生理学报Acta Physiologica Sinica, August
研究论文
人参总皂甙对人GM-CSF和GM-CSFR表达的调控
王莎莉1, 陈笛1, 王亚平2,刘永刚2, 姜蓉2
重庆医科大学基础医学院 1生理教研室, 2组织胚胎学教研室, 重庆 400016
摘要: 为探讨人参调控粒细胞发生的生物学机制, 采用造血祖细胞和骨髓基质细胞体外培养、 造血生长因子生物学活性检测、 免疫细胞化学、 核酸分子原位杂交、 免疫沉淀和蛋白印迹等现代生物学技术, 研究人参总皂甙(total saponins of Panax ginseng, TSPG)对人粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)和粒-巨噬细胞集落刺激因子受体α (GM-CSFRα)表达的影响。结果: (1) 经TSPG (50 μg/ml)诱导制备的骨髓基质细胞、 胸腺细胞、 脾细胞、 血管内皮细胞和单核细胞条件培养液可显著提高粒单系造血祖细胞(CFU-GM)的集落产率; (2) 经TSPG (50 μg/ml)诱导后, 上述细胞的GM-CSF蛋白(诱导24 h)和mRNA(诱导12 h)表达显著提高; (3) 经TSPG (50 μg/ml)诱导24 h骨髓造血细胞的GM-CSFRα蛋白表达增强; (4) 经TSPG (50 μg/ml)刺激后2 min, GM-CSFRα和Shc发生酪氨酸磷酸化, 5 min时达高峰, 随后去磷酸化。上述结果表明, TSPG可能通过直接和/或间接途径促进淋巴细胞与骨髓基质细胞合成与分泌GM-CSF, 诱导骨髓造血细胞表达GM-CSFRα, 并刺激GM-CSFRα和Shc的酪氨酸可逆磷酸化, 从而通过调控GM-CSF的信号转导过程, 促进CFU-GM的增殖。
关键词: 人参总皂甙; 粒单系祖细胞; 粒-巨噬细胞集落刺激因子; 粒-巨噬细胞集落刺激因子受体α; 信号转导
中图分类号: Q462; R331.1
Modulation
of expression of human GM-CSF and GM-CSFRα
by total saponins of Panax ginseng
WANG Sha-Li1, CHEN Di1, WANG Ya-Ping2,, LIU Yong-Gang2, JIANG Rong2
Departments of 1Physiology and 2Histology and Embryology,
College
of Basic Medical Sciences,
Abstract: The purpose of the present study was to investigate the biological mechanism for modulating granulocytopoiesis by Panax ginseng. The techniques of culture of hematopoietic progenitor cells and hematopoietic stromal cells in vitro, biological assay of hematopoietic growth factor (HGF), immunocytochemistry,
in situ hybridization of nucleic acid, immunoprecipitation and Western blot were used to explore the effect of total saponins of Panax ginseng (TSPG) on the expression of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor α (GM-CSFRα). The results indicated that (1) bone marrow stromal cell (BMSC), thymocyte (TC), splenocyte (SC), endothelial cells (EC), and monocyte (MO) conditioned media prepared with TSPG (50 μg/ml) could significantly enhance the proliferation of CFU-GM; (2) the expressions of GM-CSF in protein and mRNA level in BMSC, TC, SC, EC and MO induced by TSPG (50 μg/ml) were much higher than that of the control; (3) the expression of GM-CSFRα protein in hematopoietic cells induced by TSPG (50 μg/ml) was stronger than that of the control; (4) TSPG (50 μg/ml) could stimulate the transient tyrosine phosphorylation of GM-CSFR and Shc protein. We speculate that TSPG may directly and/or indirectly promote the stromal cells and lymphocytes to produce GM-CSF and other cytokine and induce bone marrow hematopoietic cells to express GM-CSF receptors (GM-CSFRα), leading to the regulation of the GM-CSFR-mediated signals transduction pathway and the proliferation of human CFU-GM.
