褪黑素通过减弱催乳素基因增强子的突变抑制大鼠垂体

Acta Physiologica Sinica, June 25, 2005, 57 (3): 319-327

研究论文

褪黑素通过减弱催乳素基因增强子的突变抑制大鼠垂体催乳素瘤的增生

高列，杨全会，许荣^*

中国医学科学院基础医学研究所，中国协和医科大学基础医学院生理学系，北京100005

摘要：本工作旨在探讨褪黑素(melatonin, MLT)抑制17-β-雌二醇(17-β-estradiol, E₂)诱发的Sprague-Dawley大鼠垂体催乳素(prolactin, PRL) 瘤增生的分子机制。结果表明，每只大鼠每日定时皮下注射一定剂量的MLT (0.25、0.50 mg)能显著抑制E₂诱发的大鼠垂体PRL瘤的增生；偏低(0.05 mg)或过高剂量(1.00、2.00 mg)的MLT也抑制PRL瘤的增生，但无统计学意义。采用PCR和DNA直接测序显示，与正常垂体对照组比较，PRL瘤中PRL基因增强子出现五处突变，-1885 bp位点由C突变为G，-1857~-1855由ACA替换为G，-1792~-1791插入G，-1383~-1382插入GGTGTGTG片段，-1265~-1250缺失GTGTGTGTGTGTGTGT片段。0.25 mg/d MLT处理组，PRL瘤中的PRL基因增强子上述个别突变部位仍然存在(-1885由C突变为G)，突变消失(-1792~-1791无插入G)，大部分表现为突变减弱(-1856~-1855缺失AC，-1385~-1384缺失TG，-1250~-1253缺失GTGT)。采用荧光素酶报告基因检测PRL基因增强子活性显示，正常垂体、PRL 瘤和0.25 mg/d MLT处理的PRL瘤三组中，PRL基因增强子的活性分别为(13448.17±3012.74)、(161831.67±60996.01)和 (10212.17±2634.71) OD单位。PRL瘤组增强子活性较正常垂体升高11倍(P <0.001), MLT处理组增强子活性较PRL瘤组降低93.69% (P<0.001)。上述三组PRL基因增强子空间结构的分析表明，PRL基因增强子DNA的曲折程度为PRL瘤组>MLT 处理组>正常垂体。以上结果证实，MLT抑制大鼠垂体PRL瘤增生的重要分子机制之一可能是减弱PRL基因增强子的突变，也提示MLT可减弱PRL基因增强子的突变，从而下调PRL基因的高表达，可能与降低DNA的曲折程度有关。

关键词：褪黑素；催乳素瘤；增强子；突变

中图分类号：Q453; R979.1

Melatonin inhibits the proliferation of pituitary prolactin-secreting tumor by suppressing the enhancer elements mutation of PRL gene in the rat

GAO Lie, YANG Quan-Hui, XU Rong-Kun^*

Department of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100005, China

Abstract: In order to investigate the molecular mechanisms of the inhibition of the proliferation of 17-β-estradiol (E₂)-induced pituitary prolactin-secreting tumor (prolactinoma) by melatonin (MLT) in the rat, we examined the inhibitory effects of MLT on the proliferation of E₂-induced prolactinoma of the rat and the suppressing effects of MLT on the enhancer elements mutation of PRL gene in vivo and in vitro. The results showed that the weights of prolactinomas in MLT groups, in which 0.25 mg or 0.50 mg per day per rat of MLT was administered subcutaneously at 18:00, were decreased significantly. Out of the dosage of MLT, such as 0.05, 1.00 mg and 2.00 mg per day per rat, the antitumor action of MLT is less or disappointing. Polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing showed five mutations in the enhancer elements of PRL gene in prolactinoma, such as -1885 point mutation (C→G), -1857~-1855 substitution (ACA→G), -1792~-1791 insertion G, -1383~-1382 insertion (GGTGTGTG), -1265~-1250 deletion (GTGTGTGTGTGTGTGT). Excluding of -1885 point mutation (C→G), the mutation in the prolactinoma treated with 0.25 mg per day per rat MLT was decreased, such as -1792~-1791 without insertion of G, -1856~-1855 deletion AC, -1385~-1384 deletion TG, -1250~-1253 deletion GTGT. Firefly luciferase reporter gene systems showed that the luminosity of enhancer elements-luciferase reporter fusion gene in normal pituitary, prolactinoma treated without or with 0.25 mg per day per rat MLT were (13448.17±012.74), (161831.67±0996.01), and (10212.17±34.71) OD units. Compared with the normal pituitary, the activity of PRL gene enhancer elements in prolactinoma was increased by 11 times (P<0.001). Compared with the prolactinoma, the activity of PRL gene enhancer elements in prolactinoma treated with MLT was decreased by 93.69% (P<0.001). Analysis of the space structure of PRL gene enhancer elements showed that the bending index in prolactinoma was higher than that in prolactinoma treated with MLT, which was higher than that in the normal pituitary. These results demonstrate that one of the important molecular mechanisms of MLT inhibiting the proliferation of prolactinoma is related to the reduction of enhancer elements mutation of PRL gene. These data also suggest that MLT-induced attenuation of enhancer elements mutation of PRL gene is involved in decreasing the bending index and attenuating the higher expression of PRL gene.

