生理学报 Acta Physiologica Sinica, August 25, 2005, 57 (4): 505-510
研究论文
Wnt信号通路对成纤维细胞Rat-1生长及表型的调控
陈丽君，左 伋*，吴青锋，夏蓓莉
复旦大学上海医学院细胞与遗传医学系，上海 200032
摘 要：构建Wnt-3a的真核表达载体并稳定转染大鼠成纤维细胞Rat-1，建立Wnt信号通路持续激活的细胞模型，以探 讨Wnt信号通路激活对该细胞的生长以及某些表型特征的影响。结果表明： Wnt信号通路持续激活时，Rat-1细胞形态表现为细胞长度的增加，具折光性以及呈绳索状的成束密集排布；MTT以及流式细胞仪检测表明稳定转染后细胞增殖率明显 高于正常对照组，进入G2期的细胞增多，细胞增殖分裂能力增强；Transwell小室迁移实验证实转染组的细胞迁移率略高 于对照组，但无显著性差异；体外划痕实验表明，稳定转染后的Rat-1细胞在划痕后伤口愈合时间显著缩短。结果提示： 体外Wnt信号通路的激活能够引起成纤维细胞某些表型改变，并促进细胞增殖，加速体外伤口的修复。
关键词：Wnt-3a；成纤维细胞；细胞增殖；细胞迁移
中图分类号：Q25；Q26
Wnt signalling pathway regulates the growth and several phenotypes of Rat-1 cells
CHEN Li-Jun, ZUO Ji*, WU Qing-Feng, XIA Bei-Li
Department of Cellular and Genetic Medicine, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032,China
Abstract: The Wnt signaling pathway is thought to be functionally conserved in vertebrates and invertebrates and plays an important role during the embryonic and postembryonic development. Recent studies indicated that this pathway may be also involved in the controlled proliferation and migration of some kinds of fibroblasts during the wound healing process. To verify this assumption in vitro, we chose Rat-1, a kind of rat fibroblasts to investigate the regulation of Wnt signaling pathway to the growth and changes of several phenotypes of this kind of cells. Full length Wnt-3a cDNA was inserted in pcDNA 3.1 vector to construct the Wnt-3a mammalian expression vector, which was stably transfected into Rat-1 cells, and then to establish a cell model in which Wnt signaling pathway was constantly activated. When Wnt signaling pathway was activated constantly, Rat-1 cells exhibited morphological changes: grew more densely as a monolayer, adopted an elongated and refractile appearance, forming cord-like bundles lined up in a uniform direction. The results of MTT assay and FCM analysis indicated that more Rat-1/Wnt-3a cells entered into G2 phase and the proliferation rate of the Rat-1/ Wnt-3a cells increased significantly compared to the non-transfected cells. Though the migration of Rat-1/Wnt-3a cells increased slightly by the method of Transwell migration assay, there was no statistic significance compared to the non-transfected cells. The result of in vitro scrape wound healing assay showed that for Rat-1/Wnt-3a cells the time course of wound healing decreased significantly. It is therefore concluded that the activation of Wnt signaling pathway can regulate some of the phenotypes of Rat-1 cells, facilitate cell proliferation and promote the scrape wound healing in vitro.
Key words: Wnt-3a; fibroblasts; cell proliferation; cell migrationReceived 2005-01-24 Accepted 2005-04-19
This work was supported by the Excellent Ph.D Dissertation Cultivating Fund, Shanghai Medical college, Fudan University
(No. 021101013).
