生理学报Acta Physiologica Sinica, August 25, 2003, 55(4): 475

生理学报Acta Physiologica Sinica, August 25, 2003, 55(4): 475－480

研究论文

内源性过氧亚硝基阴离子介导脂多糖导致肺动脉内皮细胞损伤

谷振勇1,2,*, 凌亦凌2, 徐小虎1, 朱铁年2, 丛斌2

1汕头大学医学院, 汕头515031;2河北医科大学病理生理教研室, 石家庄 050017

摘要: 在培养的牛肺动脉内皮细胞(bovine pulmonary artery endothelial cells, BPAECs)水平上, 观察脂多糖( lipopolysaccharide, LPS)对BPAECs诱生过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, ONOO-)能力及内皮源性ONOO-在LPS致BPAECs损伤中的作用。结果显示: (1) LPS剂量依赖性地引起BPAECs诱生ONOO-生成标志物硝基酪氨酸(nitrotyrosine, NT)的荧光强度(即ONOO-)明显增多, NT阳性细胞数和百分率也明显增多或增高(P<0.05); iNOS选择性抑制剂氨基胍(AG)明显抑制LPS诱生ONOO-增多(P<0.05), 而NT阳性细胞数和百分率分别减少或降低, 但无明显差异。(2)在LPS作用下BPAECs培养上清中的MDA含量和LDH活性明显增多和增高, 呈现剂量依赖性效应。加AG后MDA含量明显降低(P<0.001), LDH活性呈降低趋势。(3) LPS可诱导BPAECs凋亡明显增多, 用EB荧光染色后可见细胞染色质浓集、核变小等凋亡征象。AG可导致LPS引起的BPAECs凋亡明显减少, 但仍明显高于溶剂组。LPS可导致BPAECs线粒体呼吸抑制及膜电位下降。上述结果表明, LPS可引起BPAECs生成ONOO-增多, ONOO-参与介导LPS所致BPAECs过氧化损伤与细胞凋亡。

关键词: 过氧亚硝基阴离子, 脂多糖, 肺动脉, 内皮细胞

中图分类号: Q463; R363.2

Endogenous peroxynitrite mediates lipopolysaccharide-induced injury in cultured pulmonary artery endothelial cells

GU Zhen-Yong1,2,*, LING Yi-Ling2, XU Xiao-Hu1, ZHU Tie-Nian2, CONG Bin2

1Shantou University Medical College, Shantou 515031; 2Department of Pathophysiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017

Abstract: This study, using cultured bovine pulmonary artery endothelial cells (BPAECs), was undertaken to investigate the roles of endogenous ONOO- in LPS-caused injury in endothelial cells. The fluorescent intensity of nitrotyrosine (NT), a specific marker of ONOO- generation, in BPAECs represented the content of endogenous ONOO- generation. The fluorescent intensity of NT and the number of NT positive cells were detected with flow cytometry (FCM), and the percentage of NT positive cells was calculated. The results are as follows. (1) LPS (1, 5 and 10 μg/ml) caused a marked increase in fluorescent intensity of NT in a dose-dependent manner, which was significantly increased compared to the vehicle group (P<0.01).The number and percentage of NT positive cells were markedly increased (both P<0.05 vs vehicle group). Aminoguanidine (AG), a selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase (iNOS), inhibited LPS-induced increase in fluorescent intensity of NT in BPAECs. However, the number and percentage of NT positive cells had a tendency to reduce. (2) LPS brought about an enhancement in MDA content and the activity of LDH in cultured supernatant. AG reversed the enhancement in MDA content induced by LPS (P<0.01). In contrast, AG had a marginal effect on the activity of LDH. (3) LPS induced an increase in apoptotic rate in BPAECs in a dose-dependent manner.The number of apoptotic cells markedly increased as well. Some BPAECs stained with fluorescent probe ethidium bromide showed morphological features of apoptosis with chromatin condensation and nuclear fragmentation. AG reduced the apoptotic rate and the number of apoptotic cells, both of which were still higher than those of vehicle group (P<0.05). LPS led to inhibition of mitochondrial respiration and membrane potential in an accumulation manner. In conclusion, LPS caused injury to cultured BPAECs and increased the production of ONOO-.The cytotoxicity of LPS may be mediated by the endogenous ONOO- .