Key words: melatonin; prolactinoma; enhancer elements; mutation

Received 2004-11-8 Accepted 2004-12-21

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (NO. 30270507, 30371581) and the Natural Science Foundation of Beijing (NO. 7022025).

^*Corresponding author. Tel: +86-10-65296462; E-mail: xurongkun@tom.com

垂体催乳素瘤(prolactin-producing tumor, prolactin-secreting tumor或prolactinoma，简称PRL瘤)是内分泌的常见疾病，发病率继糖尿病、甲状腺病之后居第三位，对人类的危害甚大。但由于其病因尚未阐明，尤其发病的分子机制了解还很肤浅，故临床实验研究和治疗工作还有待进一步改善和提高^[1-7] 。

目前已有资料显示，褪黑素(melatonin, MLT)具有抑制某些肿瘤或癌症的功效^[8-14]。但其作用机制同样也不完全清楚。因此，我们在上世纪80年代末开始探讨PRL 瘤的病因及其发病机制的基础上^[4]，拟观察不同剂量MLT对17- β-雌二醇(17-β-estradiol, E₂)诱致Sprague-Dawley (SD)大鼠垂体PRL瘤生长的抑制作用，并进一步探讨这种抑制作用的主要分子机制，即MLT可否经由减弱PRL基因5'调控序列的突变，从而抑制PRL瘤的增生。

1　材料和方法

1.1　实验动物及分组　　实验应用SD大鼠，雄性，体重80~100 g，由中国中医研究院实验动物中心提供。实验分设以下A~F六组：A组为实验对照组，每只大鼠背部埋植10 mg E₂ (Sigma公司)，药泵90 d，诱致形成垂体PRL瘤。B~F组分别注射不同剂量MLT (Sigma公司)，每只大鼠除埋植10 mg E₂(同A组)外，于植入E₂前一周始每只大鼠每日定时分别皮下注射0.05、0.25、0.50、1.00和2.00 mg各0.1 ml MLT，连续注射97 d。另设对照组(*)的大鼠只注射等体积4%乙醇-生理盐水。实验结束后，断头处死大鼠，快速取出正常垂体或垂体PRL瘤，称重后置于液氮罐内备用。

1.2　PCR及DNA直接测序

1.2.1　基因组DNA提取　　分别取正常大鼠的垂体组织、大鼠PRL瘤组织和经0.25 mg/d MLT处理的大鼠PRL瘤组织，在液氮中研磨成细末后，加入提取缓冲液(含10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 0.1 mol/L EDTA, pH 8.0; 10 mmol/L NaCl; 20 μg/ml胰RNA酶；0.5% SDS)，37℃孵育1 h后，加入蛋白酶K, 使其终浓度为100 μg/ml，50℃水浴3 h，用酚、酚/氯仿(1∶1)、氯仿/异戊醇(24∶1)提取，异丙醇沉淀，将提取的DNA溶于TE中，测定OD₂₆₀和OD₂₈₀值，计算DNA浓度。