Key words: total saponins of Panax ginseng; CFU-GM; GM-CSF; GM-CSFRα; signal transduction
人参是祖国传统医学的“补气”要药, 人参皂甙是其主要药效成分。我们既往研究表明[1,2]: 人参总皂甙(TSPG)能促进贫血模型小鼠外周血粒细胞的回升; 提高骨髓造血细胞总数和粒系细胞分裂指数; 并能促进造血干/祖细胞的增殖与分化,诱导造血生长因子的产生。但人参皂甙对人的粒单系血细胞发生的影响及其机制研究尚未见报道。本实验采用造血祖细胞、 骨髓基质细胞体外培养、 造血生长因子生物学活性检测、 免疫细胞化学、 核酸分子原位杂交、 免疫沉淀和蛋白印迹等现代生物学技术, 研究TSPG对人粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒-巨噬细胞集落刺激因子受体α (GM-CSFRα)表达的影响, 旨在探讨人参对粒单系血细胞发生调控的分子生物学机制。
1 材料和方法
1.1 人骨髓细胞(hBMC)
取胸外科手术切除肋骨, 供髓者无放、 化疗史, 骨髓细胞涂片检查无造血系统异常。淋巴细胞分离液分离骨髓有核细胞, RPMI-1640培养液洗涤, 过4号针头制备单细胞悬液。人参总皂甙(TSPG), 由重庆中药研究所提供, 纯度98%以上, 用RPMI-1640培养液配成所需浓度。
1.2 主要试剂
RPMI-1640培养液, 美国GIBCO公司产品; 马血清(HS), 中国军事医学科学院提供; 重组人粒单系集落刺激因子(rhGM-CSF), 购自中国军事医学科学院基础医学研究所; 鼠抗人GM-CSF单克隆抗体, 美国Pharmingen公司产品; 小鼠抗人GM-CSFRα、 小鼠抗人Shc、 小鼠抗人磷酸化酪氨酸(p-Tyr)单克隆抗体, 购自美国Stana Cruz生物技术公司。
1.3 GM-CSF寡核苷酸探针合成与标记[3]
上海博亚生物技术有限公司按核酸序列5'-ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGC-3'在DNA合成仪上合成, 经PAGE纯化达99%, 并在5'端用Digoxigenin-11-dUTP进行末端标记。
1.4 人胸腺细胞培养上清液(HTCM)和脾细胞培养上清液(HSCM)的制备
取正常妊娠中晚期(28－35周)引产胎儿的胸腺和脾脏, 按本室常规方法制备[4]。对照组, 常规培养(不加丝裂原或抗原); TSPG组, 培养体系中加TSPG(终浓度50 μg/ml); 刀豆蛋白A (ConA)对照组, 培养体系中加ConA(终浓度10 μg/ml)。分组加药后, 置于37℃ 含5% CO2的培养箱中培养24 h, 离心收集培养上清液。
1.5 人骨髓基质细胞条件培养液(HBMSCM)的制备
按Dexter等方法制备[5]。实验分组同1.4, 脂多糖(LPS)对照组, 为培养体系中加LPS(终浓度10 μg/ml)。分组加药后培养24 h, 离心收集培养上清液。
1.6 人内皮细胞培养上清液(HEcCM)与人单核细胞培养上清液(HMCM)的制备
人脐静脉内皮细胞株(EcV304)和人单核细胞株(THP-1)购自中国科学院上海细胞生物学研究所。实验分组同1.4, 白介素-1 (IL-1)对照组, 为培养体系中加IL-1 (终浓度100 U/ml)。分组加药后, 置于37℃含5% CO2的培养箱中培养24 h, 离心收集各组培养上清液。
1.7 TSPG诱导制备的各种细胞培养上清液中所含GM-CSF的生物学活性检测
粒单系造血祖细胞(colony forming unit-granulocyte/macrophage, CFU-GM)体外琼脂半固体培养、 集落染色鉴定与计数按本室常规方法进行[6,7]。对照组, 在常规CFU-GM体外琼脂半固体培养基础上分别加10% (v/v)未经刺激制备的各种细胞培养上清液; TSPG组, 在常规培养基础上分别加10% (v/v)经TSPG诱导制备的各种细胞培养上清液; 诱导剂组, 在常规培养基础上分别加10% (v/v)经诱导剂(ConA、 LPS、 IL-1)诱导制备的各种细胞培养上清液。根据1×105 BMC所生成的CFU-GM集落数, 评价其上清液中GM-CSF生物活性。
1.8 TSPG对GM-CSF蛋白表达的检测
将对照组、 TSPG组(50 μg/ml, 作用24 h)和诱导剂组的单核细胞、 胸腺细胞和脾细胞离心涂片到经多聚赖氨酸包被的载片上, 骨髓基质细胞和内皮细胞直接贴片生长在载片上, 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase, SP)免疫细胞化学技术检测细胞内GM-CSF蛋白表达[8]。每张载片计数300个细胞, 计算GM-CSF蛋白表达阳性率。
1.9 TSPG对GM-CSF mRNA表达的检测
细胞离心涂片与贴片制备同1.8(药物作用时间为12 h)。4%多聚甲醛固定15 min, PBS洗片。按原位杂交试剂盒所示方法进行操作。每张载片计数200个细胞, 计算阳性细胞的百分比。
1.10 TSPG对GM-CSFRα蛋白表达的检测