Key words: peroxynitrite; lipopolysaccharide; pulmonary artery; endothelial cells

肺血管内皮细胞损伤是内毒素引起急性肺损伤的主要发病学环节, 然而内毒素导致内皮细胞损伤的直接或间接机制迄今尚未完全阐明。研究显示, 内源性一氧化氮(nitric oxide, NO)介导了内毒素的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)对培养猪胸主动脉内皮的细胞毒性作用[ 1]。在拟似体内条件下, NO和超氧阴离子(superoxide anion, O·)可发生快速非酶促化学反应, 生成强氧化剂过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, ONOO-)［ 2］。实验证实, LPS入血可诱导大鼠肺组织生成ONOO-, 外源性ONOO-可导致肺微血管壁通透性增高和离体肺动脉的反应性出现异常变化［ 3, 4］。LPS诱导内皮源性ONOO-可能导致血管内皮细胞自身损伤, 构成内毒素引起内皮细胞损伤的新机制。本实验在培养的肺动脉内皮细胞(bovine pulmonary artery endothelial cells, BPAECs)观察了LPS诱导BPAECs产生ONOO-的能力, 并探讨内皮源性ONOO-在LPS损伤内皮细胞中的作用。

1 材料和方法

1.1 试剂

脂多糖(LPS E.Coli serotype O111:B4)、氨基胍(aminoguanidine, AG)、溴化乙锭(EB)、胶原酶II型、羊抗小鼠FITC标记抗体、噻唑蓝(MTT)、 Rodamine 123、 DMSO均为Sigma产品; 小鼠硝基化酪氨酸单克隆抗体为美国Cayman产品; RPMI-1640为Gibco Bri产品; 兔Ⅷ因子相关抗原抗体为美国Zeyman产品; 羊抗兔FITC标记抗体为美国Jackson Immuno Research Lab产品; MDA检测试剂盒为南京建成产品; LDH检测试剂盒为北京中生产品。

1.2 细胞培养与预处理

BPAECs用酶消化法分离, 用完全培养液(RPMI-1640 含15% 小牛血清, 500 U/ml青霉素, 500 μg/ml链霉素)在37℃ 95% O2+5% CO2潮湿条件下培养。BPAECs鉴定采用免疫荧光组化方法检测Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ RAg)阳性; 倒置显微镜下细胞呈典型鹅卵石样排列。第3－6代细胞用于实验。细胞中加入

1、 5和10 μg/ml LPS, 5 μg/ml LPS和1 mmol/L AG, 或等容积的生理盐水。加完试剂后, 继续培养24 h, 收集细胞和培养液备检。

1.3内源性ONOO-生成的定量分析

内源性ONOO-诱生后, 可选择性与细胞的蛋白质酪氨酸残基反应, 生成稳定的硝基酪氨酸(nitrotyrosine, NT), 用流式细胞仪(flow cytometry, FCM)定量检测ONOO-标志物NT的含量可间接反映BPAECs生成ONOO-的情况[ 5]。BPAECs用预冷的不含Ca2+、 Mg2+的DPBS(150 mmol/L, pH 7.2)离心洗涤, 弃上清。沉淀细胞用0.5 ml预冷生理盐水悬浮, 加入抗NT一抗(1∶100), 4℃孵育30 min, 洗去多余的一抗。细胞重新悬浮后, 加羊抗小鼠FITC标记的二抗(1∶100), 4℃避光孵育30 min。细胞再次洗涤、悬浮后, 随即用FACS-420型流式细胞仪(Becton-Dickinson)进行分析, 激发波长488 nm, 发射波长615 nm。检测前用鸡血红细胞调整仪器CV<5%。定量分析NT阳性细胞荧光强度(表示内源性ONOO-的生成量)和NT阳性细胞绝对数, 计算NT阳性细胞百分比。

1.4 BPAECs凋亡的检测

1.4.1 BPAECs凋亡的流式细胞分析BPAECs用70%乙醇4℃固定。荧光染色前, 用NS洗涤1次, 将细胞调至106个/ml, 加终浓度10 μg/ml EB荧光分子染液, 于4℃避光孵育30 min, 随即上流式细胞仪检测。仪器条件2 W氩离子激光器, 输出功率300 mW, 激发波长488 nm, 发射波长605 nm。检测数据输入HP-300 Consort 30计算机, 应用相应软件进行处理, 并打印DNA组方图和双参数二维图。检测细胞凋亡百分率, 凋亡细胞绝对数。