1.2.2　PCR扩增　　PRL基因5'上游表达调控区远端增强子片段：所用PCR仪为美国Perkin Elemer公司产品。扩增PRL基因增强子DNA序列(-11965~-1201片段)的引物由上海生工生物工程公司合成，引物的序列：上游5'GGTACCTCTAGCTGCAGGA- CATGC3' (含KpnI酶切位点); 下游5'CTCGAGGTT-CATTTGTGGAAGGAGCGC3' (含XhoI酶切位点); 其余试剂为国产分析纯。每次反应体系为25 μl，含0.3 μg模板DNA、两种引物各25 pmol/L；250 mmol/L dNTP、1×PCR缓冲液[16 mmol/L (NH₄)₂SO₄、2 mmol/L MgSO₄、20 mmol/L Tris-HCl，pH8.8、1% Triton-100、1 mg/ml BSA]、2.5 U Pfu高保真DNA聚合酶，94℃预变性4 min后，进入循环；94℃，30 s；62℃，30 s；72℃，1 min，20 s；循环30次后于72℃10 min补平；再加入2.5 U Taq DNA聚合酶在PCR产物尾端连上A；最后取水相5 μl，于1.6%的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外灯下观察并摄影。

1.2.3　DNA直接测序　　用DNA回收试剂盒回收 DNA片段，重组于pGEM-T Easy载体，转染感受态 DH5a大肠杆菌，接种在含40 ml X-gal、4 ml IPTG的氨苄抗性琼脂板上，37℃培养过夜，挑取白色菌落转种于LB培养基中，37℃振荡过夜，小量提取质粒，经酶切鉴定后，大量提取质粒DNA，经PEG纯化，在ABI PRISM测试仪上进行DNA序列测定。

1.3　PRL基因增强子空间结构分析　　 PRL基因增强子区域结构的分析, 由中国科学院生物物理研究所以DNA Star基因分析软件进行比较分析。

1.4　PRL基因增强子功能检测　　

1.4.1　增强子片段与荧光素酶报告基因载体定向重组　　用KpnI和XhoI分别将增强子DNA片段从PRL-pGEM-T Easy重组体上切下，回收；用KpnI和XhoI将连有PRL启动子的荧光素酶报告基因载体 pGL2-Basic切成线性，回收；将增强子片段与载体以10∶1的摩尔比混合，加入2 ml的5×连接缓冲液、3 U的T4 DNA连接酶；15℃反应18 h。转化感受态宿主菌；铺于氨苄抗性培养板上，37℃培养过夜。

1.4.2　阳性重组子筛选　　挑取20个克隆进行质粒小量提取，用KpnI和XhoI酶切鉴定，切下一约 750 bp片段的质粒为阳性重组体，命名为PRL-Enhancer-LUC。

1.4.3　GH3细胞转染　　转染前一天细胞常规传代，以3×10⁵细胞量转种于35 mm培养皿中，37℃，5% CO₂培养箱培养24 h，使细胞达80%融合。转染当天，取pSV-b-Galactosidase质粒和PRL-LUC质粒DNA各1 μg，融于100 ml低血清培养基为A液，取4 μl转染试剂lipofectamine溶解于100 μl低血清培养基为B液。将A、B液混合，置室温30 min后，加入0.8 μl低血清培养基，滴加到上述培养有细胞的35 mm培养皿中(滴加前先去掉培养皿中原有的培养基，并用低血清培养基洗一次)，轻旋培养皿混匀，置37℃，CO₂孵箱中培养10 h后，换全培养基继续培养38 h，用于荧光素酶活性测定。

1.4.4　荧光素酶活性测定　　按Promega公司推荐标准程序进行。弃培养基，用PBS洗细胞三次，加150 ml 1×细胞裂解液于培养皿，刮取细胞并收集于Eppendorf管中，12 000 r/min离心15 s，转移上清至 Eppendorf管中，加入100 μl荧光素酶反应底物，在Monolight 2010发光仪上测定荧光强度，检测时间为20 s。以载体质粒pGL2-Basic的发光强度作为转染表达的阴性对照，以pGL2-Control质粒的发光强度作为阳性对照，以经pSV- b-Galactosidase质粒的发光强度校正转染效率后的报告基因荧光强度代表PRL基因增强子的活性。

1.5　统计学处理　　结果以mean±SD表示。均数差异的显著性以组间t检验判定，P<0.05 为有显著差异。

2　结果

2.1　MLT抑制E₂诱发的垂体PRL瘤的增生

实验结果显示，Sprague-Dawley大鼠正常垂体的重量为(11.3±1.7) mg (n=10); E₂诱发的垂体PRL瘤的重量显著增大为(115.0±71.0) mg (A组，与正常垂体比较P<0.01，n=10); 实验组B、C、D、E、F除给予E₂外，再给予0.05、0.25、0.50、 1.00、2.00 mg MLT，其垂体PRL瘤的重量分别为(85.2±41.0)、(58.9±24.1)、(72.7±23.6)、(79.3 ±56.1)、(74.5±46.8) mg。上述MLT各用药组与A组比较，垂体PRL瘤重量分别降低25.91% (B组)、48.78% (C组，与A组比较P<0.01，n=10)、36.78% (D组，与A组比较P<0.05，n=9)、31.04% (E组)、35.22% (F组)。结果显示，一定浓度的MLT能显著抑制E₂ 诱发的大鼠PRL瘤的增生(图1)。

