Acta Physiologica Sinica, June 25, 2005, 57 (3): 349-354

研究论文

人胎儿鼻咽上皮细胞的背景氯电流

孙雪荣¹，王立伟^{1, 2}，毛建文²，朱林燕³，聂思槐 ¹，钟 平¹，陈丽新^{1, 2,*}

广东医学院¹生理学研究室；² 细胞生物学研究室，湛江524023；³中山大学医学院生理学教研室，广州510089

摘 要：采用膜片钳和图像分析技术，研究人胎儿鼻咽上皮细胞背景电流的特性及其与容积激活性氯电流的关系。在等 张溶液中，可记录到一背景电流，该电流呈微弱的外向整流性，无明显时间依赖性失活，其翻转电位为( -0.73±1.7) mV (n=21)，接近氯离子平衡电位(-0.9 mV)。细胞外高张刺激(440 mOsmol/L)明显抑制此电流(59.6±7.1)%，而低张刺激(160 mOsmol/L )则诱发细胞产生容积激活性氯电流。氯通道阻断剂tamoxifen和5-硝基-2-(3-苯丙胺基)苯甲酸 [5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid, NPPB]显著地抑制背景电流并使细胞基础容积增大。上述结果表明，人胎儿鼻咽上皮细 胞的背景Cl^-电流是背景电流的重要成分，此Cl ^-电流与容积激活性氯电流及细胞基础容积调节有关。

关键词：上皮细胞；背景电流；氯通道

中图分类号：Q25

Background chloride currents in fetal human nasopharyngeal epithelial cells

SUN Xue-Rong¹, WANG Li-Wei^1,2, MAO Jian-Wen², ZHU Lin-Yan³, NIE Si-Huai¹, ZHONG Ping¹, CHEN Li-Xin^{1, 2,*}

¹ Laboratory of Physiology; ²Laboratory of Cell Biology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China; ³Department of Physiology, Medical College, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510089, China

Abstract: To characterize the background current in fetal human nasopharyngeal epithelial cells and clarify its relationship with volume activated Cl^- currents (I_{Cl, vol}), whole-cell patch clamp and cell imaging techniques were employed. Under isotonic conditions, a background current [(5.9±2.1) pA/pF at +80 mV, n=21] was detected. The current presented a weak outward rectification and a negligible time-dependent inactivation. The current-voltage relationship showed that the reversal potential of the background current [(-0.73±1.7) mV, n=21] was close to the calculated equilibrium potential for Cl^-(-0.9 mV). Application of extracellular hypertonic stimulation (440 mOsmol/L) suppressed the current by (59.6±7.1)% and the inhibition was reversible after returned to isotonic conditions. Bathing the cells in hypotonic solution (160 mOsmol/L) induced a volume-sensitive Cl^- current. The Cl^- channel blockers, tamoxifen (20 μmol/L) and 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid (NPPB) (100 μmol/L), inhibited the background current by (74.0±5.2)% (P<0.01, n=5) and (60.9±8.9)% (P<0.01, n=6) at +80 mV and increased basal cell volume by (107.7±2.9)% (P<0.01, n=25) and (104.4±2.4)% (P<0.01, n=19), respectively. The data indicate that Cl^- current is an important component of the background current in fetal human nasopharyngeal epithelial cells. The background Cl^-current is involved in volume activated Cl^- current and basal cell volume regulation.

Key words: epithelial cells; background currents; chloride channels

This work was supported by the Wellcome Trust UK (No. 056909/299/Z), the Education Ministry of China (No. GJ9901) and the Health Department of Guangdong Province (No. A2001474).

^*Corresponding author. Tel: +44-29-20876670; Fax: +44-29-20874094; E-mail: ChenL1@cardiff.ac.uk

对于背景电流的研究，早期主要集中在阳离子方面，如K ⁺、Na⁺。这些阳离子电流在各种细胞有广泛的表达，通过参与形成静息电位、维持兴奋性等调节细胞的功能。细胞的生活环境中除含有阳离子外，还含有大量阴离子(其中以Cl^-为主)。近年来，对Cl^-电流的研究逐渐增多，研究发现许多 细胞的背景电流中都有Cl^-电流存在，这些Cl ^-电流参与细胞迁移、静息电位形成或调节胞内氨基酸浓 度等生理过程。目前已经发现的Cl^-离子通道有多 种，如Ca²⁺激活性氯通道、囊性纤维化跨膜转导调 节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)、容积激活性阴(氯)离子通道及ClC家族等。不同细胞的背景Cl ^-电流可能由不同的通道介导，最近在豚鼠^[1] 及大鼠^[2]心室肌细胞上发现了一种新的背景氯电流，其性质与目前发现的几 种氯电流都不同；而在小鼠早期胚胎细胞^[3]、人神 经胶质瘤细胞^[4]和兔心房肌细胞^[5] ，容积激活性氯电流(volume-activated chloride currents, I_Cl,vol)是背景电流的重要成分。

