生理学报 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2004, 56(6): 735-742

http://www.actaps.com.cn

Received 2004-04-06 Accepted 2004-07-23

This work was supported by the important research direction of Chinese Academy of Sciences, the brain mechanism of drug addiction (KSCX2-SW), the National Natural Science Foundation of China (NO.30070252), the Brain and Mind Research Program of Chinese Academy of Sciences (KJCX1-07), the research program of western China of China Academy Sciences and the Natural Science Foundation of Yunnan Province.

*Corresponding author. Tel: +86-871-5194464; Fax: +86-871-5191823; E-mail: yuanma0716@vip.sina.com

一种用于吗啡心理渴求研究的自由活动动物神经元胞外记录法

刘素青1,2,吴 晶1 ,杨建珍1,田少华1 ,陈南晖1,雷衍林1,2,彭沿平 1,王建红1,马原野1,*

1中国科学院昆明动物研究所灵长类认知实验室, 昆明 650223; 2中国科学院研究生院, 北京 100039

摘 要: 本文描述了一种将环境线索相关的大鼠吗啡成瘾模型与一种适用于自由活动动物的神经元单位放电胞外记录法相结 合的实验方法。该方法成功地用于研究成瘾大鼠海马CA1区神经元的放电特征,从而在动物行为的基础上寻找到更为准 确、客观的细胞学特征,并试图将这种细胞学特征作为成瘾动物特有的电生理学指标之一。

关键词: 单位放电; 自由活动大鼠; 线索相关; 吗啡戒断; 海马

中图分类号: Q426

Methods for single unit recording in behavioring morphine craving rat

LIU Su-Qing1,2, WU Jing1, YANG Jian-Zhen1, TIAN Shao-Hua1, CHEN Nan-Hui1, LEI Yan-Lin1,2, PENG Yan-Ping1, WANG Jian-Hong1, MA Yuan-Ye1,*

1Section of Primates Cognitive Brain Research, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China; 2Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China

Abstract: In this paper, one method was introduced, which was a combination of the cue-related morphine addiction model and a technique for obtaining chronic extracellular recordings of single unit in freely moving rats. With the combination and improvement of this technique, we have successfully applied this new method to study the neuronal activity of the hippocampus CA1 region in morphine withdrawal rats. In all, we found some more accurate and objective cellular characteristics of hippocampal neurons, and considered these characteristics as one of electrophysiological indexes of morphine addiction rats.

Key words: single unit recording; freely moving rat; cue-related; morphine withdrawal; hippocampus

重复性的药物滥用所导致的最严重的后果就是成瘾 [1]。动物对成瘾药物的依赖,分为生理依赖(physical dependence)和心理依赖(psychic dependence)。当已成瘾动物被强制性给予戒断治疗时,动物可以完成生理脱毒过程,即可脱离对药物 的生理依赖;但成瘾动物即使在完成生理脱毒以后,仍然会有渴求欣快感的强烈欲望,从而驱使完 成生理戒断的动物继续寻求药物,即对药物仍存有心理依赖。因此,如何戒除成瘾动物对药物的心理 依赖是治疗成瘾过程中所面临的核心问题。

关于成瘾动物的研究,目前已经有了许多行为学上的指标(如大鼠在成瘾及戒断过程中的不同阶段 会有不同的行为表现等[2,3]),但对生理学指标方面 的研究却寥寥无几。为了研究处于吗啡戒断状态大鼠的生理学特征指标,我们建立了环境条件线索相 关的大鼠吗啡成瘾模型。其理论基础为[4,5]: 已知情感性(affective)刺激(如奖赏或惩罚)可以诱导机体产 生趋向或避开刺激的行为反应,如果该情感性刺激与中性环境刺激相结合,则可以使得中性环境刺激 获得与情感性刺激相似的能力,即也能诱导机体产生趋向或避开刺激的行为反应。因此,将某种药物 的作用与某种环境条件相结合以后,则可以通过动物对该环境条件的生理反应来判断该药物的奖赏或 惩罚效应。