2.2　MLT对E₂诱致的PRL基因增强子突变的抑制作用

2.2.1　PCR扩增PRL基因增强子鉴定　　分别从正常垂体( n=10); PRL瘤(n=4)和0.25 mg/d MLT处理的PRL瘤(n=3)组织中提取基因组DNA作为模板， PCR扩增PRL基因5'旁侧表达调控区增强子序列(-1965~-1201，共764 bp)。电泳鉴定PCR产物，可见一条764 bp左右的DNA条带，说明无非特异扩增(图2)。

2.2.2　PRL Enhancer-pGEM-T Easy重组体构建和鉴定　　PRL基因增强子PCR扩增产物经分离、纯化后，重组于pGEM-T Easy载体，命名为PRL Enhancer-pGEM-T Easy质粒。小量提取重组质粒，EcoRI酶切鉴定阳性重组体，分别可见一条764 bp的PRL基因增强子片段和另外一条3 018 bp的pGEM-T Easy载体片段。

2.2.3　DNA直接测序结果显示MLT多重抑制PRL基因5'调控序列的突变　　大量提取上述经酶切鉴定后的PRL Enhancer-pGEM-T Easy质粒，经PEG纯化后用作DNA测序。正常、肿瘤和治疗组每组各测3例；每例样本均做正、反双向测序。以DNA Star分析软件对测序结果进行比较，再与Gene Bank 报道的PRL基因增强子序列作对照。结果表明，上述三组中，每组内3例的检测结果都很一致。正常垂体PRL基因增强子序列与Gene Bank的报道完全一致；PRL瘤中PRL基因增强子出现五处突变， -1885位点由C突变为G，-1857~-1855由ACA替换为G，-1792~-1791插入G，-1383~-1382插入 GGTGTGTG片段，-1265~-1250缺失GTGTGTG-TGTGTGTGT片段。经0.25 mg MLT处理的PRL瘤， PRL基因增强子序列上述大部分的突变被显著抑制。除-1885位点仍由C突变为G外，-1792~ -1791突变消失，无G插入；-1856~-1855缺失减弱，只缺失AC；-1385~-1384无片段插入，只缺失TG；-1253~-1250缺失显著减弱，只缺失GTGT(图3)。

2.3　PRL基因增强子空间结构的曲折程度比较分析

分析结果显示，PRL基因增强子DNA的曲折程度为PRL瘤组>MLT处理组>正常垂体(图4)。

2.4　荧光素酶报告基因检测PRL基因增强子功能的比较

2.4.1　PRL Enhancer-pGL2-Basic报告基因重组质粒的构建和鉴定　　上述经测序鉴定的正常垂体、PRL瘤和0.25 mg MLT处理的PRL瘤PRL基因增强子的片段，用KpnI和 XhoI从PRL Enhancer-pGEM-T Easy载体切下，经分离、回收后分别命名为N-PRL Enhancer(正常垂体)、 PT-PRL Enhancer (PRL瘤)和PTM-PRL Enhancer (MLT处理的PRL瘤)。然后用KpnI和XhoI切开具有PRL基因启动子的pGL2- Basic报告基因，分别将N-PRL Enhancer、 PT-PRL Enhancer 和 PTM-PRL Enhancer定向插入pGL2-Basic报告基因KpnI和 XhoI克隆位点上。最后，KpnI和XhoI酶切鉴定重组体，分别可见一条764 bp的PRL 基因增强子片段和另外一条5 847 bp的片段(含250 bp的PRL基因启动子序列和5 597 bp的pGL2-Basic报告基因的序列)(图5)。至此获得分别含有正常垂体、PRL瘤和MLT处理的PRL瘤PRL基因增强子序列的三种荧光素酶报告基因的重组质粒，分别命名为N-PRL-LUC (正常垂体)、 PT-PRL- LUC (PRL瘤)和PTM-PRL- LUC (MLT处理的PRL瘤)。

