO-稀释达300－1000倍, 稀释后溶液pH 7.4。血管环于室温(25℃)、 避光条件下孵育20 min。
1.4 离体肺动脉的张力检测
将预处理的PARs垂直挂于8 ml夹层器官槽中, 环的一端固定于槽底部, 另一端通过T1型张力传感器与3066型平台记录仪(四川仪表总厂)相连, 器官槽灌流液为37℃恒温、 含5 μmol/L消炎痛的Krebs溶液, 持续充入95% O2+5% CO2混合气体。血管静息张力拉至2 g, 6 min后重复一次。之后平衡至少60 min, 每15 min更换器官槽中的Krebs溶液。然后用1 μmol/L PE收缩肺动脉至张力稳定, 新鲜Krebs冲洗至基线(约需20－30 min), 以稳定血管环的反应性。血管环张力恢复平稳后即可用于观察反应性张力变化。观察1 μmol/L PE 预收缩后的肺动脉对0.01－10 μmol/L ACh、 0.1－100 μmol/L ADP、 0.001－1 μmol/L A23187和0.001－1 μmol/L SNP的累积剂量舒张反应变化, 以及肺动脉对0.01－10 μmol/L PE的累积剂量收缩反应变化。
实验结束后, 留取PARs, 置于恒温烤箱至恒重, 用以标化血管反应性张力。舒张反应用舒张张力占1 μmol/L PE预收缩张力的百分比表示; 收缩反应用每毫克血管环干重的克张力(g·tension/mg dw)表示。
1.5统计学处理
数据用mean±SE表示, 组间差异显著性用多样本均数t检验。
2 结果
2.1 ONOO-孵育后肺动脉对A23187的舒张反应变化
在溶剂组, A23187可剂量依赖性的引起肺动脉明显舒张。ONOO-孵育后, A23187的舒张效应降低, 其中
0.5 mmol/L ONOO-组呈降低趋势, 1.0 mmol/L ONOO-组舒张明显低于溶剂组。2.0 mmol/L ONOO-组A23187的舒张反应逆转为收缩反应。与溶剂组相比, 2.0 mmol/L dec ONOO-组舒张反应明显增强(图1)。
图1.ONOO-对A23187引起离体兔肺动脉内皮细胞依赖性舒张反应性张力变化的影响
Fig. 1.Effect of peroxynitrite on A23187-induced endothelium-dependent relaxation
in isolated rabbit pulmonary artery rings in vitro.
*P<0.05,
**P<0.01,
***P<0.001 vs control group;
^P<0.05,
^^P<0.01,
^^^P<0.001 vs 0.5 mmol/L ONOO- group.
2.2 ONOO-孵育后肺动脉对ADP的舒张反应变化
溶剂组肺动脉对ADP的累积剂量舒张反应较明显。与溶剂组比较, ONOO-孵育可导致ADP的舒张反应降低, 0.5 和1.0 mmol/L ONOO-组呈降低趋势; 2.0 mmol/L ONOO-组则明显降低; dec ONOO-孵育后肺动脉对低浓度ADP (0.1 和1 μmol/L)舒张反应略增强, 而对高浓度ADP (10－100 μmol/L)舒张反应影响不大(图2)。
图2.ONOO-对ADP引起离体兔肺动脉内皮细胞依赖性舒张反应性张力变化的影响
Fig. 2.Effect of peroxynitrite on ADP-induced endothelium-dependent and receper-dependent relaxation in isolated rabbit pulmonary artery rings in vitro.
*P<0.05,
**P<0.01 vs control group.
2.3 ONOO-孵育后肺动脉对ACh的舒张反应变化
与溶剂对照组相比, 0.5 mmol/L ONOO-组肺动脉对ACh的舒张反应明显降低, ACh的剂量累积反应曲线明显右移。1.0和2.0 mmol/L ONOO-组肺动脉对ACh的舒张反应完全消失, 并逆转为收缩反应, ONOO-浓度越高,收缩反应张力越大;而dec ONOO-对照组肺动脉对1 μmol/ L ACh的反应明显高于对照组肺动脉对同浓度ACh的舒张反应(图3、 4)。
图3.ONOO-对ACh引起离体兔肺动脉内皮细胞依赖性舒张反应性张力变化的代表性原始图
Fig. 3.Representative tracings showing tension alterations of relaxation to acetycholine in isolated rabbit pulmonary artery rings incubated with vehicle (A), 2.0 mmol/L dec ONOO- (B), 0.5 mmol/L
ONOO- (C),1.0 mmol/L ONOO- (D) and 2.0 mmol/L ONOO- (E), respectively.