自从20世纪30年代神经元单位放电胞外记录方法建立以来,该技术就成为了神经生理学研究的重 要手段之一。通过不断的改进与发展,该方法由仅限于固定、半固定动物上的应用,逐渐发展为同样 适用于自由活动动物。并且,也逐渐由单细胞记录向同时记录多个细胞的方向发展 [22]。微电极也由最初的玻璃微电极逐渐发展为钨丝微电极、镍铬合金 丝、铂金丝、及硅探针等[30-32]。微电极推进器主 要可分为三类[23],水压推进式、齿轮推进式、螺 杆推进式。其中螺杆推进式微电极是由Ranck在1973年首创 [24], 但存在较严重的缺陷,即电极在向下移动的过程中, 电极自身会随螺杆的旋转而旋转, 较大程度的损伤了脑组织的同时也为神经元电信号记录带来了不便。之后, Goldberg, Deadwyler, Bland, McNaughton[12,28]等人对该方法进行了改进 [25-27], 避免了上述缺陷的出现。本文所描述的微电极及微推进器主要是以 McNaughton实验室的单道微电极[12,28]为基础,从电极取材、制作工艺、神经元电信号 输入、放大器处理系统等方面入手,对该方法进行了进一步改进。

将环境条件线索相关的大鼠吗啡成瘾模型与一种适用于自由活动动物的神经元单位放电胞外记录 法相结合,能够从细胞水平研究处于戒断状态的大鼠在生理学方面的特征性指标。目前,我们已经利 用该方法开展了一系列有关动物成瘾的研究,在本文中仅介绍该方法在研究吗啡相关环境与大鼠海马 之间关系方面的应用。通常认为,边缘系统的多巴胺功能异常是导致成瘾药物寻求及复吸行为出现的 主要原因, 海马作为边缘系统的主要结构之一, 与药物成瘾密切相关, 但具体的机制却仍未完全明了[34]。海马是与记忆密切相关的脑区,在将短时记忆向长 时记忆转化的过程中起着重要作用[6-8]; 海马的活动能够唤起动物对环境条件线索相关的恐惧记忆的提 取[29]; 同时,海马中存在着大量与吗啡成瘾过程密切相关的阿片类受体 m受体[9,10]。另外,一些分子水平的研究也表明海马与吗啡成瘾之间存在密切的 联系,如重复性的阿片滥用会导致海马突触谷氨酸吸收的增加,从而影响了海马突触神经递质传递的 可塑性[11]。那么海马是否也参与了成瘾动物对吗啡 的记忆储存与提取呢?我们将该方法应用于寻找成瘾大鼠海马 CA1区神经元在吗啡相关环境及无关环境中活动的特征。

1 材料与方法

1.1 电生理实验记录流程 实验采用的神经元胞外记录法的主要装置包括微电极, 微电极推进器, 前置放大器, 主放大器及信号记录、处理系统(图1)。其技术核心在于微电极及与之配合的信号放大器。

图 1. 电生理记录装置流程图

Fig. 1. The system flow chart.

1.2 微电极及微推进器

1.2.1制作微电极及微推进器所需材料 本文所介绍的微电极是以直径为15 mm特福龙绝缘的镍铬合金丝[12] (California Fine Wire, Grover Beach, CA, USA)或上海申欢电磁线有限公司生产的GA-1型直径为38 mm的漆包线为电极丝制作的单道微电极。微电极及微推进器(图 2)主要由内外两个同心的圆柱形套管构成。推进器外管由1 ml一次性注射器外部套管(1)改制,直径约6 mm; 推进器内杆(2)可上下移动; 在推进器外管顶部固定有一个#0-80型螺杆及配合的螺帽(3 ); 推进器内杆底部与由6号注射器针头制成的电极引导外管(4 )紧密相连;在电极引导外管的内部套有两根粘附在一起的毛细管色谱柱( 5) (毛细管色谱柱的外径约为300 mm,中国科学院兰州化学物理研究所),稍长的一根为参考电极,稍短的一根为记 录电极,两根毛细管色谱柱中各有一根电极丝;另外,在推进器内外管之间有推进器固定块( 6)连接,这样在旋转螺杆时,推进器内杆只能上下移动而不会旋转。