2.4.2　荧光素酶表达结果分析　　将上述重组质粒分别转染于能表达GH和PRL的垂体瘤细胞株GH3细胞，48 h后测定细胞提取物中荧光素酶与底物荧光素反应的发光强度，以检测荧光素酶的表达水平，藉以判断三种PRL基因增强子的活性。以pSV-b-Galactosidase Control Vector的表达水平校正转染效率，以载体的发光强度作为阴性对照，以pGL2- Control Vector为阳性对照；每种重组质粒各转染6次。结果显示，正常垂体、PRL瘤和MLT处理的 PRL瘤PRL基因增强子的活性分别为(13448.17±BR> 3012.74)、(161831.67±0996.01)和(10212.17±634.71) OD单位。PRL瘤组增强子活性较正常垂体组升高11倍(P <0.001), MLT处理的PRL瘤组较PRL瘤组降低 93.69% (P<0.001)(图6)。

3　讨论

虽然目前已经积累了一些MLT抑制肿瘤或癌症的资料，但尚无关于MLT抑制E₂诱发的SD大鼠垂体PRL瘤增生及其主要分子机制的报道。本工作所得结果清楚表明，一定剂量(每日每鼠皮下注射0.25或0.50 mg) MLT显著抑制PRL瘤的增生，偏低剂量(0.05 mg)或过高剂量(1.00或2.00 mg) MLT虽然也有抑制PRL瘤增生的作用，但无统计学意义。说明适宜浓度的MLT确能抑制PRL瘤的增生，但其作用特点呈“钟形”剂量反应。我们最近的相关实验研究又再次获得如上结果(待发表资料)。 Lemus-Wilson^[15]和Hill^[16]在观察MLT对体外培养的人乳腺癌细胞生长的抑制作用时，也看到了这种类似的被称之为“钟形”剂量依赖的抑瘤曲线，提示它可能是MLT抑瘤效应的一种剂量反应特性。尽管产生上述这种比较特殊的量-效关系的确切原因尚不清楚，但推测可能是不同浓度的MLT对其受体的作用和/或受体信号的转导途径不同所致。Episawa 报道过，超生理浓度的MLT可迅速下调其受体^[17] 。Dubocovich也曾报道，pmol浓度的MLT与MLT₁ 受体结合，激活百日咳毒素敏感的抑制性G蛋白，抑制cAMP的合成；nmol浓度的MLT则作用于MLT₂受体，影响磷酸肌醇水解^[18]。

我们以前的研究结果表明，E₂诱发SD大鼠形成垂体PRL瘤时伴PRL基因等显著高表达^[4]。其多基因机制中，PRL基因是PRL瘤形成的疾病易感基因(susceptivity gene)，亦称主效基因^[19]; 并发现PRL瘤的形成与PRL基因5'调控序列的突变相关^[20]。这些结果提示，探讨MLT抑制PRL瘤的增生及其主要分子机制是否也与MLT抑制PRL瘤调控序列的突变有关。本实验结果首先表明，抑制PRL瘤剂量的MLT显著抑制PRL基因增强子区域多序列的突变，包括突变部分消失、置换和突变程度减弱等；此外，本试验进一步以荧光素酶报告基因系统对突变和被MLT抑制突变的PRL基因增强子功能进行检测，结果表明，突变型增强子对PRL基因的转录活性比正常对照组增高10倍；而MLT抑制增强子的突变，PRL基因的转录活性则比突变组降低10倍。这些结果清楚地说明，MLT之所以抑制PRL 瘤的增生确与其抑制PRL基因5'调控序列的突变密切相关。尽管目前类似本工作的相关报道极少，但已有资料称，PRL基因5'调控序列正常与否对PRL基因的转录活性及维持垂体的正常功能至关重要，特别在调控序列中的雌激素受体结合片段尤其重要^[21,22]。Day等报道，将PRL基因5'调控序列的雌激素反应元件由5'TGTCACTATGTCC3' 突变为5'GGTCACTATGACC3'后，其增强子的活性将随之增高10倍^[23]，与我们的结果相符。