1.4.2 BPAECs凋亡核荧光形态学改变BPAECs EB荧光染色同前, 将细胞悬液滴加于载玻片上, 盖片封片后于荧光显微镜(UFX-Ⅱ, 日本尼康)下观察。

1.5 BPAECs线粒体功能的检测

1.5.1 线粒体呼吸(mitochondrial respiration, MR)的检测

用MTT还原法检测MR[ 6]。将5×104个BPAECs接种于96孔培养板孔内, 培养至贴壁后, 更换培养液, 并加入试剂。LPS终浓度分别为1、 5和10 μg/ml, LPS+AG终浓度分别为5 μg/ml和1 mmol/L, 对照组加等容积NS。每组6孔。继续培养24 h。检测前将培养液更换为含5%牛血清的RPMI-1640培养液, 然后加入Hanks液溶解的MTT, 终浓度为0.4 mg/ml, 于37℃孵育1 h, 仔细吸弃培养液, 加DMSO 100 μl, 37℃ 1 h。轻轻摇动培养板混匀, 于450 nm波长下检测吸光度。以对照组吸光度的均值为100%, 计算各组吸光度的百分比, 用于表示细胞的线粒体呼吸能力。

1.5.2 线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, Δψ)的检测[ 7]荧光分子探针Rodamine 123 (R123) 为亲脂性、带阳电荷的荧光分子, 细胞负载R123后, R123主要分布于细胞内带阴电荷的线粒体膜区, Δψ维持正常可将R123保留于线粒体膜, R123减少或消失说明膜电位去极化。因此, 检测负载R123 BPAECs的荧光强度可反映Δψ的变化。药物处理24 h后, 消化细胞, 用DPBS洗涤一次, 离心1000 r/min 5 min, 0.5 ml DPBS悬浮细胞, 把R123储存液(1 g/L)加于上述细胞悬液中, 终浓度为5 mg/L, 于37℃避光孵育45 min。FCM分析前, 预冷NS洗涤, 离心1000 r/min 5 min, 0.5 ml NS重悬细胞后, 上机检测BPAECs R123荧光强度(为任意单位), 激发波长488 nm, 发射波长525 min。

1.6 细胞上清MDA含量及LDH活性检测

培养液低温离心(1 000 r/min, 5 min), 吸取上清。MDA含量用硫代巴比妥酸比色法检测[ 8], MDA单位为nmol/ml。LDH活性用自动生化分析仪(美国Byer)采取零级速率法检测, LDH活性单位以U/L表示。

1.7 统计学处理数据用mean±SD表示, 组间差异用t检验。

2 结果

2.1 LPS诱导BPAECs生成ONOO-的定量分析及AG的影响

用FCM检测BPAECs NT标记荧光强度表示内源性ONOO-生成的量。LPS可浓度依赖性地诱导BPAECs生成ONOO-明显增多, NT标记荧光强度显著高于对照组(P<0.001)。不同剂量LPS组NT标记荧光阳性细胞数及百分比亦明显高于对照组(P<0.05)。与5 μg/ml LPS相比, LPS+AG组诱生的内源性ONOO-减少, NT标记荧光强度降低(P<0.05); NT阳性细胞数及百分率亦分别减少或降低, 但与5 μg/ml LPS组比较无明显差异(P>0.05) (表1)。

表1. 脂多糖诱导培养的肺动脉内皮细胞生成过氧亚硝基阴离子及氨基胍的影响

Table 1. Endogenous ONOO- formation, number and rate of NT positive cells in cultured BPAECs induced by

LPS and effect of aminoguanidine (n=3)

Group	Fluorescent intensity of NT (AU)	Number of NT positive cells	Rate of NT positive cells (%)
Control	3.27±0.15	1649±260	16.46±2.59
LPS 1 μg/ml	6.36±0.11***	3462±589*	34.60±5.89*
LPS 5 μg/ ml	6.55±0.30***	3866±352*	38.65±3.55*
LPS 10 μg/ ml	7.24±0.40***	3998± 91*	39.96±0.89*
LPS 5 μg/ml+AG	4.20±0.72#	2349±420	27.70±0.30

Content of endogenous peroxynitrite was expressed as fluorescent intensity of NT in BPAECs

(arbitrary unit).