将hBMC分为: 对照组, 在含10%马血清的RPMI-1640培养液中培养24 h (BMC 1×105/ ml); TSPG组, 在常规培养基础上, 加入TSPG 50 μg/ml作用24 h; IL-1对照组, 在常规培养基础上加IL-1 100 U/ml , 作用24 h。离心涂片到经多聚赖氨酸包被的载片上, 采用SP免疫细胞化学检测骨髓造血细胞GM-CSFRα蛋白表达。每张载片计数300个细胞, 计算GM-CSFRα蛋白表达阳性率。
1.11 TSPG对GM-CSFRα和Shc蛋白酪氨酸磷酸化影响的检测
实验分组: (1)对照组, 在含15%马血清的RPMI-1640培养液中培养hBMC (1×106/ml); (2) TSPG组, 在常规培养体系中加TSPG (终浓度50 μg/ml); (3) GM-CSF对照组, 加GM-CSF 20 ng/ml。分别在诱导2、 5和15 min后终止反应, 经细胞裂解液裂解, 将裂解产物用抗GM-CSFRα抗体或抗Shc抗体免疫沉淀后, 再用抗p-Tyr抗体做Western印迹, 以检测GM-CSFRα和Shc蛋白的酪氨酸磷酸化。
1.12 统计学方法
数据以mean±SD表示, 经SAS统计软件进行方差分析、 SNK和Dunnett t检验等。
2 结果
2.1 TSPG诱导制备的各种细胞培养上清液中所含GM-CSF生物活性的检测
与未经刺激的各种细胞培养上清液相比, 经TSPG体外诱导制备的相应细胞培养上清液能不同程度地促进CFU-GM的增殖(表1), 提示经TSPG诱导后细胞培养上清液中所含GM-CSF的活性增加。推测TSPG能诱导骨髓基质细胞、 内皮细胞、 单核细胞、 胸腺细胞和脾细胞生成GM-CSF样活性物质。
2.2 TSPG对GM-CSF蛋白表达的影响
经TSPG体外诱导24 h后, 人骨髓基质细胞、 内皮细胞、 单核细胞、 胸腺细胞和脾细胞表达GM-CSF蛋白的阳性率显著高于相应对照组(表2)。
表1. TSPG诱导制备的人骨髓基质细胞、 内皮细胞、 单核细胞、 胸腺细胞和脾细胞条件培养液对CFU-GM增殖的影响
Table 1. Effect of human bone marrow stromal cells, endothelial cells, monocytes, thymocytes and splenocytes conditioned media induced by TSPG on development of CFU-GM (number of CFU-M/1×105 BMC, mean±SD, n=24)
|
Group |
Control |
TSPG |
Inducers* |
|
HBMSCM |
60.83±7.38 |
74.65±9.65** |
77.04±7.92** |
|
HEcCM |
55.43±5.65 |
66.52±5.21** |
65.04±6.31** |
|
HMCM |
59.35±7.29 |
73.22±8.90** |
68.57±9.37** |
|
HTCM |
63.39±7.08 |
78.09±8.44** |
76.30±7.54** |
|
HSCM |
65.43±10.85 |
75.39±6.15** |
71.57±6.07** |
*HBMSCM prepared by adding 10 μg/ml LPS, HEcCM and HMCM by adding 100 U/ml IL-1,
HTCM and HSCM by adding 10 μg/ml ConA.
**P<0.05 compared with control.
表2. TSPG对人骨髓基质细胞、内皮细胞、单核细胞、胸腺细胞和脾细胞表达GM-CSF蛋白的影响
Table 2. Effect of TSPG on the expression of GM-CSF protein in human BMSCs, endothelial cells, monocytes, thymocytes, and splenocytes (GM-CSF protein positive cell ratio, mean±SD, n=5)
|
Group |
Positive ratio (%) |
||
|
Control |
TSPG |
Inducers* |
|
|
HBMSCs |
22.50±5.23 |
39.68±8.97** |
42.62±8.16** |
|
Endothelial cells |
15.13±4.10 |
27.30±2.43** |
34.16±3.50** |
|
Monocytes |
19.04±2.51 |
32.83±8.88** |
29.66±3.06** |
|
Thymocytes |
12.29±3.54 |
22.13±1.77** |
23.65±2.87** |
|
Splenocytes |
17.28±3.28 |
35.80±2.68** |
36.56±2.84** |
*BMSCs were induced by 10 μg/ml LPS, endothelial cells and monocytes by 100 U/ml IL-1,
thymocytes and splenocytes by 10 μg/ml ConA for 24 h.