图4.ONOO-对ACh引起离体兔肺动脉内皮细胞依赖性舒张反应性张力变化的影响
Fig. 4.Effect of peroxynitrite on acetycholine-induced endothelium-dependent and receper-dependent
relaxation in isolated rabbit pulmonary artery rings in vitro.
*P<0.05,
**P<0.01,
***P<0.01 vs control group;
^P<0.05,
^^P<0.01 vs 0.5 mmol/L ONOO- group;
##P<0.01 vs 1.0 mmol/L ONOO- group.
图5.ONOO-对硝普钠引起离体兔肺动脉内皮细胞非依赖性舒张反应性张力变化的影响
Fig. 5.Effect of peroxynitrite on sodium nitroprusside-induced endothelium-independen relaxation
in isolated rabbit pulmonary artery rings in vitro.
*P<0.05,
**P<0.01,
***P<0.001 vs control group;
^P<0.05,
^^P<0.01 vs 0.5 mmol/L ONOO- group．
2.4 ONOO-孵育后肺动脉对SNP的舒张反应变化
与溶剂组比较, ONOO-组肺动脉对SNP的舒张反应明显降低, SNP的剂量累积反应曲线明显右移, 其中0.5 mmol/L ONOO-组呈降低趋势, 1.0和2.0 mmol/L ONOO-组舒张明显降低, 以2.0 mmol/L ONOO-组降低为显著。与之相反, dec ONOO-组对SNP的舒张反应明显增高, SNP的剂量累积反应曲线明显左移(图5)。
2.5 ONOO-孵育后肺动脉对PE的收缩反应变化
与溶剂对照组相比, 2.0 mmol/L dec ONOO-组肺动脉对PE的收缩反应是增强趋势; 不同浓度的
ONOO-组对 PE 的收缩反应有不同的影响, 0.5 mmol/L ONOO-组对PE的收缩反应明显增强, 而1.0和2.0 mmol/L ONOO-组收缩反应明显降低, 以2.0 mmol/L ONOO- 组降低为显著(图6、 7)。
图6.ONOO-对苯肾上腺素引起离体兔肺动脉收缩反应性张力变化的代表性原始图
Fig. 6.Representative tracings showing tension alterations of contraction to phenylephrine in isolated rabbit pulmonary artery rings incubated with vehicle (A), 2.0 mmol/L dec ONOO- (B), 0.5 mmol/L
ONOO-(C), 1.0 mmol/L ONOO- (D) and 2.0 mmol/L ONOO- (E), respectively.
图7.ONOO-对苯肾上腺素引起离体兔肺动脉收缩反应性张力变化的影响
Fig. 7.Effect of peroxynitrite on phenylephrine-induced contractile response in isolated rabbit pulmonary
artery rings in vitro.
*P<0.05,
**P<0.01,
***P<0.001 vs control group．
3 讨论
内皮细胞功能完整性受损是内毒素休克早期肺动脉的一个重要改变。A23187、 ADP和ACh为不同类型与结构的内皮依赖性舒张血管物质, 三者均通过激活内皮细胞固有型一氧化氮合酶(cNOS), 由内皮细胞释放NO介导其舒张反应, 可用于检测血管内皮的功能变化。本实验结果显示, ONOO-孵育后肺动脉对A23187、 ADP和ACh引起的舒张反应性明显降低, 说明ONOO-可破坏内皮功能的完整性, 此效应与内毒素对内皮的影响一致[5]。本室研究已证实, 内毒素可以诱导培养的牛肺动脉内皮细胞生成ONOO-明显增多, 后者参与介导内毒素对内皮细胞的损伤作用[6]。