图 2. 微电极及微推进器(引自Lei YL et al., 2004[17])

Fig. 2. Drivable microelectrode assembly (modified from Lei YL et al., 2004[17]). The entire assembly, which was fastened to the stainless steel base, was anchored to the skull with dental cement applied around the base and the outer cylinder.

1.2.2微电极及微推进器的使用 在使用前用锋利的剪刀将两根电极丝分别剪至合适的长度,长的一 根为记录电极,短的一根为参考电极。另外,在使用前还需在电极尖端镀金 [13]以得到合适的电阻(通常约为1 MW)。在以漆包线为电极丝制作微电极时,我们在整个漆包线表面涂有一层 502胶以达到绝缘的目的,再加上在漆包线尖端镀金,有效地避 免了铜离子与动物大脑的直接接触。参考与记录电极的尖端在很大程度上决定了实验记录结果的好坏, 电极丝露出毛细管色谱柱的距离如果太长,则刚性不够,向下的过程中易弯曲,太短则柔韧性不够, 信号记录不稳定。通常,电极丝尖端露出毛细管色谱柱的距离约为 0.5 mm,参考电极与记录电极之间的距离在0.5~1 mm之间。微电极螺杆每旋360°,电极向下或向上移动330 µm,并可根据需要设定最大推进距离。

1.3 前置放大器与主放大器 前置放大器与主放大器均由12 V直流双电源供电。前置放大器(跟随器)由一块LF347(输入阻抗高: 1012W; 低噪声: 0.01 pA/ )的集成块制成。通过主放大器的分级放大,信号最终被放大 2 500 到 5 000 倍。

1.4 行为实验装置 行为实验装置由两只各自独立且互不连通的大小一致的(45 cm×45 cm×30 cm)木质行为箱构成(图3): 其中一只箱在四壁贴有黑白相间的竖条纹,底板光滑;另一只箱四壁为白 色,底板为深色粗糙材料。在两只木质行为箱上空的适当位置分别固定有一个摄像头,用于在记录 神经元电活动的同时同步记录动物的行为。神经元电信号通过录像机( Panasonic VSH Japan)的音频道记录、动物行为通过录像机的视频道记录,两者 同步记录并保存在录像带上。

图 3. 行为实验装置

Fig. 3. Conditioning chambers. Randomly chose one chamber as the positive chamber, the other one as the negative chamber.

1.5 动物及分组 选择成年雄性SD(Sprague Dawley)大鼠,均由昆明医学院实验动物中心提供,手术时体重在 280~300 g。所有实验用鼠自购回后在本实验室饲养间至少适应一周。大鼠单个饲养于透明 的塑料饲养笼中, 24 h提供饮水及食物, 照明与黑暗时间为12 h交替, 动物的手术及实验记录时间通常保证在9:00~15:00之间进行。大鼠随机分为两 组:对照组(生理盐水组, n=5)与药物组(吗啡组, n=9)。

1.6 实验过程

1.6.1 埋置基座 经过一周待动物充分熟悉环境之后,进行第一次手术,埋置基座。首先腹腔注射戊巴比 妥钠(50 mg/kg)麻醉动物,待动物完全麻醉之后(如睫反射消失等),即可开始手术。在手术过程中, 需要视具体情况每隔30~60 min补充一次麻醉剂,以维持动物的麻醉深度。之后,在动物头部皮下注 射少许盐酸利多卡因,将动物固定在立体定位仪上,在无菌条件下剪开动物的头皮,除去肌肉及骨 膜,将头骨完全暴露,并用适量3%的双氧水擦拭头骨表面, 以达到完全清洁颅骨表面的目的。待头骨表面完全干燥后, 准确定位海马CA1区(前囟后4.0 mm, 旁开3.0 mm)[14],并将基座(金属注射器针头从尾部剪断后磨平)放置在恰当的位置,一个不 锈钢小螺钉(直径约1 mm)钻入左侧枕部作为地线。此外,2~4个类似的小螺钉也钻入颅骨的其他部分 以起加固作用。完成之后,用齿科塑料覆盖整个头骨表面,固定基座及地线。最后,给动物注射抗 生素以防伤口感染。

