生理学报 Acta Physiologica Sinica, August 25, 2005, 57 (4): 461-466
研究论文
腹腔注射乙酰唑胺对大鼠氧惊厥潜伏期的影响
黄俊龙，练庆林，蒋春雷，郭明珠，孙学军*
第二军医大学海军医学系航海医学教研室，上海 200433
摘 要：为探讨脑血流调节与氧惊厥的关系，本研究在复制大鼠氧惊厥模型的基础上，采用行为学方法测定氧惊厥潜伏期， 并测定脑皮质氧化指标丙二醛(maleic dialdehyde, MDA)含量，采用腹腔注射不同剂量脑血管扩张药物乙酰唑胺(acetazolamide, ACZ)，以及联合注射ACZ及其拮抗剂吲哚美辛(indomethacin, IND)后，观察脑血管扩张对氧化状态以及氧惊厥潜伏期的影 响。结果观察到：(1)腹腔注射ACZ (不小于7.5 mg/kg体重)后，氧惊厥潜伏期明显缩短(P<0.05)，剂量越大，缩短越明 显。腹腔注射IND对氧惊厥潜伏期无显著影响。腹腔注射IND (20 mg/kg体重)，30 min后再注射ACZ (7.5 mg/kg体重)，ACZ的氧惊厥潜伏期缩短作用被对抗(P <0.05)。 (2)腹腔注射ACZ 7.5 mg/kg后，与各组相比，6及16 min暴露后，脑组织MDA含量明显增多(P<0.01， P<0.05); 腹腔注射IND对脑皮质MDA含量无显著影响；在预注射IND，再注射ACZ后， MDA含量显著降低(P<0.01, P<0.05)。结果表明，ACZ外周注射加重氧化损伤，缩短氧惊厥潜伏期；而IND可以对抗其 氧惊厥潜伏期缩短作用以及氧化损伤加重作用，碳酸酐酶活力变化很可能是通过影响脑血管状态而影响氧化损伤以及氧惊 厥潜伏期。
关键词：高压氧；惊厥；碳酸酐酶；乙酰唑胺；吲哚美辛；脑血流
中图分类号：Q479
Influence of acetazolamide given intraperitoneally on the latency to hyperbaric oxygen-induced convulsion of rats
HUANG Jun-Long, LIAN Qing-Lin, JIANG Chun-Lei, GUO Ming-Zhu, SUN Xue-Jun*
Department of Nautical Medicine, Faculty of Naval Medicine, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Abstract: The purpose of the present study was to explore the relation between the modulation of cerebral blood flow and the latency of hyperbaric oxygen-induced convulsion. There were two parts in this study. First, the effect of acetazolamide or (and) indomethacin on the latency of hyperbaric oxygen-induced convulsion was observed. Seventy Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 7 groups: the acetazolamide 200, 20, 10, 7.5, 5, 2.5 mg/kg body weight and normal saline (NS) group. Forty rats were divided into 5 groups: indomethacin 20, 10, 5, 2.5 mg/kg body weight and NS groups. Another 40 rats were divided into 5 groups which were administered with indomethacin in the dose of 0 mg/kg (NS), 0 mg/kg (NS), 5, 10 and 20 mg/kg body weight. Thirty min later the first group was given NS, and all the other four groups were given acetazolamide with a dose of 7.5 mg/kg body weight. The animals were given acetazolamide or (and) indomethacin intraperitoneally, and 20 min later they were exposed to the pressure of 6 ATA (absolute atmosphere) of pure oxygen. The time from exposure to the onset of seizure (clonic-tonic convulsion) was recorded for each animal according to behavioral observation. Second, the change of maleic dialdehyde (MDA) was measured after acetazolamide and (or) indomethacin treatment. Seventy-two SD rats were randomly divided into 9 groups: Control, 6 and 16 min respectively with NS, acetazolamide, indomethacin, and both acetazolamide and indomethacin group. The dose of acetazolamide was 7.5 mg/kg body weight and the dose of indomethacin was 20 mg/kg body weight. After injection of drugs, the animals were subjected to the pressure of 6 ATA of pure oxygen in respect to its time course group. Then the rats were decapitated and the cerebral cortex was dissected and homogenized. The content of MDA was determined. We found that (1) when the dose of acetazolamide is higher than 7.5 mg/kg, it shortened the latency to hyperbaric oxygen-induced convulsion significantly (P<0.05, P<0.01). There was no significant difference in the latency between every two groups of rats treated with different doses of indomethacin. But when the rats were administered acetazolamide of 7.5 mg/kg body weight after being pretreated with indomethacin of 20 mg/kg body weight, the outbreak of convulsion was put off remarkably (P<0.05). (2) In comparison with the control, the content of MDA in the group treated with acetazolamide increased significantly (P<0.01), but when the rats were treated with both acetazolamide and indomethacin, the content of MDA was reduced significantly both in 6 and 16 min exposure time projects (P<0.05, P<0.01). These results suggest that acetazolamide which dilates the brain arterioles can obviously shorten the latency of hyperbaric oxygen-induced convulsion and aggravate the oxidation of the brain. Indomethacin can resist acetazolamide's effect on the latency and oxidation level when the animals were exposed to the hyperbaric oxygen. The activity of carbonic anhydrase correlates closely with the oxidation injury.