*P<0.05,***P<0.001 vs control group;

#P<0.05 vs 5 μg/ml LPS group．

2.2 LPS诱导BPAECs凋亡的变化及AG的影响

与对照组相比, 不同剂量LPS孵育24 h均可诱导BPAECs凋亡增多, 以高剂量组为显著, 凋亡百分率及凋亡细胞绝对数均明显增高。AG同时孵育可致5 μg/ml LPS引起的BPAECs凋亡百分率及凋亡细胞绝对数均明显降低或减少; 但仍均明显高于对照组(分别为P<0.01和P<0.05)。各组均可见细胞有核染色质浓集缩小、核碎裂等细胞凋亡的征象(图1、2)。

2.3 LPS引起BPAECs线粒体功能的变化及AG的影响

与对照组相比, LPS可剂量依赖性地明显抑制MR、引起Δψ明显下降 (P<0.01)。与5 μg/ml LPS组相比, LPS+AG组MR略有降低(P>0.05), 仍明显低于对照组(P<0.001); Δψ无明显变化

(P>0.05)(表2)。

图1.脂多糖诱导BPAECs凋亡的流式细胞分析DNA组方图和双参数扫描图

Fig. 1.Representative histograms (A－E) and scannings of double parameters (F,G) of apoptotic BPAEC induced by LPS. Solid arrows in figures A－E represent apoptotic peak (AP).

A: Control;

B: 1 μg/ml LPS;

C and F: 5 μg/ml LPS;

D: 10 μg/ml LPS;

E and G: 5 μg/ml LPS+AG.

2, 3 and 4 in scannings of double parameters represent normal cells,

unlabelled cells and apoptotic cells, respectively.

图2.脂多糖诱导培养的BPAECs细胞凋亡率(A)、凋亡细胞数(B)变化以及氨基胍的影响

Fig. 2.Alterations of apoptotic rate (A) and number (B) of apoptotic cells in cultured BPAECs induced by LPS and effect of aminoguanidine.

*P<0.05,

and **P<0.01 vs control group;

#P<0.05 and

##P<0.01 vs 5 μg/ml LPS group.

表２. 脂多糖引起培养的肺动脉内皮细胞线粒体呼吸和膜电位变化及氨基胍的影响

Table ２. Changes in mitochondrial respiration (MR) and membrane potential (Δψ) in cultured BPAECs induced by LPS and effect of aminoguanidine

Group	N	MR (%)	N	Δψ (AU)
Control	6	100.00± 0.00	4	53.66±2.90
LPS1 μg/ml	6	75.77± 4.54***	4	51.25±3.19
5 μg/ ml	6	62.45± 2.87***	4	42.00±1.08**
10 μg/ ml	6	49.51±10.84***	4	35.00±3.60**
LPS 5 μg/ml+AG	6	57.08± 1.82***	4	42.50±3.17

Δψ was expressed as fluorescent intensity of Rodamine 123 (arbitrary unit).

**P<0.01,***P<0.001 vs control group.

2.4 LPS引起培养液上清中MDA含量和LDH活性变化及AG的影响

与对照组相比, LPS可引起培养上清MDA含量明显增多(P<0.01或0.001), 以及LDH活性明显增加(P<0.05－0.001)。与5 μg/ml LPS组比较, LPS+AG组培养上清MDA含量明显降低(P<0.01), 但明显高于对照组(P<0.01); 而LDH活性仅略有降低(P>0.05) (表3)。

表3. 脂多糖引起培养的肺动脉内皮细胞上清液中MDA含量和LDH活性变化及氨基胍的影响

Table 3. Alterations in MDA content and LDH activity in supernatant of cultured BPAECs induced by LPS and effect of aminoguanidine

Group	n	MDA (nmol/mL)	n	LDH (U/L)
Control	7	2.74±0.10	4	53.62±2.90
LPS1 μg/ml	7	3.16±0.14**	4	82.66±3.84**
5 μg/ ml	7	4.14±0.07***	4	85.33±8.66*
10 μg/ ml	7	6.19±0.23***	4	92.66±0.88***
LPS 5 μg/ml+AG	7	3.21±0.22##	4	80.61±3.48

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control group;##P<0.01 vs 5 μg/ ml LPS group．