为了进一步解释为何MLT抑制PRL基因的突变从而抑制PRL基因的高表达，进而抑制PRL瘤增生的深层机制，本工作采用DNA Star分析软件比较分析了正常垂体、PRL瘤和MLT处理的PRL瘤中， PRL基因空间结构的曲折程度。结果表明，PRL瘤PRL基因增强子(突变的增强子)空间结构曲折程度较正常垂体PRL基因增强子(野生型无突变)明显增高，MLT处理的PRL瘤中PRL基因增强子(突变程度居上述两者之间)的空间结构曲折程度正好介于上述两者之间。已知真核基因的转录调控是非常复杂的蛋白质之间的相互作用，尽管目前已有三种学说可以解释基因转录调控过程蛋白质之间相互作用的模式，但采纳成环模式(looping model)的学者居多^[24-27]。已有研究表明，用以解释PRL基因的突变与表达调控的关系就涉及这种模式^[28]。Gothard发现，E₂作用于GH₃细胞之后，促进PRL基因远端增强子和近端启动子之间的DNA序列形成染色质环，致使这两个基因的转录调控区彼此靠近，E₂拮抗剂4-hydroxytamoxifen则阻断E₂诱导染色质环的形成^[29]。因此我们推测，本试验结果显示的E₂诱发PRL瘤形成时，PRL基因增强子序列的突变易于形成曲折，利于染色质环的形成，这种DNA空间构型的改变将极大地促进PRL基因的表达、诱发PRL 瘤的形成；而MLT减弱PRL基因的突变、抑制PRL瘤的增生，其主要的分子机制可能与抑制上述的过程有关。然而，尚须提及的是，MLT减弱PRL基因增强子的突变从而抑制大鼠垂体PRL瘤的增生，这可能只是其重要的分子机制之一，可能还有同样重要的其他途径，值得继续探讨。

参考文献

1 Yang MY, Shen CC, Ho WL. Treatments of multi-invasive giant prolactinoma. J Clin Neurosci 2004; 11(1): 70-75.[PubMed abstract]

2 Pathak RD, Tran TH, Burshell AL. A case of dopamine agonists inhibiting pancreatic polypeptide secretion from an islet cell tumor. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89(2): 581-584.[PubMed abstract]

3 Levy MJ, Matharu MS, Goadsby PJ. Prolactinomas, dopamine agonists and headache: two case reports. Eur J Neurol 2003; 10(2): 169-173.[PubMed abstract]

4 Xu RK, Wu XM, Di AK, Xu JN, Pang CS, Pang SF. Pituitary prolactin-secreting tumor formation: recent developments. Biol Signals Recept 2000; 9: 1-20.[PubMed abstract]

5 Clayton RN, Boggild M, Bates AS, Bicknell J, Simpson D, Farrell W. Tumor suppressor genes in the pathogenesis of human pituitary tumors. Horm Res 1997; 47: 185-193.[PubMed abstract]

6 Pegolo G, Buckwalter JG, Weiss MH, Hinton DR. Pituitary adenomas: correlation of the cytologic appearance with biologic behavior. Acta Cytol 1995; 39(5): 887-892.[PubMed abstract]

7 Su CB (苏长保), Ren ZY, Wang WJ. Transsphenoidal microsurgical removal of prolactin-secreting pituitary adenoma and discussion on selection of treatment. Chin J Neurosurg (中华神经外科杂志) 1992; 8(4): 249-252 (Chinese, English abstract).

8 Akagi T, Ushinohama K, Ikesue S, Yukawa E, Higuchi S, Hamase K, Zaitsu K, Ohdo S. Chronopharmacology of melatonin in mice to maximize the antitumor effect and minimize the rhythm disturbance effect. J Pharmacol Exp Ther 2004; 308(1): 378-384.[PubMed abstract]

9 Karasek M, Gruszka A, Lawnicka H, Kunert-Radek J, Pawlikowski M. Melatonin inhibits growth of diethylstilbestrol-induced prolactin-secreting pituitary tumor in vitro: Possible involvement of nuclear RZR/ROR receptors. J Pineal Res 2003; 34(4): 94-96.[PubMed abstract]

10 Leon Blanco MM, Guerrero JM, Reiter RJ, Calvo JR, Pozo D. Melatonin inhibits telomerase activity in the MCF-7 tumor cell line both in vivo and in vitro. J Pineal Res 2003; 35(3): 204-211.[PubMed abstract]

11 Kubatka P, Kalicka K, Chamilova M, Ahlersova E, Ahlers I, Boikova B, Adamekova E. Nimesulide and melatonin in mammary carcinogenesis prevention in female Sprague-Dawley rats. Neoplasma 2002; 49(4): 255-259.[PubMed abstract]