我们前文报道^[6-9]，在等渗条件下，抑制氯通 道使鼻咽癌细胞容积稍增大，提示少量膜氯离子通道处于开放状态，参与细胞基础容积调节，鼻咽癌 细胞容积激活性Cl^-电流和调节性容积回缩能力随细 胞周期改变而发生周期性变化，容积激活性氯通道与细胞周期进程和细胞增殖密切相关。另有文献报 道，在正常宫颈上皮细胞恶性转化过程中，伴随着容积激活性Cl ^-通道表达的上调^[10]。了解鼻咽上皮细 胞的背景电流，是进一步研究背景氯电流在细胞周期、细胞迁移、细胞容积调节中的作用基础，比 较鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞背景电流的差异，有助于了解背景电流在鼻咽上皮细胞恶性转化过程中 所起的作用。本文研究的主要目的是研究鼻咽上皮细胞的背景氯电流，并探讨背景氯电流和 I_Cl,vol及基础容积调节的关系。

1 材料和方法

1.1 取材和细胞培养　　细胞培养参考李亮平的方法 ^[11]。鼻咽粘膜取自4个月以上引产胎儿。组织块种于圆形玻片上，用含5 μg/ml胰岛素、5 ng/ml上皮细胞生长因子、5×10^-7 mol/L氢化可的松、1.25%胎牛血清的DMEM/F₁₂混合生长液进行培养。 取原代培养1~2周的上皮细胞用于实验。实验前用0.25％胰酶(含0.02% EDTA)将贴壁细胞在37℃培养箱中消化约1~3 min，使细胞变圆。

1.2 膜片钳全细胞记录　　用EPC-7膜片钳放大器(List Electronic, Germany)记录单个鼻咽上皮细胞
的全细胞电流。微电极尖端电阻5~10 MW。电流和电压信号用CED1401 (Cambrige, UK)数字化(采样频率3 kHz)，实验数据用EPC (CED, Cambridge, UK)软件分析。电压钳制模式：细胞被钳制在0、±40、 ±80 mV不断反复循环，每个钳制脉冲波宽200 ms，间隔4 s。细胞玻片安放在灌流槽中，实验在室温(20~24℃)下进行。氯通道阻断剂抑制背景电流 的计算公式为：抑制率(%)=(C_Iso- C_blockers)/C_Iso×100% ，其中C_Iso是等张条件下的电流值， C_blockers是加入阻断剂后的电流值。

1.3 细胞容积测量　　细胞玻片安放在特制浴槽中，用等张液沐浴5 min，浴槽容积0.5 ml，灌流速度4 ml/min，先灌流等张液5 min，观察细胞基础容积，然后在等张灌流液中加入氯通道阻断 剂，继续灌流5 min。在IMT-2倒置相差显微镜(Olympus, Japan)下用4910 CCD数字式摄像机(Cohu, Inc. USA)每隔60 s拍摄1次。用Scion Image图像分析软件(Scion Co. USA)控制拍摄并进行细胞图像分析，计算细胞容积，细胞容积经标准化处理。标准化细胞容积(V_st)按V_st ＝(V_t /V₀)×100公式计算，其中V _t是实时测得的细胞容积，V₀是加阻断剂前细胞的 平均容积。

1.4 溶液　　使用特配的溶液记录Cl^-电流。电极 液含(mmol/L): N-methyl-D-glucamine chloride (NMDG-Cl) 70、MgCl₂ 1.2、Hepes 10、EGTA 1、D-manitol 140、ATP 2。等张灌流液含(mmol/L): NaCl 70、MgCl₂ 0.5、CaCl₂ 2、Hepes 10、D-manitol 140。47%低张灌流液(160 mOsmol/L)除不含D-manitol外，其它成分及浓度与等张灌流液相同。47％高张 灌流液(440 mOsmol/L)是在等张液的基础上加入140 mmol/L D-manitol而配成。电极液和等张灌流液渗透压均为300 mOsmol/L。电极液和灌流液用Tris液分别调至pH 7.25和7.40。