**P<0.05 compared with control.
2.3 TSPG对GM-CSFmRNA表达的影响
经TSPG诱导12 h后, 骨髓基质细胞、 内皮细胞、 单核细胞、 胸腺细胞和脾细胞的GM-CSFmRNA表达阳性率与对照组相比, 均有不同程度的提高(表3)。
2.4 TSPG对GM-CSFRα蛋白表达的影响
经TSPG诱导24 h后, 骨髓造血细胞表达GM-CSFRα蛋白的阳性率与对照组相比, 有明显的提高(表4)。
表3. TSPG对人骨髓基质细胞、内皮细胞、单核细胞、胸腺细胞和脾细胞表达GM-CSFmRNA的影响
Table 3. Effect of TSPG on the expression of GM-CSF mRNA in human BMSCs, endothelial cells, monocytes, thymocytes, and splenocytes (GM-CSF mRNA positive cell ratio, mean±SD, n=5)
Positive ratio (%)
|
Group |
Control |
TSPG |
Inducers* |
|
BMSCs |
20.82±3.50 |
44.38±3.67** |
46.08±5.76** |
|
Endothelial cells |
16.90±3.27 |
28.30±1.75** |
31.32±4.62** |
|
Monocytes |
26.88±4.88 |
50.38±3.79** |
52.86±4.47** |
|
Thymocytes |
15.04±3.22 |
25.82±2.73** |
27.08±2.84** |
|
Splenocytes |
23.46±4.28 |
42.20±6.15** |
44.24±6.08** |
*BMSCs were induced by 10 μg/ml LPS, endothelial cells and monocytes by 100 U/ml IL-1,
thymocytes and splenocytes by 10 μg/ml ConA for 12 h.
**P<0.05 compared with control.
图1.TSPG诱导人骨髓细胞中GM-CSFRα酪氨酸可逆磷酸化
Fig. 1.TSPG-induced tyrosine phosphorylation of GM-CSFRα in hBMC.
IP, GM-CSFRα; WB, p-Tyr. Lane 1, no lysates; lane 2,6, unstimulated; lane 3－5, TSPG-induced (2, 5, 15 min);
lane 7－9, GM-CSF-induced (2, 5, 15 min)．
表4. TSPG对人骨髓造血细胞表达GM-CSFRα蛋白的影响
Table 4.Effect of TSPG on the expression of GM-CSFR α protein in human BMCs (mean±SD, n=5)
|
Group |
GM-CSFRα positive cell ratio (%) |
|
Control |
44.10±5.50 |
|
TSPG |
58.44±6.73* |
|
IL-1 |
59.50±8.02* |
*P<0.05 compared with control.
2.5 TSPG对GM-CSFRα和Shc蛋白酪氨酸磷酸化的影响
分别用TSPG和GM-CSF诱导2、 5和15 min后制备细胞裂解产物, 用抗GM-CSFRα抗体免疫沉淀后, 再用抗p-Tyr抗体做Western印迹, 结果显示: 经TSPG或GM-CSF刺激后2、 5和15 min, 在80 kD处出现一组棕黄色条带,其中以TSPG刺激后5 min和GM-CSF刺激后2 min处更为明显。表明TSPG刺激后2 min GM-CSFRα发生酪氨酸磷酸化, 5 min时达高峰, 随后去磷酸化, 而用GM-CSF刺激后2 min出现酪氨酸磷酸化的高峰, 随后去磷酸化(图1)。
分别用TSPG和GM-CSF诱导2、 5和15 min后, 制备细胞裂解产物, 用抗Shc抗体免疫沉淀后, 再用抗p-Tyr抗体做Western印迹, 结果显示: 经TSPG或GM-CSF刺激后2、 5和15 min, 在52 kD处出现一组棕黄色条带,其中以TSPG或GM-CSF刺激后5 min处更为明显。表明TSPG或GM-CSF刺激后2 min时有酪氨酸磷酸化, 5 min时达高峰, 随后去磷酸化(图2)。
图2.TSPG诱导人骨髓细胞中Shc酪氨酸可逆磷酸化
Fig. 2.TSPG-induced tyrosine phosphorylation of Shc in hBMC.
IP, Shc;
WB, p-Tyr.
Lane 1, no lysates;
lane 2, unstimulated;
lane 3－5, TSPG-induced (2, 5, 15 min);
lane 6－8, GM-CSF-induced (2, 5, 15 min).