1.6.2 建立成瘾动物模型 动物在第一次手术后恢复10 d之后,建立成瘾大鼠模型。首先,在正式吗啡或生理盐水注射之前,大鼠适应两个行为箱 (分别30 min/d),连续5 d,使动物充分熟悉两个环境。从第六天开始,每只大鼠随机选择一只行为 箱(如在本实验中以黑白条纹箱为例)作为阳性环境,在大鼠腹腔注射吗啡后,立即置于黑白条纹箱中, 一小时后回到饲养笼, 早晚各一次, 间隔12 h, 连续6 d。吗啡(盐酸吗啡, 溶解于0.9 %生理盐水中)剂量为:第一天8 mg/kg,第二天、第三天依次递增至15 mg/kg与30 mg/kg,并在第四、第五、第六天维持在30 mg/kg的水平,第六天仅注射一次(白天)[33]。实验对照组注射生理盐水,其余条件相 同。

1.6.3 插入电极 最后一次吗啡给药完毕后,准备第二次手术,插入微电极。麻醉、固定方法同第 一次手术,用电钻在基座的中央打孔,将准备好的电极插入,接好与前置放大器相应的连线,用齿科 塑料将前置放大器固定在第一次手术时在动物颅骨表面覆盖的齿科塑料上,外部用绝缘胶布包好。给 动物注射抗生素。

1.6.4 记录电信号程序 第二次手术后次日开始实验记录,动物先被放入阳性环境(如以黑白条纹箱为 例)中5 min,随后放入阴性环境(如以白色箱为例)中5 min,以10 min为一个记录周期。每只动物每次实验重复五个记录周期,即每次实验时间为 50 min。连接两个放大器的电缆为约50 cm柔软的五线平行电缆,由于大鼠在行为箱中向左向右转的几 率基本相等,因此一般情况下电缆的轻度缠绕不会给动物的行为造成不便。如果缠绕很严重,将前放 与主放的插头重新插拔一次松开扭结即可。在用摄像头记录动物在两个环境中活动的同时,通过录像 机的音频道同步记录大鼠海马CA1区神经元在整个实验过程中的活动。

1.6.5 数据保存及统计分析 将保存在录像带音频道上的神经元单位放电信号回放,用 AD板采样,采样频率为20 kHz,在计算机中用本实验室编制的单位放电分离软件分离出单个的神经元放电。该软 件已申请了专利(申请号200310111149.9),并在国内外相关研究中得到应用,能够可靠的用于神经元 单位放电的分离。同时能够保证神经元放电信号和行为活动之间的时间同步性。之后,根据动物所处 的不同环境(阳性环境或阴性环境)而将放电分为两组,比较海马神经元放电频率在不同环境中的差 异。各组实验数据均以mean±SEM表示。组间差异的比较采用双尾 t test,P<0.05表示在统计学上有显著差异。

2 结果

2.1吗啡戒断症状的行为学观察

在最后一次注射吗啡后第28 h左右,对吗啡组大鼠进行了自发戒断症状的行为学观察和记录,同 时也观察和记录了生理盐水组大鼠相关的行为反应,并对两者间的差异作了统计分析。大鼠被放入 一个干净且对于大鼠而言为新异的塑料桶内(直径35 cm, 高度45 cm), 在随后的30 min内, 大鼠的湿狗式震颤次数(wet-dog shake), 咀嚼(mastication)次数, 扭转(writhing)次数, 每5 min间隔内出现眼睑下垂(ptosis)的次数被记录。通过与生理盐水组的统计分 析(图4),表明本实验采用的吗啡剂量及给药方式能够可靠的诱导大鼠对吗啡的身体依赖 [15,16]