Tamoxifen (Sigma公司)用甲醇溶液配成40 mmol/L的贮存液，于4℃低温保存，一周内使用，临用前用等张液稀释到20 μmol/L。5-硝基-2-(3-苯丙胺基)苯甲酸 [5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid, NPPB]购自Sigma公司，用DMSO配制成100 mmol/L储存液，使用前用等张灌流液稀释至100 μmol/L。

1.5 统计方法　　数据以mean ± SD表示，均数差异显著性用ANOVA检验，P<0.05被认为有显著性差异。

2 结果

2.1 鼻咽上皮细胞的背景电流

将细胞玻片安放在特制浴槽中，采用全细胞记录方式测量膜电流，细胞被钳制在0、 ±40、±80 mV(电压钳制模式见图1A)。灌流等张液时，记录到一稳定的背景电流，该电流呈微弱的外向优势， 正电压钳制时无明显的时间依赖性失活(图1B)。

图1C显示的是背景电流的电流密度-电压曲线，在+80 mV和-80 mV钳制时，电流密度分别为(5.9±2.1) pA/pF和(-5.6±1.9）pA/pF (n=21)。背景电流的翻转电位为(-0.73±1.7) mV (n=21)，接近氯离子的平衡电位。由于电极液和灌流液所含Cl ^-浓度几乎相同，氯离子平衡电位(E_Cl )为-0.9 mV。

2.2 背景电流对氯离子通道阻断剂的敏感性

为了确定Cl^-在背景电流中的作用，我们观察了 氯离子通道阻断剂NPPB和tamoxifen对背景电流的影响。

记录到稳定的背景电流后，在等张液中加入NPPB，使终浓度达到100 mmol/L。结果观察到NPPB可抑制上皮细胞的背景电流(图 2A)，作用可逆，其对外向电流的抑制大于对内向电流的抑制(P<0.05)，在+80 mV和-80 mV时，分别抑制背景电流(60.9±8.9)% (P<0.01, n=6)和(46.7±7.4)% (P<
0.01, n=6)。

在等张灌流液中加入20 mmol/L tamoxifen也能可逆性抑制背景电流(图 2B)，其对外向电流和内向电流的抑制率无显著性差异( P>0.05)，在+80 mV和-80 mV时，分别抑制外向电流(74.0±5.2)% (P<0.01, n=5)和内向电流(71.7±12.4)% (P<0.01, n=5)。

2.3 背景电流的容积敏感性

以上实验表明，背景电流中有Cl^-电流的存在。 细胞膜上的氯电流有多种，胎儿鼻咽上皮细胞的背景Cl ^-电流中有无I_Cl,vol的成分呢？为此我们观察了背 景电流对容积的敏感性。在等张条件下记录到稳定的背景电流后，改灌47%的高张溶液，结果显示 细胞容积逐渐缩小，同时背景电流也渐减小，在约10 min内电流抑制达到稳定水平，再灌回等张液后，背景电流又逐渐恢复。高张对外向电流和内向 电流的抑制率相同(P>0.05)，在+80 mV和-80 mV钳制下分别抑制外向电流(59.6±7.1)% (P<0.01, n=4) 和内向电流(57.9±10.6)% (P<0.01, n=4)(图3)。相反，灌流47%的低张溶液后，细胞明显肿胀，全 细胞电流增大，这是由于肿胀刺激使细胞产生了较强的 I_Cl,vol (待发表数据)，I_Cl,vol呈微弱外向优势，无 明显时间依赖性失活(图3)。

2.4 氯通道阻断剂对细胞容积的影响

在目前发现的几种氯电流中，I_Cl,vol 在细胞容积调节中起着重要的作用。如果细胞的背景电流中有 I_Cl,vol的存在，那么在等张条件下阻断该电流后，细 胞容积应该有所改变。为此我们观察了氯通道阻断剂对细胞容积的影响。结果如图4所示，在等张液 中(Iso)，细胞容积保持相当稳定，以5 min的平均值作为100%，当在等张液中加入氯通道阻断剂NPPB (100 mmol/L)或tamoxifen (20 mmol/L)后，细胞容积稍增大，5 min时容积分别增加到(104.4±2.4)% (P<0.01, n=19)或(107.7±2.9)% (P<0.01, n=25)。