Key words: hyperbaric oxygen; convulsion; carbonic anhydrase; acetazolamide; indomethacin; cerebral blood flow
Received 2004-11-08 Accepted 2005-04-20
This work was supported by the Joint Research Fund of the Second Military Medical University of China (No. 200301).
*Corresponding author. Tel: +86-21-25070349; Fax: +86-21-65492382; E-mail: sunxjk@hotmail.com
氧惊厥即脑型氧中毒，又称急性氧中毒，是一种严重的潜水疾病。广泛应用于临床的高压氧治疗
以及军事或民用潜水活动都有发生氧惊厥的可能，氧惊厥是限制氧广泛使用的最主要的障碍之一，但是关于它的确切发生机制至今尚未完全明了。目前比较公认的观点认为，高压氧诱导的氧自由基增多
导致脑神经元功能障碍是氧惊厥发生的重要原因。许多因素都会影响氧惊厥的发生，有实验证明，许多收缩血管的药物可延长惊厥潜伏期，而扩张血管的药物可明显缩短潜伏期
[1-3]。我们认为，惊厥潜伏期与脑血管状态密切相关。Arileli等发现呼吸气
体中CO2分压与氧惊厥潜伏期关系非常密切[4-6]，但内源性的CO2能否对氧惊厥的发生产生影响至今未见报道。碳酸酐酶在体内分布广泛，其对于内源性CO2的产生和排除起着关键作用。乙酰唑胺(aceta-zolamide,
ACZ)是一种常用的碳酸酐酶抑制剂，经常被用作扩张脑血管的工具药物，可引起内源性CO2增多，而吲哚美辛(indomethacin,
IND)可以对抗其作用。本实验拟通过观察利用ACZ及其对抗药物影响碳酸酐酶活力后对大鼠氧惊厥潜伏期、脑组织的氧化产物丙二醛(maleic
dialdehyde, MDA)含量的影响，探讨外周碳酸酐酶活力改变引起的脑血管效应与氧惊厥之间的关系。
1 材料与方法
1.1 动物及试剂 雄性Sprague-Dawley大鼠，体重213~256 g购于美国比凯公司；实验用气为医用纯氧和压缩空气；ACZ和IND购于Sigma公司； MDA检测试剂盒购于南京建成生物制品有限公司；钠石灰购于上海五四化学试剂公司。
1.2 实验分组 氧惊厥潜伏期测定，ACZ组取大鼠70只，随机分为7组：ACZ 200、20、10、7.5、5、2.5 mg/kg体重组和生理盐水对照组。IND组取大鼠40只，随机分为IND 20、10、5、2.5 mg/kg体重组和生理盐水对照组。IND处理组40只，随机分为5组，第一组预注射生理盐水，其余4组 分别预注射IND 0、5、10和20 mg/kg体重，各组动物预注射完毕30 min后，第一组腹腔注射生理盐水，其余4组注射ACZ 7.5 mg/kg体重，20 min后加压处理。进舱后以1 ATA/min (ATA，绝对大气压)的速度匀速加压至6 ATA，稳压至出现惊厥大发作后，匀速减压出舱。记录惊厥潜伏期，比较 各组差别。氧化指标测定，应用表征氧化程度的MDA试剂盒检测机体质膜的氧化损伤程度。取大鼠72只，随机分为9组：常压对照组、生理盐水 6 min组、ACZ 6 min组、IND 6 min组、ACZ和IND联合注射6 min组、生理盐水16 min组、ACZ 16 min组、IND 16 min组、ACZ和IND联合注射 16 min组。ACZ注射剂量取7.5 mg/kg体重，IND取20 mg/kg体重。动物加压处理后，匀速减压出舱后立即断头取脑，分离皮层，匀浆，离心，试 剂盒检测MDA含量。