ONOO-对前述3种不同舒血管物质的舒张作用影响程度有所不同, 可能与该3种舒张剂的性质有关。A23187是Ca2+载体, 可透过细胞膜进入内皮细胞, 直接激活内皮cNOS, 因此其舒张作用依赖内皮而不依赖受体[7]。ONOO-孵育后的肺动脉对A23187引起的内皮细胞依赖性舒张反应有抑制作用, 表明ONOO-作用的靶分子是cNOS或位于NO释放以后的环节。有报道, NOS活性与NOS蛋白酪氨酸残基磷酸化水平有关, ONOO-可选择性导致蛋白酪氨酸残基硝基化[8], 可能干扰NOS蛋白磷酸化。或许可以推测, 在NO生成增多的病理过程中, NO与
O·2反应生成ONOO-, 进而抑制NOS的活性、 减少NO生成, 这可能构成机体调节NOS活性的重要负反馈调节机制。ACh和ADP亦为内皮依赖性舒张剂[7, 9], 但两者均需先与各自的内皮膜受体结合, 由其受体将信号转导入细胞[7], 引起内皮细胞游离Ca2+浓度增高, 然后激活内皮cNOS, 因此都属于内皮依赖和内皮受体依赖性舒张血管剂。ONOO-抑制ACh、 ADP介导的内皮依赖性舒张反应提示, ACh、 ADP的内皮细胞膜受体至内皮细胞NOS蛋白分子之间的各个环节均有可能构成ONOO-作用的靶位。ONOO-的作用机制可能有, ONOO-具有很强的氧化性, 可直接引起细胞膜脂质过氧化, 改变膜相的理化性质及膜受体构象, 还能通过膜阴离子通道跨膜弥散入细胞, 干扰细胞内的信号转导机制[10]。ONOO-对ACh、 ADP介导的内皮依赖性舒张反应的抑制效应差异很大, 其中, 高浓度 ONOO－ (1－2 mmol/L)可使ACh的舒血管反应逆转为收缩反应, 其原因可能在于ACh、 ADP的内皮细胞膜受体及其受体后事件不同。ONOO-引起肺动脉内皮细胞功能变化的具体靶分子目前尚不清楚, 有待进一步研究。
SNP为NO供体, 其舒张血管作用不依赖内皮细胞, 可直接反映血管平滑肌的舒张功能; 血管内皮细胞存在与否对α1受体激动剂PE引起的血管收缩反应没有明显影响, 利用SNP和PE可以从不同的角度观察血管平滑肌的功能状态与改变。本实验结果显示, ONOO-孵育后的肺动脉对SNP的舒张作用也有明显抑制, 而且ONOO-的浓度越高抑制作用越大。与之相反, dec ONOO-孵育后的肺动脉对SNP的舒张反应明显增强, 说明ONOO-能够特异性导致肺动脉平滑肌的舒张反应降低。另外, 在高浓度ONOO-组, 肺动脉对PE引起的收缩反应显著降低, 提示ONOO-对离体肺动脉的这种收缩和舒张反应均呈现明显地抑制效应, 高浓度ONOO-可能导致血管平滑肌的收缩装置功能异常。结果还显示, 不同浓度的ONOO-孵育后, 离体兔肺动脉对PE的收缩反应变化不同。0.5 mmol/L ONOO-组肺动脉的收缩反应明显增强, 与溶剂对照组相比有明显差异, 而与内毒素孵育诱导肺动脉平滑肌收缩反应增强一致[5]。有报道, 0.3 mmol/L ONOO-孵育后的离体大鼠胸主动脉对肾上腺素引起的收缩反应明显降低, 0.9 和1.5 mmol/L ONOO-可进一步抑制其收缩反应[11]。这提示ONOO-对肺动脉和体动脉的反应性可能有不同的影响, 即低剂量ONOO-引起主动脉收缩反应降低, 却可导致肺动脉收缩反应增强。ONOO-的这一作用是否具有普遍性及其作用机制正在探讨中。1.0和2.0 mmol/L ONOO-可抑制肺动脉的收缩反应, 表现与ONOO-对大鼠胸主动脉的效应相同[11]。ONOO-抑制动脉收缩反应的作用机制可能与其导致血管平滑肌细胞超极化有关[12]。有意思的是, 1.0和2.0 mmol/L ONOO-可抑制肺动脉的收缩反应, 而相同浓度的ONOO-却导致肺动脉对ACh 的舒血管反应逆转为收缩反应, 并且收缩反应似乎具有增敏性。但其作用机制尚不清楚, 推测与ACh的受体后信号转导机制改变有关。
本实验结果提示, 在内毒素休克的发病过程中, 肺循环和血管壁中内源性ONOO-生成增多可能构成内毒素导致肺动脉反应性异常变化的重要发病因素, 这有助于解释在内毒素休克发病过程中肺动脉血压的变化。休克早期内毒素和细胞因子均可诱导肺动脉壁细胞生成O·
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