12 Muller HL, Handwerker G, Wollny B, Faldum A, Sorensen N. Melatonin secretion and increased daytime sleepiness in childhood craniopharyngioma patients. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87(8): 3993-3996.[PubMed abstract]

13 Lissoni P, Malugani F, Malysheva O, Kozlov V, Laudon M, Conti A, Maestroni G. Neuroimmunotheraph of untreatable metastatic solid tumors with subcutaneous low-dose interleukin-2, melatonin and naltrexone: modulation of interleukin-2-induced antitumor immunity by blocking the opioid system. Neuroendocrinol Lett 2002; 23(4): 341-344.[PubMed abstract]

14 Xu JN (许建宁), Xu JP. Recent development on the study of melatonin antitumor. Foreign Med Sci·Section of Hygieology(国外医学·卫生学分册) 1999; 26(2): 78-80.

15 Lemus-Wilson A, Kelly PA, Blask DE. Melatonin blocks the stimulatory effects of prolactin on human breast cancer cell growth in culture. Br J Cancer 1995; 72(6): 1435-1440.[PubMed abstract]

16 Hill SM, Blask DE. Effects of pineal hormone melatonin on the proliferation and morphological characteristics of human breast cancer cells (MCF-7) in culture. Cancer Res 1988; 48: 6121-6126.[PubMed abstract]

17 Episawa T, Kame S, Lemer MR. Expression cloning of a high-affinity melatonin receptor from Xenopus dermal melanophores. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 6133-6137.[PubMed abstract]

18 Dobocovich ML. Melatonin receptors: Are there multiple subtypes? Trends Pharmacol Sci 1995; 16: 6121-6126.[PubMed abstract]

19 Zhou YZ (周远征), Xu RK, Shan HM, Huang MY, Wu XM, Di AK. Reconstruction and application of eukaryotic expression plasmid of rat prolactin gene. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志) 1998; 14(4): 304-311 (Chinese, English abstract).

20 Wu XM (吴雪梅), Xu RK. A point mutation of PRL gene in pituitary prolactin-secreting adenoma induced by 17-b-estradiol in SD rats. Chin Sci Bull (科学通报) 2000; 44(21): 2303-2307 (Chinese).

21 Crenshaw EB, Kalla K, Simmons DM. Cell-specific expression of the prolactin gene in transgenic mice is controlled by synergistec interactions between promoter and enhancer elements. Genes Dev 1989; 3: 959-972.[PubMed abstract]

22 Iverson RA, Day KH, d'Emden M, Day RN, Maurer RA. Clustered point mutation analysis of the rat prolactin promoter. Mol Endocrinol 1990; 4(10): 1564-1571.[PubMed abstract]

23 Day RN, Koike S, Sakai M, Muramatsu M, Maurer RA. Both pit-1 and the estrogen receptor are required for estrogen responsiveness of the rat prolactin gene. Mol Endocrinol 1990; 4(12): 1964-1971.[PubMed abstract]

24 Rothberg I, Hotaling E, Sofer W. A Drosophila Adh gene can be activativated in trans by an enhancer. Nucleic Acids Res 1991; 19(20): 5713-5717.[PubMed abstract]

25 Su W, Jacson S. DNA looping between sites for transcriptional activation: self-association of DNA-bound sp1. Genes Dev 1991; 5: 820-826.[PubMed abstract]

26 Li R, Knight JD, Jackson SP, Tjian R, Botchan MR. Direct interaction between SP1 and the BPV enhancer E2 protein mediates synergistic activation of transcription. Cell 1991; 65(3): 493-505.[PubMed abstract]

27 Schild C, Claret FX, Wahli W, Wolffe AP. A nucleosome-dependent static loop potentiates estrogen-regulated transcription from the Xenopus vitellogenin B1 promoter. EMBO J 1993; 12(2): 423-433.[PubMed abstract]

28 Cullen KE, Kladde MP, Seyfred MA. Interaction between transcription regulatory regions of prolactin chromatin. Science 1993; 261: 203-206.[PubMed abstract]

29 Gothard LQ, Hibbard JC, Seyfred MA. Estrogen-mediated induction of rat prolactin gene transcription requires the formation of a chromatin loop between the distal enhancer and proximal promoter regions. Mol Endocrinol 1996; 10(2):185-195.[PubMed abstract]