*Corresponding author. Tel: +86-21-54237311, E-mail:
jzuo@shmu.edu.cn
由Wnt蛋白及其受体frizzled介导的信号通路是无脊椎动物和脊椎动物发育过程中起关键作用的一 个信号转导途径[1,2]。正常情况下，在APC、GSK3β、Axin等的调节下，胞浆内游离的β-连环蛋白处于平衡状态；在Wnt信号转导过程中，Wnt蛋白与其 受体frizzled结合后，激活dvl，使GSK3β的活性受到抑制， 游离β-catenin水平升高，与其下游信号分子Tcf/Lef结合，进入细胞核，发挥转录因子功能[3]。
最近的研究表明，该信号通路还参与肿瘤的发生以及组织损伤后的愈合等病理生理学过程 [4,5]。而细胞的增殖和迁移特性与上述的过度增生以及再生 过程关系极为密切。本研究小组前期的组织水平实验结果表明，在大鼠急性心梗后心肌组织的愈合过 程中，Wnt信号通路被激活，其下游信号分子dvl-1及β-catenin蛋白水平升高 [6,7]。为了在体外验证该信号通路在心肌梗死愈合过程中的作用及其调控机 制，本研究以大鼠成纤维细胞系Rat-1为材料，通过构建Wnt-1组成员Wnt-3α的真核表达载体并进行 稳定转染，构建Wnt信号通路持续激活的细胞模型，进一步阐明该通路在真核生物成纤维细胞中的 作用机制及其特异性的细胞生物学效应，期望为急性心梗发生发展的病理生理变化以及如何促进心肌 损伤的修复等方面的应用研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 Wnt-3a 真核表达载体的构建 pBlue-Wnt-3a 质粒由Dr. Roelink (Washing University) 馈赠，pcDNA3.1/myc真核表达质粒由复旦大学李泽娟博士馈赠。主要试剂：带有 EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的Wnt-3a的PCR扩增引物，sense：5’ CCGGAATTCATGGCTCCTC TCGGATACCT3’antisense：5’CGCGG ATCCCTTG CAGGTGTGCACGTCATA3’(以上引物由上海生工生物工程公司合成)扩增产物的片段为 1 076 bp; Taq DNA聚合酶；10×PCR反应缓冲液 DNA Ladder；4×dNTPs (上海生工生物工程公司); BamHⅠ限制性内切酶及反应缓冲液；EcoR Ⅰ限制性内切酶及反应缓冲液(华美生物工程公司); T4 DNA 连接酶及缓冲液(Promega公司)。
用上述PCR引物以pBlue-Wnt-3a 质粒为模板，进行Wnt-3a cDNA片段的扩增，扩增产物与pcDNA3.1/myc载体同时进行 EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切产物的回收，依照DNA回收试剂盒步骤进行，回收产物经 T4 DNA 连接酶进行连接反应，连接产物常规转化感受态细菌，挑取阳性克隆 提取质粒, 经BamHⅠ，EcoRⅠ双酶切鉴定及DNA测序鉴定，得到Wnt-3a和c-myc融合蛋白的真核 表达质粒。
1.2 过表达Wnt-3a细胞克隆的构建及鉴定
大鼠成纤维细胞系Rat-1由中国科学院黄传新博士馈赠。Rat-1细胞培养至1× 105个，用脂质体Lipo-fectamineTM 2000 (Invitrogen 公司) 进行pcDNA 3.1-Wnt-3a的真核表达质粒的转染，分未转染组、转染pcDNA3.1空质粒组和转染pcDNA3.1-Wnt-3a 组。转染过程参照LipofectamineTM 2000试剂盒说明书进行。G418浓度为400 mg/ml，筛选3个星期之后，挑选阳性细胞克隆，扩大培养，并以该G418 浓度维持筛选，备鉴定。
用Western blot和免疫荧光方法鉴定Wnt-3a稳转细胞株的建立。
1.2.1 Western blot 稳定转染细胞与正常对照细胞无血清培养24 h后，取上清2 ml，经Centricon超虑管(购自美国Amicon公司)离心浓缩，一抗为抗 c-myc单克隆抗体(购自美国Invitriogen公司)浓度为1∶2 000，4℃过夜。二抗辣根过氧化物酶耦联抗小鼠IgG浓度为1∶500，室温1 h，于ECL系统检测。