3 讨论
粒细胞与单核-巨噬细胞起源于粒单系造血祖细胞(CFU-GM),
CFU-GM膜表面有与粒单系集落刺激因子(GM-CSF), 机体的粒单系造血调控主要在此阶段进行。我们既往研究证明[1, 2 ], 人参皂甙是人参促进血细胞发生的有效成分之一。人参总皂甙(TSPG)能促进小鼠造血干/祖细胞的增殖分化。本研究在动物实验基础上深入探讨TSPG对人粒单系血发生的影响及其调控机制。该实验前期工作结果表明:
在CFU-GM培养体系中, 若有外源性GM-CSF存在时, 当加入TSPG 10 μg/ml即表现出对CFU-GM增殖的刺激作用, 且在一定范围内随着加入TSPG浓度提高,
集落产率也逐步增加。若不加入外源性GM-CSF而用TSPG替代, 则无CFU-GM形成。这说明TSPG并不具有生长因子样作用, 它可能通过其它途径调控粒单系血细胞的发生。
造血诱导微环境(hematopoietic inductive
microenvironment, HIM)是造血干/祖细胞定居、 增殖和分化的场所, 构成HIM核心成分的是骨髓基质细胞, 它包括成纤维细胞、 巨噬细胞、 内皮细胞和载脂细胞等。实验证明骨髓基质细胞不仅作为血细胞增殖分化的支架,
而且还可能通过细胞间直接接触和分泌多种造血生长因子来调节血细胞生成[9]。体外建立的基质细胞层正好模拟了体内HIM, 是公认研究HIM对造血细胞增殖分化的理想模型。本研究结果证明, 在CFU-GM培养体系中加入经TSPG诱导制备的骨髓基质细胞、 血管内皮细胞和巨噬细胞的培养上清液,
能促进CFU-GM集落产率的提高。现代研究表明: 被激活的T、 B淋巴细胞可分泌大量的GM-CSF和其它造血调控因子来促进粒单系血细胞的发生[4,10]。本研究结果显示:
在CFU-GM培养体系中加入经TSPG诱导制备的胎儿胸腺细胞和脾细胞的培养上清液能提高CFU-GM的集落产率。这提示其培养上清液中含有GM-CSF样活性, 能部分替代外源性GM-CSF的作用。
造血生长因子与造血细胞膜上相应的受体结合, 所启动的信号转导是当今造血调控分子生物学机制研究的核心内容。尽管在CFU-GM的增殖分化中受到诸多造血调控因子的控制,
但GM-CSF与GM-CSF受体相互作用却是粒单系血细胞发生调控的关键环节。本研究采用免疫细胞化学和核酸分子原位杂交技术证明了经TSPG诱导后骨髓基质细胞、 巨噬细胞、
内皮细胞和淋巴细胞的GM-CSF的蛋白表达水平和mRNA表达水平显著提高, 且经TSPG诱导后在骨髓造血细胞膜上GM-CSFRα表达水平提高。这提示TSPG一方面可能通过促进骨髓基质细胞和淋巴细胞合成和分泌GM-CSF等造血调控因子来调控粒细胞和巨噬细胞的发生,
另一方面也能通过增强造血干/祖细胞的GM-CSFRα表达, 从而促进人粒单系造血。
GM-CSFR属I型细胞因子受体超家族成员, 它与GM-CSF结合后可活化和募集大量胞浆内酪氨酸激酶,
引起受体自身及一系列信号蛋白分子的磷酸化和去磷酸化, 启动信号转导过程。本项研究采用免疫沉淀和Western印迹法检测了经TSPG诱导后骨髓造血细胞GM-CSFRα和Shc蛋白的酪氨酸磷酸化。结果表明,
经TSPG刺激后GM-CSFRα发生一过性的酪氨酸磷酸化, 5 min时磷酸化达高峰, 随后去磷酸化。说明TSPG可能激发GM-CSFRα的可逆磷酸化, 启动下游信号转导。但TSPG是如何促进GM-CSFRα可逆磷酸化的机制尚有待进一步探讨。Shc是一种接头蛋白,
它参与多种类型受体介导的信号转导过程, 在GM-CSFR介导的信号通路中Shc也是一个重要的信号蛋白。我们的实验结果表明, 经TSPG刺激后Shc酪氨酸磷酸化增强,
说明TSPG可能直接或间接促进Shc的磷酸化, 增强其下游的信号转导过程, 从而调控粒单系血细胞生成。
综上所述, 我们推测TSPG可通过直接和/或间接途径诱导骨髓基质细胞和淋巴细胞合成分泌GM-CSF, 刺激造血细胞表达GM-CSFRα, 促进GM-CSFRα和Shc的酪氨酸可逆磷酸化, 从而调控GM-CSFR介导的信号转导过程, 最终促进CFU-GM的增殖。这也许是人参促进粒细胞发生的生物学机制之一。
参考文献
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