1.3 急性氧中毒模型复制 潜伏期以及氧化指标测定时动物处理的过程基本一致。动物进舱后， 首先以1 l/s的气流速度洗舱5 min，然后以1 ATA/min的速度匀速加压至6 ATA并计时，保持压力稳定，加压及稳压过程中持续换气(0.8 l/s)。观察动物行为改变，当动物出现全身强直性收缩及阵发性 痉挛等惊厥大发作表现时，减压出舱并记录发作开始时间，从高压氧暴露时间到惊厥发作之间的时间 作为惊厥潜伏期。暴露过程中，舱底铺一层钠石灰，以吸收动物呼出的CO2，舱内温度保持在24~26℃。
1.4 氧化指标测定 动物减压出舱后，立即断头取脑，分别分离顶叶皮层，然后将脑组织制成浓 度为10%的组织匀浆，3 500~4 000 r/min离心12 min，取上清液，-20℃冷冻保存待测。标本准备完毕后，按照试剂盒说明分别测定MDA含量。
1.5 统计学分析 数据用mean ± SD表示，采用方差分析F检验及SNK-q检验判断各组潜伏期、MDA含量差别，P<0.05为差异显著。
2 结果
2.1 腹腔注射ACZ对氧惊厥潜伏期的影响
注射不同剂量的ACZ后，测定氧惊厥大发作潜伏期。与生理盐水对照组相比，ACZ 7.5、10及20 mg/kg体重组惊厥潜伏期明显缩短(P<0.05，P<0.01)(图1)。
2.2 腹腔注射IND对氧惊厥潜伏期的影响
腹腔分别注射IND 2.5、5、10、20 mg/kg体重后，各剂量组氧惊厥潜伏期与生理盐水组比较无显著差别，各剂量组之间也无显著差异(表1)。
2.3 腹腔注射IND对ACZ缩短大鼠氧惊厥潜伏期的翻转作用
与对照组相比，注射ACZ组大鼠氧惊厥潜伏期都显著缩短(P<0.01, P<0.05)。与ACZ组相比，当IND注射剂量达到20 mg/kg体重时，氧惊厥潜伏期明显被延长(P<0.05)(图2)。
2.4 腹腔注射IND对ACZ加重氧惊厥大鼠氧化损伤的翻转作用
当暴露时间为6 min时，ACZ组MDA含量显著升高(P<0.01)。当预给ACZ后再注射IND，大鼠皮层MDA含量比单给ACZ组显著降低(P<0.01)(图3)。
当暴露时间为16 min时，ACZ组MDA含量显著升高(P<0.01)。当预给ACZ后再注射IND，大鼠皮层MDA含量比单给ACZ组显著降低(P<0.05)(图4)。
3 讨论
氧惊厥与癫痫发作类似，被认为是由高压氧引起的中枢神经系统兴奋性增强所导致。氧化损伤是导致氧惊厥的根本原因，因此，凡能影响机体尤其是脑组织氧量或者抗氧化能力的因素都会影响氧惊厥的发生。在高压氧状态下，进入机体氧量增加的主要途径是物理溶解氧的增加，因此携氧的血液流 量的变化无疑很大程度地影响着进入脑组织的氧量。一旦有扩血管因素起作用，进入脑组织的血流 量将明显增多，进入脑组织的氧量也相应增多，氧量增加必然引起自由基产生增多，神经递质平衡失调，以及酶活性下降等，从而加速氧惊厥的发生[8,9] 。CO2是体内能量代谢的主要产物，是脑血管调节的 重要物质，当体内CO2升高时，脑血管扩张，脑血流增加。许多实验发现，呼吸气体中的CO2分压 升高可明显缩短氧惊厥的潜伏期，并具有剂量依赖关系[10]。本实验结果证明，当碳酸酐酶活性被ACZ抑制后，氧惊厥潜伏期缩短，其原因可能是ACZ 影响体内CO2的运输导致体内CO2含量的升高。碳酸酐酶对于机体内CO2的排除和运输，起着关键作用。碳酸酐酶抑制剂ACZ可抑制CO2的运输和排出，增加组织和血液CO2浓度，而CO2浓度升高可以扩张脑血管。腹腔注射ACZ 20 min后脑血管即可明显扩张，同时可观察到组织以及体液内CO2分压增高。CO2扩血管的原因可能与NO增多有关 [7,11,12]。我们认为，对氧惊厥的发生来说，血管状态可能是一个重要的启动因素。某种因素影响血管状态时，就会影响氧惊厥的发生。本研究中，ACZ引起的CO2增多影响了脑血管状态，这种影响使得大脑功 能处于容易发生惊厥的“脆弱”状态。