1.2.2 免疫荧光 一抗为1∶200稀释的b-catenin(购自Santa Craz公司), 二抗为1∶50稀释的FITC- 标记兔抗山羊IgG (购自ImmunoResearch 公司)，在荧光显微镜下观察，拍照。
1.3 细胞形态学观察 光学显微镜下观察转染细胞和正常Rat-1细胞的形态学改变并拍照。
1.4 细胞增殖率的MTT检测 转染细胞和正常细胞(1×10 5个/ml)，接种细胞于24孔培养板中，100 μl/孔，三复孔，分别培养6、12、24、36、48、72 h，酶标仪上570 nm处测定OD值。
1.5 流式细胞仪(FCM)检测进行细胞周期分析 转染细胞和正常细胞，0.5% PI染色，FACS 流式细胞仪(美国BD公司)检测(波长480 nm)。
1.6 细胞迁移实验 迁移实验在Transwell小室(Costar公司)中进行，首先在Transwell的下室中加入600 μl含10％胎牛血清的DMEM, 在上室内加入100 μl不含胎牛血清的DMEM，把Transwell小室放入37℃孵育1 h。加入收获的细胞悬液20 μl(调整细胞浓度为1×105个/ml)，每组3个复孔。37℃ 培养12 h后取出滤膜，甲醇固定，常规HE染色。显微镜下计数迁移至滤膜外表面的细胞数，每张滤 膜随机取5个视野(×200)取均值，三次独立实验。
1.7 体外划痕实验 取传代48 h长势良好的细胞制备单细胞悬液，按2 ×106 个细胞每孔将细胞加入6孔板，于5% CO2培养箱内37℃孵育12 h后，用无菌200 μl tip头垂直划出一无细胞的细痕，制作培养细胞伤口模型。相差显微镜下测微器测量伤口宽 度，此时作为划痕后零时，以后分别继续培养6、12、24、36 h后测定一次，至划痕创面基本愈合。每组设3复孔，三次独立实验。
1.8 统计学处理 以mean ± SD表示，采用总体均数的假设检验(t检验)比较转染组与非转染组的 差异，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 Wnt-3a 真核表达载体的构建
pcDNA3.1-Wnt-3a的真核表达质粒经EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切鉴定，可切出长1 046 bp的目的片段以及5 kb左右的pcDNA3.1骨架片段，表明Wnt-3a cDNA已经被克隆于载体中。直接以pcDNA3.1/Wnt-3a为模板进行测序，经计算机分析，与已知小 鼠Wnt-3a cDNA序列相符，测序结果图略。
2.2 过表达Wnt-3a细胞阳性克隆的筛选与鉴定
转染pcDNA3.1空质粒组和转染pcDNA3.1-Wnt-3a组的细胞在G418 400 μg/ml筛选压力下，开始呈克隆状生长，而未转染的Rat-1细胞在G418 400 μg/ml筛选压力下全部死亡。分别挑取15个转染pcDNA3.1空 质粒组和转染pcDNA3.1-Wnt-3a组的阳性克隆备用鉴定。
2.1.1 Western blot结果 在挑选的转染pcDNA3.1-Wnt-3a组的阳性克隆中，7＃和11＃克隆上清液中有一条约40 kDa的特异性条带，表明在该两个细胞克隆上清液中检测到了c-myc 标记的Wnt-3a蛋白； 而未转染Rat-1细胞及转染pcDNA3.1空质粒的对照细胞则无此条带(图1)。该结果证实Wnt-3a cDNA的成功转染。
2.1.2 b-catenin免疫荧光及Western blot检测结果 免疫荧光检测结果表明与正常未转染Rat-1 细胞及转染了pcDNA3.1空质粒的对照细胞比较，转染真核表达质粒pcDNA3.1-Wnt-3a 的Rat-1 细胞，其β-catenin胞质荧光亮度明显增强，表明转染细胞胞浆中β-catenin蛋白水平明显升高(图2); Western blot检测结果亦发现Rat-1/Wnt-3a细胞β-catenin蛋白水平升高(图3)，进一步证实稳转细胞株过表达Wnt- 3a，并使得下游信号分子β-catenin在胞浆中的游离水平增加，因此Wnt信号通路持续激活的细胞模型 成功构建。
2.3 Wnt信号通路持续激活时，Rat-1细胞形态发生改变
光镜下见，细胞长度增加，具折光性以及呈绳索状的成束 密集排布(图4)。
2.4 Wnt信号通路激活对细胞增殖率的影响
MTT法检测细胞的增殖率结果显示，Wnt信号通路持续激活细胞株细胞增殖率明显高于正常对照 细胞(图5)。
2.5 Wnt信号通路激活后细胞周期分析结果