图 4. 吗啡组及对照组大鼠在药物戒断后28 h的自发阶段症状的统计学分析

Fig. 4. Analysis of morphine-induced physical dependence. Incidence of somatic signs of abstinence (mean±SEM) measured during spontaneously withdrawal at 28 h after last morphine injection in morphine-experienced rats (n=9) versus Saline-experienced rats (n=5, *P<0.05).

2.2 神经元电信号记录质量

本文所描述的神经元单位放电胞外记录法所记录到的神经元放电信号稳定,可持续记录单个神经 元放电1~2 h, 信号信噪比高(图5), 电极寿命长,在大鼠脑中可连续使用14 d左右, 一次穿插可记录1~5个单个神经元。该方法在自由活动猴上的应用也取 得了较好效果[17]

图 5. 大鼠海马CA1区神经元放电原始波形图

Fig. 5. Single-cell recording from hippocampal CA1 region of freely moving rat in conditioning chambers.

2.3大鼠海马CA1区神经元发放特征

在停止注射药物后的1~8 d内,经组织学检查后(电极深度约为2.1~2.4 mm),9只处于吗啡戒断状态的大鼠海马CA1区共记录到163个细胞,其中 有65个(39.9 %)神经元活动与特定环境(吗啡注射环境)相关(图6B 为P-4-01号神经元)。5只对照组大鼠海马CA1区共记录到85 个细胞,其中有36个(42.4 %)神经元活动与特定环境(生理盐水注射环境)相关(图6 A为N-4-01号神经元)。所记录到的神经元发放频率在2~30 Hz之间。

图 6. 神经元发放频率示意图

Fig. 6. Typical neuron's activity showed the different frequency between the positive and negative chamber. A: The spike frequency of one of the condition-related neuron (No. N-4-01) at the 4th day of the saline-experienced rat (P<0.05). B: The spike frequency of one of the condition-related neuron (No. P-4-01) at the 4th day of the morphine withdrawal rat (P<0.001). (white bar means the rat in positive chamber, and shadowed bar means the rat in negative chamber).

另外,通过比较各天吗啡组与对照组海马CA1区神经元在阳性环境与阴性环境中发放频率的变化 率,可以看出在停药后的第二、三、四天吗啡组大鼠神经元发放频率的变化率统计学分析存在显著 性差异(P<0.05)(图7)。变化率=[(a-b)/a]×100% (a=阳性环境中神经元的发放频率,b=阴性环境中神经元的发放频率 )。

图 7. 停止药物注射后第二、第三、第四天神经元发放频率的变化率

Fig. 7. Analysis of the change percentage of the hippocampus CA1 neuron spike frequency between the positive and negative environment. The neuron spike change percentage of the 2nd, 3rd, 4th day after the drug withdrawal of morphine-dependent rat versus saline-experienced rat has been showed. (White bar means the average value of the change percentage of the morphine-dependent rat, shadowed bar means the average value of the change percentage of saline-experienced rat. *P<0.05).

3 讨论

本文所描述的神经元单位放电胞外记录法较以往的同类方法而言,主要在以下方面做出了改进: 首先,在微电极的制作过程中,采用共模输入方式,即将记录电极与参考电极的位置紧贴在一起, 仅在露出尖端的长度上略有差异,改变了传统方法中将参考电极紧贴动物颅骨的做法,这样既减少了 动物活动时肌电带来的干扰,又能有效地减少50 Hz的电流干扰。其次,用隔离电源的方法来克服振荡,减少了各级放大器之间的相互干扰,即用四 组12 V的电池供电分别为一级跟随器、两级放大器、一级滤波器供电。