氧惊厥的自由基学说认为，自由基增多超过机体抗氧化能力是氧惊厥发生的最根本原因。本研究以前的结果表明，随着高压氧暴露时间的延长，所有脑区MDA含量均明显升高，ACZ可促进脑组织氧化损伤 [13]。作为利尿剂和抗癫痫药物，ACZ早已应用于临床。氧惊厥类似于癫痫发作，理论上看，ACZ应具有对抗氧惊厥发作的作用，但由于它可通过扩张脑血管促进氧惊厥发作，而这两种作用是相反的。从本实验结果来看，脑血流对氧惊厥潜伏期具有很强的影响。ACZ的抗惊厥作用被认为是 通过抑制脑组织主要是胶质细胞的碳酸酐酶实现的[14,15]，其具体机制至今未明。本研究的结果表明 在氧惊厥这种特殊的惊厥发作过程中，决定氧量的血流的影响掩盖了其抗惊厥作用。IND是一种前列 腺素合成抑制剂，而后者与NO关系密切，具有显著的血管活性作用。IND可以对抗ACZ对碳酸酐酶 的抑制作用，同时还有一定的碳酸酐酶活力激动作用，甚至可以消除ACZ的脑血流增加效应 [16,17]。但是，由于机体内碳酸酐酶总量巨大且分布广泛， IND对碳酸酐酶的激动作用没有造成对氧惊厥潜伏期的影响。ACZ与IND对包括脑血管的机体血管的 调节作用被认为与前列腺素相关[18,19]。ACZ及(或) IND对氧惊厥潜伏期和氧化状态的影响与其对血管状态的影响基本相吻合。
本研究在探讨ACZ对氧惊厥潜伏期的剂量效应关系时发现，在6 ATA纯氧暴露6 min时绝大多数实验动物都没有发生惊厥大发作，而给与ACZ 7.5 mg/kg体重后的部分动物出现前驱期症状，但没有动物发生惊厥大发作，因此把6 min作为氧化指标的第一个观察时间点；对照组动物的潜伏期大约20 min左右，给与ACZ 7.5 mg/kg体重后动物潜伏期缩短至大约13 min左右，取其几何平均值16 min，而此时ACZ组以及ACZ和IND联合给药组动物大多已发生惊厥，因此16 min作为另一个观察时间点。实验结果提示ACZ可能通过抑制碳酸酐酶活力扩张 脑血管，加重氧化损伤，促进氧惊厥的发作；作为ACZ的抑制剂，IND不仅可以对抗其对碳酸酐酶的抑制作用，同时具有碳酸酐酶激动作用，可以对抗ACZ的血管扩张作用。Wood CD认为ACZ通过抑制碳酸酐酶的活力，引起机体H+ 浓度升高及pH值下降，从而促进氧惊厥发作，但就血管因素对氧惊厥的影响没有提及[20]。我们的实验结果表明，作为血管扩张工具药物，ACZ加重了氧化损伤，氧惊厥潜伏期也明显被缩短，而氧化损伤无疑是氧惊厥 发生的根本原因。如果仅仅是由于H+浓度升高，pH值下降促进了氧惊厥的话，ACZ引起的MDA含量增多是得不到解释的，而且ACZ和IND的联合应用也影响了机体氧化损伤。本研究进一步证明，除了对机体内环境的影响外，ACZ还通过影响脑血管状 态影响氧化损伤，脑血管扩张是影响氧惊厥潜伏期的重要因素，影响氧惊厥潜伏期的根本因素是通过 加重氧化损伤。
因此，病人在进行高压氧治疗或者参加某些潜水活动过程中一些具有碳酸酐酶活力抑制作用的药物要尽量避免使用。碳酸酐酶影响氧惊厥潜伏期的确切机制还需要更多实验研究来探讨。氧中毒是高压氧治疗及军民潜水活动中较易发生且危害较大的病症，对于其机制的探讨不仅具有理论意义，更具有较大的实际意义。
* * *
致谢: 我们感谢海军医学研究所李俊助理研究员和第二军医大学海军医学系航海医学教研室李润平博士的技术支持。
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