3 讨论

ONOO-为NO和O·2 的快速非酶促化学反应产物, 是近年来活性氧(reactive oxygen species)和活性氮(reactive nitrogen species)领域中的研究热点。体外化学研究显示, ONOO-具有极强的氧化性, 并能衍生OH·样及NO2等多种氧化剂和具有硝基化修饰能力的分子, 可导致DNA氧化损伤、脂质过氧化以及蛋白质酪氨酸残基硝基化修饰并抑制多种酶分子活性[ 9]。一般认为, 在炎症、缺血再灌注等病理过程中, ONOO-生成可能介导了NO的细胞毒性效应。然而, 有关内源性ONOO-的生物学效应报道较少, 这成为ONOO-在病理过程中是否发挥关键作用的争论焦点。内皮细胞有诱生型和固有型一氧化氮合酶(iNOS、 cNOS), 催化L-精氨酸生成NO, 主要通过黄嘌呤氧化酶体系产生O·2。因此内皮细胞具备产生ONOO-的分子基础。已有报道, 免疫抑制剂Cyclosporine A和血管紧张素Ⅱ可诱导胸主动脉内皮细胞生成ONOO-[ 10, 11]。但关于LPS诱导肺动脉内皮细胞生成ONOO-的规律及其生物学效应迄今未见报道。本实验观察了LPS诱导培养的BPAECs ONOO-的生成规律及其生物学效应。结果显示, LPS可诱导BPAECs生成 ONOO-明显增多, 内源性ONOO-参与介导LPS对BPAECs的损伤作用。

本实验采用流式细胞术定量检测ONOO-标志物NT的含量, 间接反映BPAECs生成ONOO-的情况。结果显示, LPS可以剂量依赖性地引起BPAECs内NT明显增多, 表明LPS可以诱导BPAECs产生ONOO-。我们观察了ONOO-生成与内源性NO的关系, 发现用iNOS选择性抑制剂AG[ 12]可明显抑制LPS引起的NT生成增多, 提示在LPS作用下BPAECs产生的ONOO-有赖于iNOS生成的内源性NO, 进一步证实LPS可以诱导BPAECs生成ONOO-增多。值得说明的是, ONOO-可通过细胞膜阴离子通道弥散出细胞[ 13], 还可与细胞其它成分反应。因此, NT虽然可以反映BPAECs生成ONOO-, 但NT的含量仅仅表示ONOO-的部分生成量。实验还显示, 在不同剂量的LPS组, NT标记荧光阳性细胞绝对数和百分率均明显高于对照组, 而不是全部BPAECs都有NT生成, 说明在LPS作用下只有部分细胞生成了ONOO-, 即细胞对外来刺激的反应并不呈现一致性变化或反应程度不同。对照组部分BPAECs也有NT生成, 提示BPAECs的基础状态也有差异。这种不一致或差异可能恰恰是细胞异质性的体现。我们注意到, 与5 μg/ml LPS组相比, LPS (5 μg/ml)+AG组BPAECs NT标记荧光强度(即ONOO-生成量)明显减少, 而NT阳性细胞绝对数和百分率虽有减少或降低, 但无明显差异, 其原因可能是部分细胞iNOS表达量多, 活性较强, AG对iNOS活性仅起到部分抑制作用, 细胞仍有ONOO-生成, 只是生成ONOO-的量明显减少了。

实验结果显示, 在LPS作用下BPAECs培养上清中的MDA含量明显增多、 LDH活性增加, 并呈现出量效关系。这与LPS诱导内皮源性ONOO-生成增多呈平行性变化。LPS+AG组MDA含量明显减少, 说明内源性NO与MDA含量增多具有因果关系。研究证实, NO本身不能引起脂质过氧化, 而NO与O·2的反应产物ONOO-可明显引起脂质过氧化[ 14]。因此, ONOO-可能介导了氧化作用, 换言之, ONOO-参与介导了LPS引起的氧化应激。在本实验中, AG可以抑制LPS导致的LDH活性增加, 但无显著性差异, 提示NO及ONOO-在细胞释放LDH上仅起部分作用。

细胞凋亡是在基因调控下细胞发生的程序性死亡, 线粒体损伤为启动凋亡的关键因素[ 15]。宋勇等报道, 在LPS诱导急性肺损伤时肺血管内皮细胞凋亡增多[ 16], 这可能是急性肺损伤的重要发病因素。本实验发现, LPS可以诱导BPAECs凋亡增多及MR、 Δψ降低, 并受到AG的抑制。在LPS+AG组, BPAECs凋亡百分率仍明显高于对照组, 说明LPS诱生的NO至少参与介导了部分BPAECs凋亡。在分子水平的研究显示, NO直接作用于纯化的生物大分子如酶分子, 并无明显的分子毒性作用, NO的键级略高于氧分子, 提示NO与O2稳定性相近; 与其它自由基相比, NO的反应活性并不高[ 17] 。在细胞和整体水平的研究提示, 抑制或清除内源性O·

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