通过改进,本文所描述的神经元单位放电胞外记录法具有以下几个显著优点:(1)该记录系统体积 小,质量轻,微电极及推进器净重仅2 g, 固定在大鼠颅骨上的微电极、推进器、前置放大器、齿科塑料及其它固定装置的全部重量约为 7 g, 不影响大鼠的自由活动;(2)该系统电学稳定性较好,且信号信噪比高;(3)适用于清醒动物在自由活动状态 下的胞外记录,使得神经元电活动与动物行为之间的联系尽可能的接近动物自然的本能状态,不受麻 醉、外科手术、行为限制等影响;(4)该方法适用于多种实验动物, 如: 本实验室已将该方法应用于大鼠、狗、猴[17] 等;(5)该方法使用方便、灵活,既可单独使用,又可与其它实验模型(如与环境线索 相关的大鼠吗啡成瘾模型)相结合。

将环境线索相关的大鼠吗啡成瘾模型与上述电生理学方法相结合具有以下几点优势:首先,传统 的单纯行为学观察实验模型(如CPP)虽然能够建立起动物对于成瘾药物(如:吗啡)的学习性获得及学习 性戒断[21]过程,但主要是一种基于动物行为水平的 观察,而自由活动动物的行为往往具有很大程度的随机性,不同动物之间又具有较明显的个体差异, 这样,即使吗啡已经对动物的生理及心理状态产生了影响,这种影响仍然极有可能被掩盖在动物的随 机行为活动中而难于发现[18]。通过这种方法上的结 合,可以从细胞水平来观察药物对动物的作用,从而在某种程度上避免了观察者主观感觉对实验结果 的影响。这种细胞水平的指标相对于单纯的行为学观察而言更加灵敏、客观、可靠。

其次,这样的结合可用于分析动物不同脑区与吗啡成瘾之间的联系。例如,已知在大脑中存在着 与奖励相关的回路[19],如边缘系统、DA等,而对 于吗啡这种有别于其他奖励刺激(如食物奖励)的极端奖励而言,是否是同样的回路在发挥作用,其作用 机制是否相同,这都是我们关心的问题,本实验所描述的行为学观察与电生理学技术相结合的方法可 以帮助完成对这些问题的研究。如在本实验中通过比较处于吗啡戒断状态大鼠与盐水对照大鼠在阳性 环境与阴性环境中海马神经元发放频率的不同,发现在停止药物注射后的第二、三、四天吗啡组大鼠 海马神经元在两个环境中的变化率显著大于盐水组大鼠,可见吗啡影响了海马CA1区神经元的发放。 由此也可以推测海马参与了大鼠吗啡成瘾过程的完成,并且参与了大鼠对吗啡的心理渴求。传统的 CPP可以在动物的特定脑区微注射药物,如在中脑腹侧被盖区( VTA)微注射m受体或k受体后观察动物行为变化,以初步分析 VTA与吗啡之间的关系[20]。若能将神经元单位放电记录法与药物微注射的方法相 结合则可以从细胞水平来观察药物对神经元的影响,进而更加准确的分析不同脑区与吗啡之间的关 系。

在电极丝表面尖端涂502胶以达到绝缘的目的的方法是McNaughton实验室已经成熟的实验技 术,不会对神经组织造成毒性。在涂502胶时,将电极丝浸入502胶中轻轻提起,由于502胶的浓度 很低,在上提的过程中就很自然地在电极丝表面均匀附着了薄薄一层胶,同时由于这层胶的厚度很 薄,仅有1~2 mm左右,因此对于电极直径的影响完全可以忽略不计。

总之,本文的主要目的在于介绍一种将自由活动动物神经元单位放电胞外记录法与大鼠药物成瘾 模型相结合的实验方法,该方法可以从细胞水平来观察药物对动物造成的影响,在目前国内的相关研 究中具有较为广泛的实用性。该方法仍在改进与完善中。

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