与未转染Rat-1细胞相比较，Wnt-3a转染组细胞G0 /G1期比例降低，G2/M期比例升高，可见Wnt 信号通路被激活之后进入G2期的细胞增多，细胞 增殖分裂能力增强(表1)。
2.6 Wnt信号通路激活对细胞迁移能力的影响
未经转染的对照组血清刺激后迁移至滤膜外表面的Rat-1细胞数目为32.35 ±3.26，经稳定转染的Wnt信号通路持续激活组Rat-1细胞血清刺激后迁移 至滤膜外表面的细胞数目为38.3±4.89，可见转染组细胞的细胞迁移率略高于对照组细胞，但两组比 较差异无显著性(P>0.05)。
2.7 Wnt信号通路激活对细胞体外伤口愈合能力的影响
培养的正常Rat-1细胞中划痕形成的伤口闭合时间明显长于转染组细胞，在划痕后12、24和36 h内，Rat-1细胞的愈合距离明显少于Wnt-3a/Rat-1细胞。划痕后6 h愈合距离无显著性差异，12、24 h愈合距离差异显著，划痕后36 h，Wnt-3a/Rat-1细胞划痕伤口已基本愈合，而正常Rat-1细胞只愈合了约80％(表2)。
3 讨论
Wnt基因家族编码了一组富含半胱氨酸的糖基化蛋白质，属于分泌型生长因子 [8]。由Wnt蛋白及其受体frizzled介导的信号通路不仅在无脊椎动物 和脊椎动物的发育过程中起到关键的作用，而且该通路的功能障碍还与肿瘤及阿尔茨海默病的发病有 关[9]。
最近，Labus等还发现在外伤所致的创口愈合过程中Wnt蛋白的表达，显示它可能参与了创伤的 修复过程[5]。而心肌组织在发生急性梗死后，也有 一个创伤的愈合修复过程，成纤维样细胞的增殖和迁移在心梗后梗死区域愈合过程中的作用举足轻重[8]。本实验室的前期实验结果表明，在心肌梗死 区和梗死边缘区的成纤维细胞中Wnt信号通路的信号分子dvl-1及 β-catenin在胞浆中的蛋白水平升高[6,7]。为阐明调控成纤维细胞在该病理生理过程中所表现的细胞生物学行为的分子机制，我们在体外用大鼠成纤维细胞系Rat-1作为实验材料，初步探 讨Wnt信号通路对成纤维细胞的细胞生物学行为的调控机制。
本研究通过稳定转染Wnt-3a cDNA使得Rat-1细胞过表达Wnt-3a分子，并且在转染细胞的上清液中 成功检测到Wnt-3a的分泌型蛋白，成功模拟了细胞中Wnt信号通路持续激活的状态，为研究该信号通 路对细胞行为的调控作用提供了良好的体外模型。初步的实验结果表明，在过表达Wnt-3a的细胞胞浆 中游离的β-catenin蛋白明显积聚，进一步证实了Wnt-3a对其下游信号分子的激活作用。
经稳定转染Wnt-3a的细胞首先在光镜下观察，发现细胞形态发生了一定的改变，表现为细胞长度 的增加，具折光性以及呈绳索状的成束密集排布，且细胞饱和密度有所增加。对细胞增殖能力的改变 进行的MTT实验以及流式细胞仪检测结果均表明，转染细胞的增殖率显著增强，该结果和Young等 [10]的研究结果相似，他们发现和Wnt-3a同为Wnt-1组 的Wnt-1蛋白过表达能够刺激Rat-1细胞的生长，表现为非血清依赖性的细胞增殖。然而也有不同的观 点，日本Toyofuku等[11]的研究发现，用含有Wnt- 3a蛋白的条件培养液培养新生大鼠的心肌细胞和成纤维细胞，并不能诱导二者的增殖，只是使得心肌 细胞在有成纤维细胞存在的情况下发生聚集。因此，尽管Wnt-1和Wnt-3a皆通过经典途径发挥作用，但对于不同组织来源的细胞增殖率的调控，可能具有不同的分子机制，有待于深入探讨。
Transwell小室对细胞迁移能力的检测结果表明Wnt信号通路激活后Rat-1细胞在血清刺激下其迁移 能力虽略有升高，但经统计学分析，与未转染组细胞相比无显著性差异。然而体外划痕实验结果却表 明，Wnt信号通路被激活后，细胞的损伤修复能力明显提高，损伤愈合时间明显缩短。当然细胞的损伤修复过程既牵涉到细胞增殖又牵涉到细胞迁移， 因此以上结果并不矛盾，可能在对细胞损伤修复能力的贡献中，细胞增殖起到更关键的作用。另外也 有研究表明，Wnt-3a能够抑制啮齿类纤维母细胞的凋亡 [12]，因此也有利于损伤的修复。
本研究结果提示，在体外Wnt信号通路的激活能够促进成纤维细胞的增殖以及损伤修复，该结果 不难使人联想到如果通过控制该信号通路在体内的激活，就可能会对心梗后梗死区组织的损伤愈合起到积极的促进作用。当然，这样的推测还需要进一步在体的实验来证实。
参 考 文 献
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