3 讨论

为了排除K⁺电流的干扰，本实验所使用的电极 内液和灌流液都不含K⁺。本研究表明，胎儿鼻咽 上皮细胞的背景电流中含有Cl^-电流的成分，理由有：第一，细胞在不同钳制电压下的电流方向与Cl^- 运动的方向一致。本实验所用的灌流液和电极内液决定了本实验条件下有可能产生电流的离子是 Cl^-、Na⁺和Ca²⁺，电极内液的Cl ^-浓度(决定细胞内Cl^-浓度)与细胞外灌流液中的Cl ^-浓度(决定细胞外Cl^-浓度)基本相等，但是电极内液不含Na ⁺和Ca²⁺。如果电流是由Na⁺ 或Ca²⁺产生，那么在0 mV电压钳制时将有明显的内向电流产生，在正电压钳制(+40 mV 或 +80 mV) 时则无外向电流。然而本实验的结果并非如此，细胞在0 mV电压钳制时无明显内向电流产生，正电压钳制时产生较强的外向电流，这 种情况与Cl^-电流相似。第二，背景电流的翻转电 位(-0.73 mV)接近氯离子平衡电位(-0.9 mV)，而在本实验条件下，Na⁺和Ca²⁺ 的平衡电位都很高。第三，氯通道阻断剂tamoxifen和NPPB均可阻抑背 景电流。由于氯通道阻断剂对背景电流的抑制率超过50％，故在本实验中，Cl ^-电流可能是背景电流的主要成分。

最近研究表明，在小鼠早期胚胎细胞^[3]、人神 经胶质瘤细胞^[4]和兔心房肌细胞^[5] 的背景电流中都有
I_Cl,vol存在。上皮细胞可产生多种氯电流，如Ca ²⁺激活性Cl^-电流，cAMP激活的Cl ^-电流及I_Cl,vol，其中只有 I_Cl,vol具有容积敏感性^[12,13] 。为了探讨胎儿鼻咽上皮细胞的背景Cl^-电流中是否有 I_Cl,vol的成分，我们观察了背景电流对容积变化的敏感性。结果表明，当细胞受到高张刺激而容积缩小时，电流明显减小超过50%，而细胞受低张刺激容积增大时，电流明显增大，这说明背景电流具有容积敏感性。另外背景电流表现出和 I_Cl,vol相似的特性，即都呈弱的外向整流性，正电压钳制时无明显时间依赖性失活，这 些都提示背景Cl^-电流中有I_Cl,vol 的成分。

在很多种类细胞，I_Cl,vol表现出中等外向整流性，正电压钳制时呈明显时间依赖性失活。而在本实验中，I_Cl,vol的外向整流性和时间依赖性失活均不明显，这与鼻咽癌细胞^[6]及牛眼睫状体上皮细胞 ^[14]相似。这种差异可能与实验条件或容积激活性氯通 道的多样性有关。

我们前文报道，在等张条件下加入氯通道阻断剂，使鼻咽癌细胞容积轻微增大，提示在等张条件下，鼻咽癌细胞有少量氯离子通道处于开放状态，参与细胞基础容积调节^[8]。在本实验中，我们观察了氯通道阻断剂对细胞容积的影响。在静息状态时，由于膜内负外正电位差的存在，当容积激活性氯通道开放时，胞内氯离子在电位差作用下外流 ^[1]，可引起细胞容积减小。如果背景电流中有I _Cl,vol存在，那么用氯通道阻断剂阻断此电流，细胞容积应该会增大。实验结果表明，加入NPPB或tamoxifen阻断背景Cl ^-电流后，细胞容积明显增大，提示背景电流参与细胞基础容积的调节。

I_Cl,vol可被低张性肿胀、胞内离子强度降低及剪 切应力^[12]等刺激激活。原代胎儿鼻咽上皮细胞在等张条件下是如何激活I_Cl,vol的，目前还不清楚。可 能由于细胞在新陈代谢时引起胞内渗透压的变化，从而导致容积的波动引起 ^[15]。

大量研究表明，容积激活性Cl^-电流有广泛的生 理功能，除参与细胞容积调节外，还参与细胞凋亡、细胞迁移、细胞周期进程等功能的调节。而 目前对背景电流中I_Cl,vol的生理功能的研究尚不多。 由于大多数哺乳动物的细胞都生活在等张条件下，进一步研究背景电流中 I_Cl,vol的功能将有重要的意义。

参 考 文 献

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